飲料生產(chǎn)企業(yè)微生物實驗室操作規(guī)范

飲料生產(chǎn)企業(yè)微生物實驗室操作規(guī)范4微生物室環(huán)境管理3職責(zé)2定義1目的、范圍5微生物檢測操作規(guī)范目錄6微生物操作幾點說明保證微生物實驗操作的規(guī)范性，降低交叉污染的可能性，保障實驗高效、準確、安全。目的本規(guī)范適用于***公司微生物實驗操作規(guī)范管理。范圍目的、范圍是指殺死病原微生物、但不一定能殺死細菌芽孢的方法。通常用化學(xué)的方法來達到消毒的作用。用于消毒的化學(xué)藥物叫做消毒劑。消毒1是指把物體上所有的微生物（包括細菌芽孢在內(nèi)）全部殺死的方法，通常用物理方法來達到滅菌的目的。滅菌2定義采用干燥箱滅菌，160℃滅菌2h，180℃滅菌1h，適用于玻璃器皿，不銹鋼器具等。干熱滅菌3采用高壓滅菌器，121℃滅菌20min，適用于玻璃器皿、移液器吸頭、塑料瓶等，并按照GB15981的規(guī)定，評價高壓滅菌器的殺菌效果。濕熱滅菌4一次性用品和材料應(yīng)不含抑制微生物生長的物質(zhì)，并保持無菌狀態(tài)，必要時應(yīng)進行核查。一次性用品和材料可替代重復(fù)使用的器具和材料（如：玻璃器皿、培養(yǎng)皿、移液管、瓶子、試管、接種環(huán)、涂布棒等）。一次性用品和材料5一種采用石英玻璃或其他透紫玻璃的低氣壓汞蒸汽放電燈，放電產(chǎn)生以波長為253.7nm為主的紫外線輻射，其紫外輻射能滅殺細菌和病毒。殺菌原理：紫外線波長在240~280nm范圍內(nèi)最具殺破壞細菌病毒中的DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的分子結(jié)構(gòu)，造成生長性細胞死亡和(或)再生性細胞死亡，達到殺菌消毒的效果。尤其在波長為253.7nm時紫外線的殺菌作用最強。紫外線殺菌燈6掌握實驗室生物檢驗安全操作知識和消毒知識檢驗過程中保持個人整潔與衛(wèi)生，防止人為污染樣品對實驗室設(shè)施及環(huán)境進行衛(wèi)生清潔、點檢、維護，發(fā)現(xiàn)異常及時呈報。檢驗人員1確保微生物實驗室設(shè)施、環(huán)境，異常處理及缺失設(shè)施的增補。實驗室管理人員2職責(zé)微生物室環(huán)境管理微生物室及緩沖間須保持良好的衛(wèi)生狀況，與微生物檢測無關(guān)人員不得無故進出微生物操作室；微生物操作室在進行實驗前及實驗完成后都要依據(jù)要求對其進行殺菌；緩沖間的殺菌時間及頻率同微生物操作室。微生物室布局要合理，操作室應(yīng)有良好的通風(fēng)條件，如安裝空調(diào)設(shè)備及過濾設(shè)備，操作室內(nèi)空氣測試應(yīng)基本達到無菌。微生物實驗室主要工作區(qū)域的溫度應(yīng)為18℃-26℃，相對濕度應(yīng)為45%RH-65%RH，特殊地區(qū)夏季實驗室濕度超過70%RH以上時，加強除濕措施，將濕度控制在70%RH以下，同時應(yīng)適當(dāng)延長紫外線殺菌燈的照射時間。4.微生物檢測室使用前必須打開微檢室的紫外線燈輻照滅菌30分鐘以上。操作人員進入時應(yīng)提前30分鐘關(guān)掉紫外燈。操作完畢，應(yīng)及時清理微生物檢測室，再用紫外線燈輻照滅菌30分鐘。在開紫外燈殺菌前，應(yīng)確認無菌室無人后方可開紫外燈殺菌，開紫外燈順序為：先打開操作臺紫外燈后立即離開無菌室緩沖間，再打開無菌室紫外燈。在紫外殺菌燈關(guān)閉半小時后方可進入緩沖無菌室。微生物室環(huán)境管理注意事項：在使用過程中，應(yīng)保持紫外線燈表面的清潔，一般每兩周用酒精棉球擦拭一次，發(fā)現(xiàn)燈管表面有灰塵、油污時，應(yīng)隨時擦拭。同時記錄燈的使用情況和時間，并填寫《紫外燈使用記錄表》。