《子宮頸癌PD-L1免疫組織化學檢測規(guī)范》（征求意見稿）

T/CRHAXXX-202X子宮頸癌PD-L1免疫組織化學檢測規(guī)范本文件規(guī)定了子宮頸癌PD-L1免疫組織化學檢測的適用人群、免疫組織化學檢測、質控要求、報告模板。本文件適用于各級醫(yī)療機構病理醫(yī)務人員進行子宮頸癌PD-L1免疫組織化學檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T40352人類組織樣本采集與處理CNAS-CL02-A007：2018醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在組織病理學檢查領域的應用說明3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1子宮頸癌cervicalcancer發(fā)生在子宮頸部位的惡性上皮性腫瘤，通常與人乳頭瘤病毒（HPV）感染相關。3.2程序性死亡配體-1programmeddeath-Ligand1，PD-L1PD-L1是程序性死亡配體-1，是一種膜表面蛋白，通常在癌細胞和某些免疫細胞上表達。通過與免疫細胞上的PD-1受體結合，PD-L1可以抑制免疫細胞的活性，從而幫助腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。3.3免疫檢查點抑制劑immunecheckpointinhibitors一類靶向免疫檢查點的藥物，通過解除免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的免疫抑制，從而增強免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊力。PD-1/PD-L1抑制劑就是其中一類免疫檢查點抑制劑。3.4免疫組織化學immunohistochemistry，IHC一種檢測組織中特定抗原的方法，通過使用抗原特異性的抗體和適當?shù)娜旧椒?，可以在組織切片上定位和可視化特定蛋白質。3.5伴隨診斷adiointdiagnostic2T/CRHAXXX-202X利用特定的檢測方法，如分子技術、免疫組化染色等檢測與特定藥物相關聯(lián)的基因改變及蛋白表達情況，來提供給患者對某種特定治療方法的反應信息，有助于確定患者是否可以從該藥物中獲益。3.6伴隨診斷試劑adiointdiagnosticreagent藥物在臨床使用時提示患者使用相應藥物安全有效性的體外診斷試劑，醫(yī)生可根據(jù)伴隨診斷試劑所給出的結果進行臨床治療方案的調整及預后評價3.7綜合陽性評分combinedpositivescore，CPS評估PD-L1表達水平的一種評分方法，結合了PD-L1陽性腫瘤細胞、相關免疫細胞和其他細胞（詳見附錄）的數(shù)量，用于預測患者對PD-1/PD-L1抑制劑治療的反應。3.8一抗primaryantibody特異性結合到目標抗原的抗體，常用于免疫組織化學、免疫熒光等實驗。3.9二抗secondaryantibody結合到一抗的抗體，通常帶有熒光或酶標記，用于檢測和放大信號，從而實現(xiàn)目標抗原的可視化。3.10克隆號clonenumber用來標示單克隆抗體的抗原表位的,標示篩選這個抗體來源的細胞株。4縮略語下列縮略語適用于本文件。H&E染色法——蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosinStaining)ORR——客觀緩解率（Objectiveresponserate）MICs——細胞質染色的單核炎癥細胞（Cytoplasmicstainingofmononuclearinflammatorycells）NMPA——國家藥品監(jiān)督管理局（NationalMedicalProductsAdministration）FDA——美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S.FoodandDrugAdministration）NCCN——美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（NationalComprehensiveCancerNetwork）FFPE——福爾馬林固定的石蠟包埋樣本（FormalinFixationandParaffinEmbedding）5子宮頸癌免疫監(jiān)查點抑制劑的適用人群PD-L1檢測的人群以藥物獲批的適應癥目標人群為主。