3.2.2基因工程的基本操作程序（PCR計(jì)算引物選擇）高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章基因工程基因工程的基本操作程序（PCR計(jì)算+引物選擇）P1.引物根據(jù)一段已知目的基因的核苷酸序列合成。2.PCR反應(yīng)體系的成分中能決定復(fù)制特定DNA片段的是（“模板”/“引物”）?3.PCR擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列。4.延伸的方向是子鏈的5’→3’導(dǎo)思（一）引物選擇部分：8分鐘1.探針兩端分別連接一個(gè)熒光基團(tuán)R和一個(gè)淬滅基團(tuán)Q．2.機(jī)理:①探針結(jié)構(gòu)完整時(shí),R發(fā)射的熒光被Q吸收；②而PCR擴(kuò)增時(shí),結(jié)合在模板鏈上的探針被切斷,使R和Q分離,R基團(tuán)發(fā)射的熒光不被淬滅,這樣通過對(duì)熒光強(qiáng)弱的監(jiān)測(cè)可實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè)。3.完成議的內(nèi)容議6分RT-PCR:(1)探針的水解，發(fā)生在PCR過程_延伸_階段。步驟③的目的是使_引物和探針_與目的基因通過形成_氫鍵（化學(xué)鍵）特異性結(jié)合。（2）PCR過程中，不斷消耗的是？原料、DNA聚合酶、模板、引物？

原料、引物

據(jù)此分析：“平臺(tái)期”出現(xiàn)的原因是試劑盒中原料、引物和探針數(shù)量一定，超出一定循環(huán)數(shù)后，熒光標(biāo)記的“雜交雙鏈”不再增加。（3）Ct值指“每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)”,當(dāng)樣本中初始模板越多,Ct值就(大\小)

小。(4)現(xiàn)有兩個(gè)待檢樣本,檢測(cè)時(shí)都出現(xiàn)了右圖曲線,但甲的a點(diǎn)比乙的a點(diǎn)明顯左移。合理的解釋是:_甲樣本中的新冠病毒含量更高達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)更少。展8【拓】“熒光RT—PCR技術(shù)”試劑盒應(yīng)該含:_模板×_逆轉(zhuǎn)錄酶__、_耐高溫的DNA聚合酶_、熒光標(biāo)記的核酸探針、引物、dNTP、緩沖液。拓應(yīng)用:1.RT-PCR對(duì)基因表達(dá)[轉(zhuǎn)錄+翻譯]的檢測(cè)僅限于轉(zhuǎn)錄_水平，根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度又可以估算_起始模板RNA_的濃度，以此代表目的基因在特定組織中的表達(dá)量。

2.還可對(duì)某些微量RNA病毒的檢測(cè)，可提高檢測(cè)的靈敏度，原因是增加了待測(cè)RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA的數(shù)量，便于檢測(cè)_。

展8議1.如果擴(kuò)增序列為下圖所示的兩段序列之間的DNA片段，合適的引物是_甲和D__。5′→GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG-3′3′-CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC-5′引物Ⅰ引物Ⅱ甲5′-GACCTGTGGAAGCA5′-CATACGGGATTG乙5′-CTGGACACCTTCGB5′-GTATGCCCTAAC丙5′-CGAAGGTGTCCAGC5′-GTTAGGGCTTAC丁5′-GCTTCCACAGGTCD5′-CAATCCCGTATGT1（1）圖1選取___BE__作為引物。展評(píng)9T1（2）圖2選取___1,4_為引物。T2利用PCR擴(kuò)增T-DNA片段，選擇引物是AD

PCR擴(kuò)增被插入的基因片段，選擇引物是BC拓：①利用PCR擴(kuò)增已知序列T-DNA：選用引物

②③②對(duì)兩側(cè)未知序列進(jìn)行測(cè)序：做法是：用

DNA連接酶連接成環(huán)狀后，再用引物①④

PCR擴(kuò)增后測(cè)序展評(píng)93.引物設(shè)計(jì)要求：①PCR中引物不能過長的原因__防止引物自身堿基互補(bǔ)配對(duì)造成自身環(huán)化___________②引物不能過短原因__引物與模板鏈結(jié)合的特異性差,容易擴(kuò)增出非目的基因片段③每一種引物的內(nèi)部以及兩種引物之間不能發(fā)生過多的堿基互補(bǔ)配對(duì)，據(jù)圖4分析，下列兩組引物設(shè)計(jì)都不合理的原因：第一組引物:引物I和引物II局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)_第二組引物:引物I’自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效_。____________

