2.2動物細胞工程課件高二下學期生物人教版選擇性必修3

第2章第2節(jié)

動物細胞工程

-動物細胞培養(yǎng)

動物細胞工程的發(fā)展歷程1907年，哈里森用一滴淋巴液成功培養(yǎng)了蝌蚪的神經(jīng)元，首創(chuàng)了動物組織體外培養(yǎng)法。1951年，張明覺等發(fā)現(xiàn)了哺乳動物精子獲能現(xiàn)象。1959年，試管家兔誕生。之后，多種試管動物相繼出生。1958年，格登用非洲爪蟾進行體細胞核實驗，同期，我國科學家童第周開展了魚類細胞核移植工作。1975年，米爾斯坦和科勒等創(chuàng)立了單克隆抗體技術。1978年，小鼠的桑椹胚被成功分割。次年，科學家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊1981年，埃文斯等成功分離和培養(yǎng)了小鼠的胚胎干細胞2006年，山中伸彌等獲得了誘導多能干細胞。我國科學家用這種細胞培育了小鼠。2014年，世界上第一個用單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國誕生。2017年，我國科學家首次培育了體細胞克隆猴。P33動物細胞工程動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合動物細胞核移植是動物細胞工程的基礎從社會中來在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產(chǎn)生免疫排斥反應。那么，怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個細胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚？通過細胞培養(yǎng)構建人造皮膚P43概念：從動物體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后在適宜的培養(yǎng)條件下，讓這些細胞生長和增殖的技術。一、動物細胞培養(yǎng)原理：細胞增殖培育的終點：細胞目錄Contents1動物細胞培養(yǎng)的條件2動物細胞培養(yǎng)的過程3干細胞培養(yǎng)及其應用1動物細胞培養(yǎng)的條件動物細胞培養(yǎng)的條件營養(yǎng)物質其他條件<<糖類氨基酸無機鹽維生素無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環(huán)境1動物細胞培養(yǎng)的條件營養(yǎng)葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等合成培養(yǎng)基（將細胞所需的營養(yǎng)物質按種類和所需量嚴格配制而成的培養(yǎng)基）一般使用液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）含有多種未知的促細胞生長因子及其他活性物質天然成分P441動物細胞培養(yǎng)的條件無菌、無毒的環(huán)境無菌①對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行滅菌處理②在無菌環(huán)境下進行操作定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝物無毒超凈工作臺1動物細胞培養(yǎng)的條件適宜的溫度、pH和滲透壓哺乳動物多以（36.5±0.5）℃溫度：pH：多數(shù)細胞生存的適宜pH在7.2-7.4滲透壓：需要考慮的一個重要環(huán)境參數(shù)氣體環(huán)境O2:細胞代謝所必需的CO2：維持培養(yǎng)液的pH（95%空氣和5%CO2

）CO2培養(yǎng)箱微生物培養(yǎng)中的作用不同（為自養(yǎng)型微生物提供碳源）2動物細胞培養(yǎng)的過程動物組織塊用機械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理分散成單個細胞制成細胞懸液(用培養(yǎng)液）原代培養(yǎng)問題細胞分裂受阻（為什么？）懸浮生長的細胞貼壁生長的細胞密度過大、有害代謝物積累和營養(yǎng)物質缺乏等接觸抑制解決傳代培養(yǎng)分瓶2動物細胞培養(yǎng)的過程細胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上。培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于貼附。培養(yǎng)皿培養(yǎng)瓶2動物細胞培養(yǎng)的過程