工作人員進入微生物操作室前，必須用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在緩沖間更換經(jīng)紫外燈消毒后的專用工作服、鞋、帽子(注意帽子應(yīng)完全蓋住頭發(fā)，耳朵)、口罩和手套（用75%的酒精再次擦拭雙手），方可進入微生物檢測室進行操作。微生物檢測室專用的潔凈服不得在微生物檢測室以外區(qū)域穿著，要定期更換，清洗。在實驗室內(nèi)用過的工作衣應(yīng)單獨存放，不得和日常服裝放在同一柜子內(nèi)。微生物檢測操作規(guī)范微生物檢測室應(yīng)保持清潔，微生物實驗室內(nèi)不得存放過多物品，嚴禁堆放雜物，以防止污染。微生物檢測室應(yīng)備有工作濃度的消毒液，如75%的酒精。酒精的作用是使細菌的蛋白質(zhì)變性（凝固），使之死亡。高濃度酒精溶液會使細菌表面形成一層保護膜，會阻礙酒精分子進入細菌內(nèi)部（原理是高濃度的酒精使細菌表面的蛋白質(zhì)快速變性凝固形成保護膜）。微生物檢測室應(yīng)每周用84消毒液或其他有效消毒效果的消毒方式進行滅菌清潔，以保證室內(nèi)的潔凈度符合要求。每次實驗時，都需要進行生物安全柜（或超凈工作臺）的空曝實驗以檢測生物安全柜（或超凈工作臺）內(nèi)的滅菌效果。生物安全柜內(nèi)只放入必需的實驗物品和材料，避免污染物品放入生物安全柜（或超凈工作臺）。實驗室工作區(qū)域表面、人員接觸的表面和空氣應(yīng)定期監(jiān)控微生物質(zhì)量（監(jiān)控頻率基于之前的檢測結(jié)果）；表面污染評估可直接使用含有抗消毒劑的適合中和劑（如：卵磷脂、硫代硫酸鈉）的接觸板；空氣質(zhì)量檢查可以用非選擇性培養(yǎng)基（如：平板計數(shù)瓊脂PCA）或用于檢測目標微生物（如：霉菌）的選擇性培養(yǎng)基，制成平板，打開蓋在空氣中暴露15min后，培養(yǎng)、計數(shù)。也可使用其他有效的檢測表面污染的方法。微生物檢測操作規(guī)范微生物檢測取樣規(guī)范依據(jù)公司標準要求，確定取樣數(shù)量。抽取的樣品應(yīng)對一批產(chǎn)品具有代表性，從取樣至開始檢測的全過程中，應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化。取樣應(yīng)遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。每取完一份樣品，應(yīng)更換新的取樣用具或?qū)⒂眠^的取樣用具迅速消毒后，再取另一份樣品，以免交叉污染。微生物實驗操作規(guī)范需帶入微生物檢測室使用的儀器、器械、平皿等一切物品，均應(yīng)ba包裹嚴密，并經(jīng)過滅菌。打開包裝未使用完的工器具，需要重新滅菌后再使用。器具的滅菌可采用濕熱滅菌或干熱滅菌。在某些情況下，也可使用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)殺菌，但處理后的器具不得有影響微生物生長的殘留物。高壓滅菌是所有除菌程序中的首選方法。

在驗證滅菌鍋驗證殺菌效果時，應(yīng)每次使用化學(xué)指示卡進行驗證滅菌效果，但化學(xué)指示卡只能測到它最高的溫度，并不能說明滅菌器達到滅菌要求，所以應(yīng)每個季度使用生物指示劑對滅菌器期間核查，驗證滅菌器的滅菌效果。用于微生物檢測的玻璃器皿和其他檢測用所需物品應(yīng)合理配置，正確使用，并保證其處于潔凈和無菌狀態(tài)直至使用，重復(fù)使用的器具在清洗后不得有影響微生物生長的殘留物。培養(yǎng)基通常采用高壓濕熱滅菌法，121℃滅菌15min，部分培養(yǎng)基（如結(jié)晶紫中性紅膽鹽培瓊脂）采用煮沸滅菌，即用型試劑不需滅菌，具體應(yīng)參照相關(guān)國家標準或供應(yīng)商使用說明進行使用。