如，帕博利珠單抗pembrolizumab(Keytruda)聯(lián)合化療，聯(lián)合或不聯(lián)合貝伐單抗，用于治療持續(xù)性、復發(fā)性或轉移性子宮頸癌；賽帕利單抗適用于接受過一線或以上含鉑標準化療后進展的復發(fā)或轉移、PD-L1表達陽性（CPS≥1）子宮頸癌。注：雖然臨床用藥前對PD-L1檢測的適用人群有一定規(guī)定，但是在病理臨床實踐中，有時不能判斷或不能及時知曉其用藥選擇，因此，建議在兼顧檢測成本、臨床送檢需求與實際操作的前提下，盡量為所有可能具有免疫治療機會的子宮頸癌患者提供PD-L1免疫組化檢測結果。3T/CRHAXXX-202X6子宮頸癌PD-L1免疫組織化學檢測6.1樣本類型首選手術切除標本，切除標本不可及的情況下，可選擇活檢的組織學標本，由于子宮頸癌PD-L1的表達采用CPS評分，免疫細胞的計數(shù)相對復雜，不推薦使用細胞包埋蠟塊進行檢測。6.2樣本前處理要求6.2.1樣本選擇及處理新鮮活檢或手術樣本組織，樣本處理應符合GB/T40352的要求，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，參照《臨床技術操作規(guī)范-病理學分冊》取材、固定、脫水、石蠟包埋并制成蠟塊。6.2.2組織切片操作方法組織切片厚度建議4μm。將切片黏附在聚賴氨酸載玻片或帶正電荷的玻片上，在空氣中略干燥后，60°C～65°C烤片2小時，2～8℃或25±2℃存放待用。為了防止抗原降解，準備好的組織切片應盡快使用。如需保存，2～8℃條件下保存的切片，需在16周內完成檢測；25±2℃條件下保存的切片，應在4周內完成檢測。注：研究顯示3個月的樣本PD-L1陽性率為31.2%；≥3個月至1年的陽性率為32.8%，1～3年為29.1%3年為13.3%(n=83)，盡量選擇3年以內的蠟塊進行檢測。對于復發(fā)和轉移的患者，如無法取得近期的組織進行檢測，可考慮三年內的樣本。6.3免疫組化檢測6.4子宮頸癌PD-L1表達的判讀標準6.4.1判讀要求應由具有資質的病理醫(yī)生使用光學顯微鏡對PD-L1染色結果進行評估。在檢查用于PD-L1染色的患者標本之前，檢查用于評估染色質量的對照非常重要。建議選擇3張連續(xù)組織切片（H&E、PD-L1染色和空白對照染色）進行PD-L1染色評估。首先對H&E切片進行樣本可使用性評估,如通過，則剩余2個連續(xù)切片的IHC染色是可接受的。6.4.2樣本可用性評估確認至少有100個可計數(shù)腫瘤細胞，建議使用H&E染色切片評估標本是否足夠可用。應對標本同一石蠟塊的連續(xù)切片進行PD-L1免疫組化和H&E染色。PD-L1染色切片中必須存在至少100個可計數(shù)腫瘤細胞，以確保標本足夠用于PD-L1評估。如可計數(shù)腫瘤細胞少于100個的樣本，建議選用同一蠟塊的深切切片或另一蠟塊的組織切片，確保有足夠數(shù)量的可計數(shù)腫瘤細胞用于PD-L1免疫組化染色評估。6.4.3子宮頸癌PD-L1染色強度，陽性和陰性對照組織陽性及陰性對照可采用組織樣本或細胞系對照切片。1）使用組織樣本評估整體染色強度，如圖1所示：4T/CRHAXXX-202X1+/弱陽只在40×物鏡下可見清晰細胞膜染色2+/中陽4-5×物鏡下可見，10-20×物鏡下可見清晰細胞膜染色3+/強陽4-5×物鏡下可見清晰細胞膜染色ABACDC圖1PD-L1（克隆號：WD160）在子宮頸癌樣本中的染色強度評估，其中：A:無腫瘤細胞染色（20X放大）；B：1+腫瘤細胞PD-L1染色（20X放大）；C：2+腫瘤細胞PD-L1染色（20X放大，如箭頭所示D：3+腫瘤細胞PD-L1染色（20X放大，如箭頭所示）。2）使用細胞系對照切片評估，如圖2、圖3所示：檢查PD-L1IHC22C3pharmDx細胞系對照切片，確定試劑是否正常發(fā)揮作用。每個切片含有PD-L1表達呈陽性和陰性的細胞團塊切片。評估陽性細胞的百分比和染色強度。如果細胞系對照切片的染色不理想，則患者標本的所有結果均應視為無效。