瓶壁上的細胞層數(shù)是：一層（或單層）貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞通常會停止分裂增殖。接觸抑制分瓶培養(yǎng)解除方法癌變細胞沒有接觸抑制現(xiàn)象，可以在培養(yǎng)瓶中形成多層細胞2動物細胞培養(yǎng)的過程將分瓶之前的細胞培養(yǎng)，即動物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。將分瓶后的細胞培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng):在進行傳代培養(yǎng)時，懸浮培養(yǎng)的細胞直接用離心法收集；貼壁細胞需要重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細胞，然后再用離心法收集。之后，將收集的細胞制成細胞懸液，分瓶培養(yǎng)。2動物細胞培養(yǎng)的過程【思考1】幼齡動物的細胞和老齡動物的細胞，哪個更易于培養(yǎng)？為什么？幼齡。因為其分化程度低，分裂能力強。2動物細胞培養(yǎng)的過程【思考2】用胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理組織塊，使組織塊分散成單個細胞的目的是什么？①使細胞與培養(yǎng)液充分接觸，一方面保證細胞所需的O2和營養(yǎng)物質的供應，另一方面保證細胞內代謝廢物的及時排出；②使得在細胞水平操作的其它技術得以實現(xiàn)。2動物細胞培養(yǎng)的過程【思考3】用胰蛋白酶分散細胞，由此可說明細胞間的物質主要是什么成分？【思考4】胰蛋白酶能將細胞消化掉嗎？那將動物組織分散成單個細胞時要注意什么問題呢？主要是蛋白質(膠原蛋白等)。能，應注意時間的控制。因為胰蛋白酶不僅能分解細胞間的蛋白質，長時間還會分解膜蛋白，對細胞造成損傷?！舅伎?】能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？不能，因為動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。2動物細胞培養(yǎng)的過程【思考6】整個過程中用胰蛋白酶處理幾次？作用分別是？第一次處理的目的是使組織細胞分散開；第二次處理的目的是使細胞從瓶壁上脫離下來，便于分瓶后繼續(xù)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)視頻演示傳代培養(yǎng)視頻演示1.幼齡動物的細胞與老齡動物的細胞比較，分化程度低的細胞與分化程度高的細胞比較，哪些細胞更易于培養(yǎng)？為什么？細胞的增殖能力與供體的年齡有關，幼齡動物的細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物的細胞則相反。所以，一般來說，幼齡動物的細胞比老齡動物的細胞易于培養(yǎng)。同樣，分化程度越低的細胞，増殖能力越強，所以更容易培養(yǎng)。思考?討論思考?討論2.動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)有什么相同和不同之處？培養(yǎng)結果動物血清植物激素常用液體培養(yǎng)基常用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質細胞的全能性原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目新的細胞群，不形成個體完整植株培養(yǎng)基特有成分細胞增殖P453干細胞培養(yǎng)及其應用【任務1】閱讀教材46頁“干細胞培養(yǎng)及其應用”的內容，思考、回答下列問題：什么是干細胞？它有哪些類型？這些類型各有怎樣的特點和哪些方面的應用？P46干細胞概念大多數(shù)生物學家和醫(yī)學家認為干細胞是來自于胚胎、胎兒或成人體內具有在一定條件下無限制自我更新與增殖分化能力的一類細胞。存在于早期胚胎、骨髓和臍帶血。干細胞的種類胚胎干細胞成體干細胞存在于早期胚胎中，具有分化為成年動物體內的任何一種類型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。