DB12T 651-2016 轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆GTS40-3-2及其衍生品種定量檢測 實時熒光PCR方法

B23DB12Detectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—QuanlitativePCRmethodforherbicide-resistantso天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、天轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆GTS40-3-2及其衍生品種定量檢測實時熒光PCR方法本標(biāo)準(zhǔn)適用于轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆GTS40-3下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求Lectin基因LectingeneGTS40-3-2轉(zhuǎn)化體特異性序列event-specificsequ進行實時熒光PCR擴增。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品模板拷貝lec-1269P：5,-AGCTTCGCCGCTTCCGTS40-3-2F：5'-CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGGGTS40-3-2R：5'-GACTTGTCGCCGGGAATG準(zhǔn)物質(zhì)基因組DNA，用0.1×TE或水稀釋5.3.6.1標(biāo)準(zhǔn)樣品和試樣實時熒光P3然后取出PCR管，放入PCR儀中。運行實時熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95℃變—2.0μL2.0μL—25.0μL表2Lectin內(nèi)標(biāo)基因PCR反應(yīng)體系—0.5μL0.5μL0.5μL2.0μL—25.0μL應(yīng)設(shè)置陰性對照和空白對照。以非轉(zhuǎn)基因大豆材料提取的DNA作為GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體特異情況進行調(diào)整。設(shè)定閾值處，要求不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線平行，而且同一樣品的不同平45.3.7.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線x+b(1yb—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。以進行結(jié)果計算。否則重新進行實時熒光PCR擴增。y-bn—模板拷貝數(shù)a—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。nLectin—大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin拷貝數(shù)。的Ct值<36，表明樣品中檢出耐除草劑大豆GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體。表述為“樣品中檢測出GTS40-3-2轉(zhuǎn)曲線，表明樣品中未檢出耐除草劑大豆GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體。表述為“樣品中未檢測出GTS40-3-2轉(zhuǎn)化判斷；如重復(fù)實驗GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)典GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體，表述為“樣品中檢測出GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體”。驗。如重復(fù)實驗結(jié)果符合6.1-6.4的情況，依照6.1-6.4進行判斷；如重復(fù)實驗Lectin內(nèi)標(biāo)基因和A.1Lectin基因?qū)崟r熒光PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列（AccCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCA1GCCCTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCATCTGGCCTTTCCGGAACCGTCCGCATTCCCGGC