對于PD-L1陽性細胞團塊，以下染色可接受（見圖2）：①≥70%的細胞呈細胞膜染色；②平均染色強度≥2+；③非特異性染色強度<1+。圖2PD-L1（克隆號22C3）陽性對照細胞團塊對于PD-L1陰性細胞團塊，以下染色可接受（見圖3）：①多數(shù)細胞應顯示無染色。注：細胞膜明顯染色的細胞≤10個即視為可接受；②非特異5T/CRHAXXX-202X圖3PD-L1（克隆號22C3）陰性對照細胞團塊FFPE的扁桃體可作為對照標本。PD-L1染色的扁桃體隱窩上皮細胞膜表現(xiàn)為強染色；生發(fā)中心的巨噬細胞表現(xiàn)為中等到弱的膜染色（見圖4），血管內皮細胞、纖維細胞和表面鱗狀上皮細胞無染色。FFPE的胎盤組織可作為對照樣本。PD-L1染色的胎盤組織滋養(yǎng)層細胞膜：細胞膜呈很強的一致性染色；胎盤間質組織和脈管系統(tǒng)沒有染色（見圖5）。圖4PD-L1（克隆號：WD160）染色的扁桃體（20X放大）間質細胞無染間質細胞無染圖5PD-L1（克隆號：WD160）染色的胎盤組織（20X放大）4）空白對照抗體試劑6T/CRHAXXX-202X檢查空白對照抗體試劑染色的切片，確定可能干擾PD-L1染色判讀、使標本無法評估的非特異性背景染色。無染色表明對照合格。檢查空白對照抗體試劑染色的患者標本，確定是否存在可能干擾PD-L1染色切片判讀的任何非特異性染色。6.4.4子宮頸癌PD-L1判讀方法子宮頸癌中PD-L1蛋白的表達水平采用CPS來確定，即PD-L1陽性細胞與可計數(shù)腫瘤細胞的比例乘以100，其中納入評分的PD-L1陽性細1）任何強度下具有完整或部分細胞膜染色的腫瘤，但僅有細胞質染色的腫瘤細胞不納入評2）任何強度下位于腫瘤巢內或相鄰的基質內直接與腫瘤反應相關的細胞膜染色和/或細胞質染色的淋巴細胞和巨噬細胞。其他的CPS評分公式納入/排除的標準見附錄C表1和表2。3）腫瘤異質性樣本的判讀見附錄D。6.4.5子宮頸癌PD-L1檢測規(guī)范化報告模板子宮頸癌PD-L1檢測報告除患者基本信息，還應包括樣本類型、試劑克隆號，質控結果、檢查測結果等。見附錄E7子宮頸癌PD-L1檢測的質控要求為保障子宮頸癌PD-L1檢測結果的準確性，實驗室質量管理應符合CNAS-CL02-A007：2018的要求。7.1室內質控室內質控應滿足以下要求：1）確保檢驗試劑和方法的正確性，采用的試劑符合NMPA及相關法規(guī)要求，且在用于臨床診斷前，對試劑和檢測方法進行充分的驗證，保證結果的準確性和可重復性。室內質控應設置陽性和陰性對照。2）可采用已知PD-L1表達結果的樣本（最好兼具高表達（CPS≥10）、中表達（CPS1-10）、及低表達CPS＜1）。3）陽性對照樣本可以是扁桃體（隱窩上皮細胞膜表現(xiàn)為強染色，生發(fā)中心的巨噬細胞表現(xiàn)為中等到弱的胞膜染色，血管內皮細胞、纖維細胞和表面鱗狀上皮細胞無染色。）和胎盤組織（滋養(yǎng)層細胞膜很強的一致性染色，胎盤間質組織和血管內皮細胞無染色）。4）應進行PD-L1抗體不同克隆號和染色平臺的比對，對不同操作人員進行定期抽檢。規(guī)范進行實驗記錄，可溯源，同時對操作和判讀人員進行定期培訓和考核。7.2室間質評進行子宮頸癌PD-L1檢測的實驗室每年應至少參加2次室間質評，既可以通過參加國內外權威機構舉辦的室間質評活動完成，也可以通過與其他獲得相應資格認可和使用相同方法學的實驗室進行比對完成。7T/CRHAXXX-202X（資料性）免疫組織化學染色操作流程（手工染色）A.1檢驗所需儀器、設備a)移液器；b)免疫組化油筆；c)電磁爐或高壓鍋（也可使用自動抗原修復儀）；d)孵箱；f)孵育盒；g)染色架；h)蓋玻片；j)洗瓶。A.2溶液配制PBST磷酸鹽緩沖液（0.01M，0.05%Tween-20，pH7.4）、免疫組化抗原修復緩沖液以及DAB顯色液的配制參見各產(chǎn)品說明書。A.4檢測步驟將福爾馬林固定石蠟包埋切片于60℃~65℃孵箱中烤片1～2小時，室溫保存?zhèn)溆?。a)石蠟切片置于新鮮二甲苯中，浸泡10分鐘×2次；b)去除多余的液體后，置無水乙醇中，浸泡3分鐘，1～2次；c)去除多余的液體后，置95%乙醇中，浸泡3分鐘；d)去除多余的液體后，置85%乙醇中，浸泡3分鐘；e)去除多余的液體后，置70%乙醇中，浸泡3分鐘；——推薦使用pH9.0EDTA熱修復法，水浴可設置98。