開始檢測之前，確保開展檢測所需的各項物品都已備齊，進入微生物檢測室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過傳遞窗傳遞。微生物實驗操作規(guī)范檢測開始前，應(yīng)使用75%乙醇擦拭消毒生物安全柜（或超凈工作臺）的工作臺面和內(nèi)壁。在檢測前，應(yīng)保持待檢物品外包裝完整，不得開啟，以防污染。樣品的全部制備、稀釋等過程均應(yīng)遵循無菌操作程序，樣品容器開啟前，先將容器表面擦干凈，再用75%乙醇消毒開啟部位及其周圍。微生物檢測期間，防止不必要的人員走動，嚴格禁止人員進出。進入實驗室人員應(yīng)嚴格執(zhí)行安全操作規(guī)程，工作前后，用適當(dāng)?shù)南緞ㄈ?5%的乙醇）消毒工作臺面；生物安全柜（或超凈工作臺）內(nèi)應(yīng)避免放置過多物品，操作過程中保持清潔。微生物實驗操作規(guī)范微生物實驗操作人員在配制培養(yǎng)基過程中注意佩戴隔熱手套，邊加熱邊攪拌，全部溶解后，進行高壓滅菌或分裝于錐形瓶中，盛放培養(yǎng)基體積不宜超過錐形瓶容量的80%（防止滅菌過程中噴出，污染或損害高壓滅菌鍋）。盛裝培養(yǎng)基的錐形瓶或其他玻璃容器，應(yīng)選擇沒有劃痕和磨痕的。定期檢查并更換實驗室中使用時間較長、磨痕較多的玻璃容器。橡膠塞也要定期進行更換，不能使用不合適的膠塞，也要避免膠塞老舊導(dǎo)致氣孔堵塞。微生物實驗操作規(guī)范如果瓊脂需要復(fù)溶時，首先將需要復(fù)溶的瓊脂瓶放入50℃的水浴鍋中，水浴鍋中的水位應(yīng)超過瓶內(nèi)瓊脂的體積的一半以上，當(dāng)培養(yǎng)基完全與錐形瓶內(nèi)壁分離且液化的培養(yǎng)基量已達1/2時，可取出放電陶爐上繼續(xù)復(fù)溶，加熱過程注意控制電陶爐的溫度，并且邊加熱邊搖動，防止糊底和瓊脂噴射。培養(yǎng)基及配套試劑應(yīng)按標準要求條件進行儲存，不得使用過期的培養(yǎng)基，影響使用效果。如孟加拉紅瓊脂滅菌后，要避光保存?zhèn)溆?，因為孟加拉紅見光易分解，影響霉菌生長。微生物實驗操作規(guī)范微生物實驗操作人員在操作時應(yīng)戴一次性口罩、手套，手及裸露手臂部分用消毒液清洗消毒，并避免觸摸口、眼及面部，必要時佩戴安全眼鏡、面罩（面具）或其它防護設(shè)施。無菌操作室禁止交談，操作過程中不得用手觸摸其它未消毒、滅菌的區(qū)域，檢測期間防止不必要的人員走動。操作打開后的樣品、培養(yǎng)基以及接種時，禁止說話、咳嗽等；進行實驗操作時應(yīng)使用恰當(dāng)?shù)牟僮魇址ūM量減少濺撒或者氣溶膠的產(chǎn)生。打開包裝未使用完的器皿，不能再繼續(xù)使用。在取培養(yǎng)皿過程中，應(yīng)豎著拿出培養(yǎng)皿，橫著打開皿桶，培養(yǎng)皿有開蓋污染的風(fēng)險。微生物實驗操作規(guī)范檢測樣品時，應(yīng)按照“由帶菌量少到帶菌量多的檢測順序”檢測，避免交叉污染。在安裝濾杯時，雙手不能接觸濾杯上部、底部等，否則可能存在污染樣品。在往培養(yǎng)基平板上貼過濾膜時，濾膜和培養(yǎng)基之間不得有氣泡。抽濾完成后，要用無菌水進行清洗抽濾裝置、管路，防止管路中有殘存飲料，管路發(fā)霉，若產(chǎn)生倒吸，很可能引起過濾裝置的污染。無菌室不能存放大量酒精、瓦斯氣、物品等。微生物實驗操作規(guī)范用浸泡過75％乙醇或其他適當(dāng)消毒劑的紗布或其他適當(dāng)材料迅速擦去任何溢物，在繼續(xù)檢測前重點清潔和消毒此工作臺面，為達到消毒效果需要適當(dāng)?shù)慕佑|時間，使用其他消毒劑時，應(yīng)根據(jù)廠商說明書操作。