是成體組織或器官內的干細胞，具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發(fā)育成完整個體的能力。①干細胞的類型和特點胚胎干細胞簡稱ES細胞心肌細胞神經(jīng)細胞造血干細胞分化分化分化體外培養(yǎng)①干細胞的類型和特點成體干細胞造血干細胞血細胞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)干細胞精原干細胞神經(jīng)細胞精原細胞骨髓、外周血和臍帶血中睪丸中分化分化分化①干細胞的類型和特點②干細胞的應用干細胞有著自我更新能力及分化的潛能，與組織、器官的發(fā)育、再生和修復等密切相關，因而在醫(yī)學上有著廣泛的應用正常干細胞患者體內受損的器官或組織治愈疾病修復或替換移植②干細胞的應用正常造血干細胞患者體內受損的血細胞白血病修復或替換移植造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能障礙疾病正常神經(jīng)干細胞患者體內受損的神經(jīng)組織修復或替換移植治療治療神經(jīng)組織損傷和神經(jīng)退行性疾?。ㄅ两鹕?阿爾茨海默）3干細胞培養(yǎng)及其應用【任務2】胚胎干細胞必須從胚胎中獲取，這涉及倫理問題，因而限制了它在醫(yī)學上的應用，有什么更好的辦法呢？3干細胞培養(yǎng)及其應用【資料】2006年，科學家通過體外誘導小鼠成纖維細胞，獲得了類似胚胎干細胞的一種細胞，將它稱為誘導多能干細胞（簡稱iPS細胞），并用iPS細胞治療了小鼠的鐮狀細胞貧血。①iPS細胞的誘導及其流程病人各種類型的細胞導入特定基因導入特定蛋白小分子化合物成纖維細胞T細胞B細胞iPS細胞分化取出移植②iPS細胞應用的優(yōu)點（1）誘導過程無需破壞胚胎（2）iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內后，理論上可以避免免疫排斥。所以，科學家普遍認為iPS細胞的應用前景優(yōu)于胚胎干細胞。取成纖維細胞等轉入相關因子細胞發(fā)生轉化iPS細胞分化移植一、概念檢測1.判斷下列有關動物細胞培養(yǎng)的表述是否正確。(1)培養(yǎng)環(huán)境中需要O2，不需要CO2。()(2)細胞要經(jīng)過脫分化形成愈傷組織。()(3)培養(yǎng)液中通常含有糖類、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清。()(4)培養(yǎng)瓶中的細胞需定期用胰蛋白酶處理，分瓶后才能繼續(xù)增殖。()練習與應用××√×P472.干細胞有著廣泛的應用前景。下列相關敘述錯誤的是()A.干細胞是從胚胎中分離提取的細胞B.造血干細胞可以分化為各種血細胞C.不同類型的干細胞，它們的分化潛能是有差別的D.由iPS細胞產(chǎn)生的特定細胞，可以在新藥的測試中發(fā)揮重要作用練習與應用A二、拓展應用現(xiàn)在關于iPS細胞的研究正在不斷深入。請你從以下兩個方面來查閱資料進行思考。(1)由于誘導iPS細胞、促使其分化都需要時間，因此用某人特異的iPS細胞進行醫(yī)療只限于時間比較充裕的情形。從實際事故、疾病發(fā)生的不可預測性方面考慮，如果要將這些細胞用于緊急情況，應該提前采取什么措施？像建立骨髓庫一樣，有研究團隊正在嘗試建立HA(HumanLeukocyteAntigen，人類白細胞抗原)多態(tài)性豐富的iPS細胞庫，可以為需要的人找到HLA匹配度較高的iPS細胞，這樣不僅可以節(jié)省時間、成本，還能減輕異體干細胞移植后發(fā)生的免疫排斥反應。二、拓展應用(2)如果誘導iPS細胞定向分化為生殖細胞的技術發(fā)展成熟，該技術可能會有哪些應用？又可能帶來哪些問題？該技術可能被用于治療不孕癥；獲得足夠量的生殖細胞來進行瀕危物種的克隆研究；獲得生殖細胞進行轉基因操作，再經(jīng)過受精、胚胎發(fā)育等過程來獲得轉基因動物。該技術可能帶來一系列的倫理問題。例如，如果用同一個人的iPS細胞分別誘導形成精子和卵子，兩者受精可能培育出“單親”嬰兒；有的人還可能有目的地選擇iPS細胞，從而“設計”嬰兒。動物細胞融合技術概念：是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。011.動物細胞融合技術

