半夏瀉心湯及其拆方對(duì)胃電節(jié)律失常大鼠胃組織縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的影響

1/1半夏瀉心湯及其拆方對(duì)胃電節(jié)律失常大鼠胃組織縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的影響半夏瀉心湯及其拆方對(duì)胃電節(jié)律失常大鼠胃組織縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的影響摘要：

目的探討半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)的配伍規(guī)律。

方法選取90只健康SD雄性大鼠，分為正常組10只和模型組80只。

復(fù)制大鼠胃電節(jié)律失常模型，經(jīng)胃電生理學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)后，根據(jù)半夏瀉心湯的配伍特點(diǎn)，將其拆分為辛開(kāi)、苦降、甘補(bǔ)、辛開(kāi)苦降、辛開(kāi)甘補(bǔ)、苦降甘補(bǔ)組，每組10只。

各給藥組按相同藥物濃度不等體積連續(xù)灌胃4周。

給藥后進(jìn)行胃電參數(shù)分析，采用免疫組化法、RT-PCR檢測(cè)胃組織Cx43及其mRNA表達(dá)。

結(jié)果與正常組比較，模型組Cx43及其mRNA表達(dá)升高；與模型組比較，各給藥組胃電慢波頻率變異系數(shù)降低，各給藥組Cx43及其mRNA表達(dá)降低，其中辛開(kāi)甘補(bǔ)組作用最為顯著。

結(jié)論半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)機(jī)制可能與其降低縫隙連接蛋白Cx43及其mRNA表達(dá)有關(guān)，從而改變紊亂的胃電節(jié)律，達(dá)到改善胃運(yùn)動(dòng)功能的作用。

關(guān)鍵詞：

半夏瀉心湯；Cx43蛋白；縫隙連接；胃運(yùn)動(dòng)；大鼠中圖分類(lèi)號(hào)：

R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

A文章編號(hào)：

1005-5304（2015）06-0075-05胃腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂是大多胃腸道疾病的重要臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制，其發(fā)病率高。

半夏瀉心湯出自《傷寒論》，具有降逆止嘔、消痞散結(jié)的作用。

前期研究表明，半夏瀉心湯對(duì)胃電節(jié)律失常大鼠胃壁SCF基因表達(dá)水平、胃肌間神經(jīng)叢c-kit陽(yáng)性間質(zhì)細(xì)胞（ICC）含量表達(dá)均有影響[1]。

胃腸神經(jīng)-ICC-平滑肌細(xì)胞（SMC）網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的變化對(duì)胃腸道動(dòng)力障礙性疾病有重要的病理生理學(xué)意義。

在胃腸道中，縫隙連接（GJ）是介導(dǎo)SMC和ICC細(xì)胞間電化學(xué)信息交流，保證肌肉活動(dòng)的協(xié)調(diào)性和同步性的特殊通道。

Cx43是構(gòu)成GJ最重要的連接蛋白，廣泛存在于胃腸Cajal與SMC之間。

Cx43基因發(fā)生突變、數(shù)量減少，會(huì)影響細(xì)胞膜上GJ通道的數(shù)量，從而妨礙細(xì)胞間信號(hào)的傳遞，導(dǎo)致胃腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙。

本研究以Cx43為切入點(diǎn)，根據(jù)半夏瀉心湯辛開(kāi)苦降甘補(bǔ)的配伍特點(diǎn)，按照藥味特點(diǎn)與中醫(yī)病機(jī)結(jié)合分組的原則，采用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)研究半夏瀉心湯及其拆方對(duì)ICC細(xì)胞Cx43的影響，進(jìn)一步揭示半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制，闡釋經(jīng)方配伍規(guī)律。

1實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物健康4周齡SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量（18020）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)0309256。

所有動(dòng)物均給予大鼠全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2藥物半夏瀉心湯方的藥物劑量比例按文獻(xiàn)[2]換算。

法半夏55.7g，黃芩、干姜、人參、炙甘草各46.875g，黃連15.62g，大棗42g。

根據(jù)法依病機(jī)，拆方依法的研究思路[3]，將半夏瀉心湯拆分為辛開(kāi)組（法半夏、干姜）、苦降組（黃芩、黃連）、甘補(bǔ)組（人參、炙甘草、大棗）、辛開(kāi)苦降組（法半夏、干姜、黃芩、黃連）、辛開(kāi)甘補(bǔ)組（法半夏、干姜，人參、炙甘草、大棗）及苦降甘補(bǔ)組（黃芩、黃連、人參、炙甘草、大棗）。

所有藥物均為免煎顆粒，北京康仁堂藥業(yè)有限公司。

1.3主要試劑與儀器4%多聚甲醛，solarbio公司；免疫組化通用試劑盒（鼠/兔）、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；一抗Connexin43Antibody（鼠抗人，單克隆抗體）、二抗goatanti-mouseIgM-HRP，Santacruz公司；Trizol，Invitrogen公司；氯仿，索萊寶公司；異丙醇，北京益奧明科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司；SYBRGreenPCRMasterMix，ABI公司；所有引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