C高溫修復20～30分鐘；——若使用高壓修復法，建議修復2～3分鐘（高壓閥門頂起時開始計時），完成修復后，讓切片自然冷卻至室溫；——用免疫組化油筆將待測組織圈起來，純化水沖洗2次，每次3分鐘。滴適量（約150μL）內源性過氧化物酶阻斷劑完全覆蓋組織，室溫孵育10分鐘后，純化8T/CRHAXXX-202X加入1～3滴（50-150ul）PD-L1抗體試劑或空白對照抗體試劑完全覆蓋組織，室溫孵育30分鐘后，PBST沖洗3次，每次5分鐘。被檢切片依照所用染色系統(tǒng)DAB染色液試劑盒的說明書進行孵育，完畢后PBST沖洗3次，每次5分鐘，純化水沖洗2次，每次3分鐘。依照所用試劑說明書進行DAB顯色液配制，滴適量配制好的DAB顯色液完全覆蓋組織，依據(jù)顏色變化終止染色，純化水沖洗3次（必要條件下可使用DAB增強液染色）。依照蘇木素廠家說明書操作步驟及建議對切片進行襯染，PBST或依次浸泡梯度酒精70%，85%，95%，100%（1～2次），每次3分鐘；2次二甲苯透明，用中性樹膠對切片進行封片。T/CRHAXXX-202X（資料性）CPS評分公式納入/排除的標準B.1表1CPS評分公式分子納入/排除標準-與潰瘍有關的MICs(包括淋無B.2表2：CPS評分公式分母納入/排除標準無無T/CRHAXXX-202X（資料性）腫瘤異質性樣本的判讀腫瘤異質性樣本的判讀，可按照以下方法進行：1）較低放大倍數(shù)下（4倍）：目測將腫瘤區(qū)域劃分為細胞數(shù)量接近的若干部分（見圖C.1）圖C.1低倍鏡下，將腫瘤區(qū)域劃分為細胞數(shù)量接近的幾部分2)在更高的放大倍數(shù)（20倍）下：觀察每個區(qū)域和評估存活的腫瘤細胞和PD-L1染色細胞（腫瘤細胞、淋巴細胞、巨噬細胞）的總數(shù)。計算每個地區(qū)的綜合陽性分數(shù)（見圖C.2）圖C.2在更高的放大倍數(shù)（20倍）下：觀察每個區(qū)域和評估存活的腫瘤細胞和PD-L1染色細胞（腫瘤細胞、淋巴細胞、巨噬細胞）的總數(shù)。如圖所示四個區(qū)域有~80、~30、~50和~100個PD-L1染色細胞（腫瘤細胞、淋巴細胞、巨噬細胞）。每個切片有100個腫瘤細胞（包括PD-L1染色細胞）。每個區(qū)域的CPS：~CPS80、~CPS30、~CPS50和~CPS100。計算整個腫瘤區(qū)域的綜合陽性評分（CPS）：（80+30+50+100）/4=~CPS65。T/CRHAXXX-202X（資料性）子宮頸癌PD-L1檢測規(guī)范化報告模板圖子宮頸癌PD-L1檢測報告模板T/CRHAXXX-202X參考文獻[1]NCCNGuidelinesVersion1.2023CervicalCancer.[2]中華醫(yī)學會婦科腫瘤學分會．婦科腫瘤免疫檢查點抑制劑臨床應用指南.協(xié)和醫(yī)學雜志，2021:12(6):854—880.[3]PD-L1IHC22C3pharmDxInterpretationManual–CervicalCancer.FDA-approvedforinvitrodiagnosticuse.[4]FDAapprovespembrolizumabcombinationforthefirst-linetreatmentofcervicalcancer.FDA.UpdatedOctober13,2021.AccessedDecember1,2021.https://bit.ly/3G5r6yd[5]ColomboN,DubotC,LorussoD,etal;KEYNOTE-826Investigators.Pembrolizumabforpersistent,recurrent,ormetastaticcervicalcancer.NEnglJMed.2021;385(20):1856-1867.doi:10.1056/NEJMoa2112435[6]/immuno22hybrid/attendee/confcal/show/session/33(79P-EfficacyandSafetyofZimberelimab(GLS-010)MonotherapyinPatientswithRecurrentorMetastaticCervicalCancer:AMulticenter,Open-Label,