1.1原理：細胞膜具有一定的流動性1.2融合細胞的特點：具有兩個或多個細胞的遺傳信息，通過動物細胞的培養(yǎng)，雜交細胞表現(xiàn)出親本的特點。1.3誘導動物細胞融合的常用方法：化學法：聚乙二醇（PEG）融合法物理法：電融合法生物法：滅活的病毒誘導法P481.動物細胞融合技術

滅活的病毒誘導法原理：病毒顆粒滅活的病毒表面的糖蛋白和一些酶與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用細胞膜融合細胞核融合形成雜交細胞在病毒的作用下細胞膜打開相關信息能不能用不滅活的病毒呢？融合形成的雜交細胞最終有幾個細胞核？1.動物細胞融合技術

19世紀30年代，科學家曾在患肺結核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內的病毒等誘導多個體細胞融合形成了多核細胞。1.動物細胞融合技術

1.4動物細胞融合技術的優(yōu)點：突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。1.5動物細胞融合技術的應用：研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段，特別是利用動物細胞融合技術發(fā)展起來的雜交瘤細胞技術，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。P4802單克隆抗體及其應用2單克隆抗體的前世今生產(chǎn)量低、純度低，而且特異性差B淋巴細胞不能無限增殖？血清分離每一個B細胞只分泌一種特異性抗體P49抗體種類超過百萬種2單克隆抗體及其應用