多導(dǎo)生理儀EGG100C（BioPac公司，美國(guó)），SPOTsoftwareV3.0Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)（Diagnosticinstruments，美國(guó)），LD5-2A離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司），超聲勻漿機(jī)（PharmaciaBiotech），紫外分光光度儀（Pharmacia，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀MX3000P（Stratagene，美國(guó)）。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1分組、造模與給藥將大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組。

正常組10只，常規(guī)飼養(yǎng)。

模型組80只，不規(guī)則喂養(yǎng)4周，即大鼠每逢單日正常進(jìn)食、雙日禁食，以打亂其正常的飲食節(jié)律。

自由飲水，水中加入鹽酸（每升水加10mol/L鹽酸10mL），以破壞胃內(nèi)酸堿環(huán)境，制備大鼠胃電節(jié)律失常模型[4]。

大鼠不規(guī)則喂養(yǎng)4周后，參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行胃電生理學(xué)評(píng)價(jià)，分析胃電慢波節(jié)律。

模型大鼠胃電節(jié)律異常，胃動(dòng)過(guò)速、胃動(dòng)過(guò)緩和節(jié)律紊亂，與正常組比較有顯著差異，提示造模成功。

將標(biāo)記好的80只模型大鼠隨機(jī)分為模型組、辛開(kāi)組、苦降組、甘補(bǔ)組、辛開(kāi)苦降組、辛開(kāi)甘補(bǔ)組、苦降甘補(bǔ)組、全方組，每組10只。

相當(dāng)于人單位體質(zhì)量原藥材量的10倍，即得大鼠每日喂食用藥量。

各給藥組每日按相同藥物濃度不等體積（5mL/kg）給予相應(yīng)藥液灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

2.2胃電生理學(xué)評(píng)價(jià)給藥4周后，大鼠禁食18h，腹腔注射3.5%水合氯醛（1mL/100g）麻醉，固定后腹部備皮，常規(guī)消毒，于劍突下正中切開(kāi)腹壁1～2cm，暴露胃竇部，在距幽門(mén)0.5cm處漿膜下埋置一對(duì)Ag-AgCl電極，兩電極間距3mm，還原暴露的胃組織，接地電極插入大鼠腿部肌肉處固定。

將三股電極連接于多導(dǎo)生理儀上。

打開(kāi)Acqknowledge4.1，胃電橫軸時(shí)間以1min為單位，縱軸振幅以2mV為單位進(jìn)行胃電記錄，每次記錄30min。

胃電記錄完畢，用2/0縫合線縫合切口，碘伏擦拭。

術(shù)后大鼠腹腔注射青霉素40萬(wàn)U/（d?只），連續(xù)3d。

術(shù)后1周取材。

胃電記錄以每10min為1個(gè)時(shí)間段，計(jì)算每只大鼠每個(gè)時(shí)間段的慢波頻率以及每只大鼠慢波頻率變異系數(shù)[4]，進(jìn)行胃電參數(shù)分析。

2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃組織Cx43表達(dá)大鼠禁食18h后，3.5%水合氯醛（1mL/100g）腹腔注射麻醉，背位固定，取出胃組織，生理鹽水沖洗干凈后，4%多聚甲醛固定。

采用SABC免疫組化檢測(cè)法胃組織Cx43表達(dá)，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

采用SPOTsoftwareV3.0Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)，將染色后的病理切片在10倍光鏡下觀察后，在40倍鏡下每例標(biāo)本隨機(jī)選擇肌間神經(jīng)叢的5個(gè)最能反映胃壁全貌的視野，觀察Cx43表達(dá)分布情況，結(jié)果進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)平均光密度值，計(jì)算積分光密度值（IOD）。

以細(xì)胞質(zhì)有明確棕色或棕黃色著色而細(xì)胞核無(wú)著色為陽(yáng)性表達(dá)。

2.4RT-PCR檢測(cè)大鼠胃壁Cx43基因表達(dá)取胃組織30mg，置于冰上，加Trizol勻漿，按照常規(guī)操作順序提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260和OD280，計(jì)算總RNA的濃度及純度。

取2g總RNA，在鳥(niǎo)類(lèi)成髓細(xì)胞瘤反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）和Oligo（dT）條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，70℃10min，4℃5min，42℃30min，95℃5min，4℃5min，獲得cDNA。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20L，含2LcDNA，10mol/L上下游引物各1L，5SYBRGreenPCRMasterMix10L。

根據(jù)文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)引物。

Cx43引物序列：

上游5’-ACTTCAGCCTCCAAGGAGTTC-3’，下游5’-CATGTCTGGGCACCTCTCTTT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度80bp；以GAPDH作為內(nèi)參照。

上游5’-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGA-3’，下游5’-CCGTTCACACCGACCTTCACCAT-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度95bp。