T4.若已知一段目的基因的一個(gè)引物，能否據(jù)此寫出另一個(gè)引物，說明原因？不能兩種引物序列無相關(guān)性展評(píng)91.引物數(shù)=新形成的DNA分子鏈數(shù)

一個(gè)DNA擴(kuò)增n次，引物數(shù)=2n×2-2=2n+1-22.數(shù)量：引物1=引物23.等長DNA片段=目的基因片段導(dǎo)4思（二）PCR計(jì)算部分

6分鐘T5.結(jié)合圖5（1）填寫右表(2)至少循環(huán)

3

次才會(huì)出現(xiàn)等長的DNA片段,即

⑤

。經(jīng)n輪循環(huán)后,①②各

1

個(gè),③④各n-1個(gè),⑤(目的基因)共有2n-2n

個(gè)。T6.擴(kuò)增n輪后,含有引物1的DNA分子

有

2n-1

個(gè),

只含引物1的DNA分子有

1

個(gè)，同時(shí)含引物1和引物2DNA分子有2n-2個(gè)。T7.已知引物數(shù)=新合成的子鏈數(shù):(1)一個(gè)目的基因擴(kuò)增n代,需消耗2（2n-1）

個(gè)引物,需要

2n-1

個(gè)引物1。①②③④①②③④⑤展評(píng)411.PCR循環(huán)n次，等長的目的基因數(shù)量是2n-2n。循環(huán)5次，目的基因有？25-2×5含有引物1和引物2的DNA有幾個(gè)？25-2消耗引物多少個(gè)？（25-1）×22.新冠病毒是一種RNA病毒，檢測(cè)新冠病毒RNA可采取RT-PCR法。這種方法需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶耐高溫的DNA聚合酶。3.提取新冠病毒的RNA，通過_逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。過程Ⅰ和過程Ⅱ利用的原料相同（填“相同”“不同”或“不完全相同”）4.右圖擬對(duì)m個(gè)單鏈cDNA進(jìn)行n次循環(huán)的擴(kuò)增，理論上至少需要__m×2n-1____個(gè)引物B。檢5.退火溫度過高會(huì)破壞引物與模板DNA鏈的堿基配對(duì)。長度相同但G、C堿基所占比率較高的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。6.引物A和B的長度越長、G和C比例越高，則PCR循環(huán)步驟中的復(fù)性（填“變性”“復(fù)性”或“延伸”）溫度設(shè)定就越高。7.PCR中引物不能過長的原因__防止引物自身堿基互補(bǔ)配對(duì)造成自身環(huán)化___________②引物不能過短原因__引物特異性差,容易擴(kuò)增出非目的基因片段2.判斷：①判斷：限制酶是一種酶錯(cuò)

一類酶②質(zhì)粒只有在侵入宿主細(xì)胞后，才能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制錯(cuò)

P74質(zhì)粒能自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。③DNA連接酶對(duì)所連接的DNA兩端的堿基序列有專一性要求錯(cuò)④限制酶能夠識(shí)別新冠病毒特定的核苷酸序列并在特定位點(diǎn)切開磷酸二酯鍵錯(cuò)

不識(shí)別RNA⑤EcoRI識(shí)別序列和切割位點(diǎn)為G↓AATTC，則形成的黏性末端為AATTC-錯(cuò)

AATT⑥用F和G酶切割目的基因和質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒，則應(yīng)該用四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含重組質(zhì)粒的受體菌。錯(cuò)

不能直接就是四環(huán)素

應(yīng)該是氨芐青霉素⑦限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的識(shí)別序列如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。圖示某一目的基因片段與質(zhì)粒拼接形成重組質(zhì)粒的過程。將重組質(zhì)粒同時(shí)用以上2種限制酶切割則會(huì)再形成1種長度的DNA片段

對(duì)

重組之后不能被這兩種酶識(shí)別⑧若DNA上的堿基隨機(jī)排列，NotI限制酶切割位點(diǎn)出現(xiàn)頻率低于其他三種限制酶對(duì)

⑨某環(huán)狀DNA分子，用BamHⅠ完全切割該DNA分子后產(chǎn)生2個(gè)片段