把一種B淋巴細胞與能在體外大量增殖的骨髓瘤細胞融合，所得到的融合細胞就可能大量增殖，產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體。米爾斯坦【英國】科勒【德國】1.你從視頻中了解到單克隆抗體具有哪些特點？2.請你嘗試解釋一下“單克隆抗體”一詞的含義。特異性強、純度高由單一細胞產(chǎn)生的只能識別一種抗原表位的特異性抗體。2單克隆抗體及其應用2.1單克隆抗體的過程：注射特定的抗原多種B細胞培養(yǎng)骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞將骨髓瘤細胞和B細胞融合多種雜交細胞雜交瘤細胞（既可以大量增殖又能產(chǎn)生抗體）篩選抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞（分泌的抗體能和特定的抗原結合）注射到小鼠腹腔內體外培養(yǎng)單克隆抗體誘導融合篩選P492單克隆抗體及其應用【兩次篩選的比較】項目第一次篩選第二次篩選（需要多次篩選）篩選原因篩選方法篩選結果誘導融合后得到多種雜交細胞，還有未融合的細胞等。用特定的選擇培養(yǎng)基篩選：未融合的親本和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。得到雜交瘤細胞因為小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細胞用96孔板培養(yǎng)，在每個孔中盡量接種一個雜交瘤細胞的情況下進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞得到能分泌所需抗體的雜交瘤細胞創(chuàng)新設計P372單克隆抗體及其應用【培養(yǎng)雜交瘤細胞的方法比較】項目腹腔培養(yǎng)體外培養(yǎng)優(yōu)點缺點易于控制培養(yǎng)條件（如無需提供無菌環(huán)境等），操作簡單，成本較低規(guī)模小，產(chǎn)量少可大規(guī)模培養(yǎng)，大量生產(chǎn)需要人為控制培養(yǎng)條件，成本相對較高創(chuàng)新設計P361.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？P50思考討論閱讀課本50頁“單克隆抗體的應用”資料1和資料2，回答以下問題：抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物發(fā)揮治療效應，如殺傷靶細胞。2.除了細胞毒素，還有哪些物質理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？可偶聯(lián)抗腫瘤藥物，如美登素。思考討論3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優(yōu)勢？單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點。2.2單克隆抗體的應用：（1）作為診斷試劑：（2）用于運載藥物（3）用于治療疾病利用同位素或熒光標記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。P49一、概念檢測1.下列有關動物細胞融合與植物體細胞雜交比較的敘述，錯誤的是（）A.它們的原理都涉及細胞膜的流動性B.都可以用電融合法或PEG融合法誘導融合C.融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細胞D.前者主要為了獲得細胞產(chǎn)品，后者主要為了獲得雜種植株練習與應用C2.科學家以SARS病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關敘述正確的是（）A.利用該單克隆抗體可以診斷是否感染SARS病毒B.體外培養(yǎng)單個B淋巴細胞可以獲得針對SARS病毒的單克隆抗體C.將等量B淋巴細胞和骨髓瘤細胞混合,經(jīng)誘導后融合的細胞即為雜交瘤細胞D.將純化的核衣殼蛋白反復注射到小鼠體內，從小鼠血清中分離出的抗體為單克隆抗體練習與應用A練習與應用二、拓展應用假如你掌握了動物細胞融合技術，你想用這種技術來解決哪些問題？解決這些問題的大致思路是怎樣的？這樣做會有什么風險？請查閱相關資料，完善自己的思路，并形成文字報告，與同學交流。可以利用動物細胞融合技術培育多倍體胚胎,研究其發(fā)育機制,甚至可能培育出新的物種。但是,日前相關技術還不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等問題,并且還可能帶來些倫理方面的問題。從社會中來兩只克隆猴在中國誕生從社會中來2017年我國科學家培育世界上首例體細胞克隆猴。1997年美國科學家從胚胎細胞“克隆了”兩只猴子。動物細胞核移植1.克隆猴用到了什么技術？動物細胞核具有全能性2.為什么用供體猴的一個細胞核進行移植就可以培育出與它幾乎一模一樣的克隆猴？動物體細胞分化程度高，表現(xiàn)全能性十分困難3.胚胎細胞克隆猴與體細胞克隆猴有什么不同？為什么體細胞克隆猴的誕生能夠轟動世界？P524.非人靈長類動物體細胞核移植非常困難的兩個原因？【小結】哺乳動物核移植的類型及特點非人靈長類動物體細胞核移植非常困難的兩個原因種類難易程度原因胚胎細胞核移植體細胞核移植較容易較難分化程度低，全能性易表現(xiàn)分化程度高，全能性難表現(xiàn)供體的細胞核在去核卵母細胞中不能完全恢復其分化前的功能狀態(tài)，這導致了胚胎發(fā)育率低；非人靈長類動物胚胎進行操作的技術尚不完善?！拘〗Y】用動物細胞核移植技術得到的動物稱為克隆動物，是一種無性生殖?？寺游锕w：受體：結果：動物細胞核移植的概念理解動物的一個細胞的細胞核去掉核的卵母細胞形成重新組合的細胞并發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育成動物個體。目錄Contents1動物體細胞核移植技術2體細胞核移植的應用前景及存在的問題01動物體細胞核移植技術動物細胞核移植技術是將動物一個細胞的細胞核移入去核的卵母細胞中，使這個重新組合的細胞發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育成動物個體的技術概念供體：受體：結果：動物細胞核移植的概念理解動物的一個細胞的細胞核去掉核的卵母細胞形成重新組合的細胞并發(fā)育成新胚胎，繼而發(fā)育成動物個體。動物體細胞核移植技術1P52胚胎細胞核移植體細胞核移植類型原理細胞核的全能性動物體細胞核移植技術1動物體細胞核移植技術1【任務1】請結合教材用文字構建克隆高產(chǎn)奶牛的流程P53動物體細胞核移植技術-流程1從屠宰場收集牛卵巢，在體外培養(yǎng)到MⅡ期從供體高產(chǎn)奶牛身體某一部位取體細胞，進行培養(yǎng)通過顯微操作去核將供體細胞注入去核的卵母細胞通過電融合法使兩細胞融合，供體核進入卵母細胞形成重構胚將胚胎移入受體（代孕）母牛體內生出犢牛（如電刺激、Ca2＋載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑等）用物理或化學方法激活重構胚動物體細胞核移植技術1【分析與探討】1.體細胞和卵母細胞從哪里來？2.卵母細胞需要在體外培養(yǎng)到什么時期？3.在將供體細胞的細胞核移入卵母細胞前，需要對卵母細胞進行什么操作？為什么？卵母細胞從屠宰場收集牛卵巢體細胞來自于供體高產(chǎn)奶牛身體的某部位（如耳）上取MⅡ期去核保證克隆動物的核基因全部來自供體細胞動物體細胞核移植技術1【分析與探討】4.實際在克隆高產(chǎn)奶牛時，科學家并沒有從供體細胞中取出細胞核，而是直接將供體細胞注入去核的卵母細胞，你知道這是為什么嗎？這種方法操作簡便，對卵母細胞損傷較小，伴隨著兩細胞融合，體現(xiàn)出細胞膜具有一定的流動性的結構特點。5.融合后的細胞可以直接發(fā)育成胚胎，繼而發(fā)育成個體么嗎？不可以，還需要利用胚胎工程中的胚胎移植等技術。動物體細胞核移植技術16.克隆出的小牛是對體細胞供體奶牛進行了100%的復制嗎？動物的發(fā)育及一些行為、習性的形成與所處環(huán)境有很大關系，克隆動物所生活的環(huán)境與核供體動物生活的環(huán)境不會完全相同【分析與探討】克隆動物遺傳物質細胞核的DNA來自于供體動物的細胞核線粒體中的DNA供體細胞和受體卵母細胞生活環(huán)境：P5402體細胞核移植的應用前景及存在的