2條引物擴(kuò)增效率均為90%～100%。

GAPDH、Cx43擴(kuò)增條件為：

95℃5min預(yù)變性；95℃30s，55℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；95℃1min，55℃30s，95℃30s，1個(gè)循環(huán)。

每個(gè)樣品設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，取均值。

將所得Ct值按照2-Ct的方法進(jìn)行均一化處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用―xs表示，所有數(shù)據(jù)剔除隨機(jī)誤差及人為因素導(dǎo)致的過(guò)高或過(guò)低的測(cè)量值，隨后進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)K個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)；服從正態(tài)分布時(shí)，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)；各給藥組與模型組比較采用Dunnett’sT3檢驗(yàn)；各給藥組之間兩兩比較采用Tukey’sMultipleComparisonTest檢驗(yàn)；各給藥組之間是否有交互作用采用析因分析。

P本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組與正常組比較慢波頻率變異系數(shù)顯著增高，各給藥組與模型組比較慢波頻率變異系數(shù)有不同程度降低，提示半夏瀉心湯及其各拆方組具有調(diào)節(jié)胃電節(jié)律的作用。

電節(jié)律紊亂的模型組其Cx43在胃組織上的分布表達(dá)顯著高于正常組，且分布不均勻，提示胃電節(jié)律紊亂引起的胃動(dòng)過(guò)速可能與Cx43異常增高表達(dá)有密切關(guān)聯(lián)。

半定量分析結(jié)果顯示，各給藥組均對(duì)Cx43表達(dá)量有不同程度降低作用，辛開(kāi)甘補(bǔ)組Cx43陽(yáng)性表達(dá)顯著降低。

各給藥組與模型組比較，Cx43陽(yáng)性表達(dá)均有不同程度的降低，提示各給藥組對(duì)胃組織縫隙連接Cx43的表達(dá)分布均具有不同程度降低作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，半夏瀉心湯及其拆方干預(yù)可以影響Cx43mRNA的表達(dá)，各給藥組都可以有效降低胃組織Cx43mRNA的異常增高表達(dá)，其中苦降甘補(bǔ)組對(duì)Cx43mRNA的抑制最顯著，提示半夏瀉心湯組方抑制Cx43mRNA表達(dá)，主要通過(guò)苦降藥物與甘補(bǔ)藥物的協(xié)同配伍來(lái)實(shí)現(xiàn)。

相關(guān)研究表明，采用苦寒瀉下法建立的大鼠脾氣虛模型，胃肌層Cx43表達(dá)降低[8]，也提示苦瀉藥物對(duì)Cx43的表達(dá)有抑制作用。

綜合上述結(jié)果，模型組慢波頻率變異系數(shù)增高，Cx43表達(dá)增強(qiáng)，基于Cx43表達(dá)增高對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)有促進(jìn)作用。

因此，我們推測(cè)Cx43表達(dá)異常增高會(huì)誘導(dǎo)胃電節(jié)律紊亂引起胃動(dòng)過(guò)速，從而導(dǎo)致胃運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)。

半夏瀉心湯通過(guò)辛開(kāi)、苦降、甘補(bǔ)藥物協(xié)同配伍作用從而降低Cx43的表達(dá)。

由此我們推測(cè)半夏瀉心湯方不僅能治療胃動(dòng)過(guò)緩導(dǎo)致胃運(yùn)動(dòng)功能障礙的心下痞證，還能通過(guò)抑制Cx43過(guò)表達(dá)有效抑制胃電節(jié)律紊亂引起的胃動(dòng)過(guò)速，從而改善胃運(yùn)動(dòng)功能亢進(jìn)癥狀，對(duì)胃運(yùn)動(dòng)功能起雙向調(diào)節(jié)的作用。

各拆方組間協(xié)同作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]李宇航，王慶國(guó)，陳萌，等.半夏瀉心湯對(duì)胃電節(jié)律失常大鼠胃壁SCF基因表達(dá)水平的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21（11）：

1825-1826.[2]柯雪帆，趙章忠，張玉萍，等.《傷寒論》和《金匱要略》中的藥物劑量問(wèn)題[J].上海中藥雜志，1983，20（12）：

36-38.[3]李宇航，王慶國(guó)，牛欣，等.半夏瀉心湯配伍意義的拆方研究――調(diào)節(jié)胃分泌作用的實(shí)驗(yàn)觀察[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22（5）：

49-52.[4]李宇航，王慶國(guó)，陳萌，等.半夏瀉心湯及其拆方對(duì)胃電節(jié)律失常大鼠胃電慢波頻率變異系數(shù)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（S1）：

53-55.[5]RachdiL，ElGhaziL，BemexF，etal.Expressionofthereceptortyrosinekinasekitinmature-actionandinthepancreasindevelopment[J].Diabetes，2001，50（9）：

2021-2028.[6]郭璇，譚華梁，王小娟，等.舒胃湯對(duì)功能性消化不良大鼠Cx43蛋白的分布及Cajal間質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)與再生的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