實驗結(jié)束后，應(yīng)使用75%酒精擦拭生物安全柜（或超凈工作臺）的工作臺面、內(nèi)壁、玻璃懸窗內(nèi)外側(cè)、紫外燈和電源輸出口，以及包括實驗設(shè)備在內(nèi)的生物安全柜內(nèi)的所有物品。實驗完畢，立即清理現(xiàn)場和實驗用具，對染菌帶毒物品，進行消毒滅菌處理。實驗用過的廢棄物要倒在固定的箱筒內(nèi)，并及時處理。微生物實驗操作規(guī)范實驗完畢，用肥皂水洗凈雙手，然后用清水沖洗，工作服應(yīng)經(jīng)常清洗，保持整潔，必要時高壓滅菌。廢物處理：由于剩余的培養(yǎng)基可能會使微生物生長繁殖，因此，在實驗結(jié)束時，包括儀器設(shè)備在內(nèi)的生物安全柜（或超凈工作臺）里的所有物品都應(yīng)清除表面污染，并移出生物安全柜（或超凈工作臺）；對于培養(yǎng)物及其污染的物品（如細菌培養(yǎng)平皿等）應(yīng)使用適當(dāng)濃度的自配或商業(yè)液體消毒劑處理一定時間，或121℃高壓滅菌至少30min，或其他有效處理措施。將處理物倒入特殊標識的垃圾袋內(nèi)，直接送到指定地點。高壓滅菌鍋的使用，微生物實驗操作人員必須正確使用高壓滅菌鍋滅菌。除直接監(jiān)控高壓滅菌鍋的溫度外，還可使用化學(xué)或生物指示劑指示每個滅菌循環(huán)的運轉(zhuǎn)效果。微生物實驗操作規(guī)范在有氧培養(yǎng)中，一般平板堆疊不能超過６個，平板之間、平板與培養(yǎng)箱壁間要距離至少25ｍｍ。如果空間不夠，在空氣流通的系統(tǒng)里，可以疊得更高些。這種情況，需要證實溫度均勻性。嚴格控制培養(yǎng)箱溫度以及培養(yǎng)時間，不得提前出具微生物結(jié)果。定期對微生物培養(yǎng)箱及高壓滅菌鍋維護保養(yǎng)，如每周使用75%酒精擦拭培養(yǎng)箱箱體內(nèi)部，升溫至100°C滅菌1h；高壓滅菌鍋每周換水等。實驗設(shè)備應(yīng)放置于適宜的環(huán)境條件下，便于操作、維護、清潔、消毒與校準，并保持整潔與良好的工作狀態(tài)。使用前應(yīng)核查設(shè)備是否符合指定要求，使用過程中應(yīng)對其性能的有效性進行監(jiān)控。微生物實驗操作規(guī)范實驗室應(yīng)制定周期性檢查程序以證實檢測可變性（檢測人員差異、設(shè)備差異、材料差異）處在控制下，該程序應(yīng)覆蓋實驗室所有檢測活動，該程序應(yīng)包括但不限于以下方法：①使用添加已知水平的加標樣品，包括目標和背景微生物；②使用不同基質(zhì)的添加或自然污染的樣品；③使用標準物質(zhì)（包括能力驗證樣品）；④重復(fù)檢測；⑤重復(fù)評估檢測結(jié)果。微生物實驗操作規(guī)范微生物操作幾點說明新到貨的培養(yǎng)基應(yīng)依據(jù)《GB4789.28食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》進行驗證，開蓋后的培養(yǎng)基應(yīng)注意在瓶身標識開蓋日期，每次使用前查看培養(yǎng)基狀態(tài)，同時為了便于追溯，應(yīng)在記錄中記錄使用的培養(yǎng)基批號。關(guān)于霉酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基說明：《GB4789.15-2016食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》中傾倒培養(yǎng)基的量由10版的15~20mL增加至20~25mL，不能為了節(jié)省培養(yǎng)基，而減少培養(yǎng)量，更不能為了節(jié)省培養(yǎng)基，將要求中使用90mm的無菌平皿變?yōu)?0mm。關(guān)于霉酵培養(yǎng)的放置方