DNA甲基化與先天性心臟病的研究進(jìn)展

1/1DNA甲基化與先天性心臟病的研究進(jìn)展1檢測DNA甲基化在研究先天性心臟病發(fā)病機(jī)制的評價(jià)劉婷2（綜述）嚴(yán)文華3（審校）【摘要】DNA甲基化（DNAmethylation）是目前研究先天性心臟病發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)。

某些基因的異常甲基化可引起相關(guān)的心臟畸形及綜合癥。

隨著DNA甲基化檢測水平的提高，DNA甲基化的檢測可為先天性心臟病的早期臨床診治提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】先天性心臟病，DNA甲基化，表觀遺傳學(xué)，直接測序法EvalutionofthedetectionofDNAmethylationinthepathogenesisofcongentialheartdiseaseLIUTing，YANWen-hua.DepartmentofPaediatrics,SoochowUniversityAffiliatedChildren’sHospital,Suzhou215005,China.【Abstract】DNAmethylationisthecongenitalheartdiseasepathogenesisresearchhotspot.Abnormalmethylationofcertaingenescancauseheartmalformationsandsyndromes.WiththeraiseofthelevelofdetectionofDNAmethylation,DNAmethylationdetectiontoprovideatheoreticalbasisfortheearlydiagnosisandtreatmentofcongenitalheartdisease.【Keywords】Congenitalheartdisease,DNAmethylation,Epigenetics,Directsequencing先天性心臟?。╟ongentialheartdisease,CHD）是新生兒出生缺陷最常見的疾病之一，是由胎兒期心臟、大血管發(fā)育異常而導(dǎo)致的心血管在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能及代謝上的異常。

在全世界范圍內(nèi)，活產(chǎn)嬰兒中CHD的發(fā)生率為0.4%至5%，在流產(chǎn)或死胎的胎兒中發(fā)生率更高6～9。

多年研究已經(jīng)證實(shí)，先天性心臟病是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而引起的多基因異常的疾病,其中遺傳因素是主要因素。

經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為，DNA遺傳信息受損如：

序列突變、缺損、插入，等缺陷將導(dǎo)致先心病的發(fā)生，而近年來，隨著現(xiàn)代遺傳學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，對先心病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識進(jìn)入了一個(gè)新的層次：

現(xiàn)代遺傳學(xué)認(rèn)為，除DNA序列包含遺傳信息外，DNA、組蛋白或是染色體水平的修飾水平及方式，也可在在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中穩(wěn)定遺傳，并且修飾水平異?？赏ㄟ^影響心臟發(fā)育的重要基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。

如：

DNA甲基化、乙?；?、組蛋白修飾等。

其中，DNA甲基化是哺乳動物基因組發(fā)生的最為常見的一種表觀遺傳學(xué)事件，因此，研究DNA的甲基化與先天性心臟病的關(guān)系，成為當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)的關(guān)注熱點(diǎn)，本文就DNA甲基化與先天性心臟病的發(fā)病關(guān)系進(jìn)行綜述。

一、DNA甲基化的定義及分子基礎(chǔ)1.1、定義及機(jī)制DNA甲基化(DNAmethylation)是表觀遺傳學(xué)研究最深入的一種機(jī)制，它是一種酶介導(dǎo)的化學(xué)修飾過程，通過將S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，并在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的催化下，CpG二核苷酸中的胞［1］，在我國活產(chǎn)新生兒中CHD的發(fā)生率為1工作單位:蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院心內(nèi)科郵編2150052在讀研究生3通訊作者嘧啶環(huán)上的5位置的氫被活性甲基所取代，從而轉(zhuǎn)變成5-甲基胞嘧啶（5mC，5-methylcytosine）。

這種修飾通常發(fā)生在未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌(cytosine-phosphateguanosine,CpG)位點(diǎn)的胞嘧啶上。

研究表明，基因組上調(diào)控啟動子區(qū)域中有某些區(qū)域CpG位點(diǎn)高度聚集，其序列的長度大于200個(gè)堿基，這些區(qū)域被命名為CpG島。

啟動子區(qū)域CpG島的甲基化水平可調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。

通常大部分基因，生理情況下啟動子區(qū)域CpG島多以非甲基化形式存在,使基因能夠正常表達(dá)。

當(dāng)其發(fā)生甲基化時(shí),可影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,抑制基因表達(dá),導(dǎo)致許多細(xì)胞信號通路的阻斷，包括DNA復(fù)制、細(xì)胞周期調(diào)控等。

DNA甲基化形式是在胚胎期器官發(fā)育過程中的特定時(shí)期建立的。

除印記基因外，基因組DNA在受精完成后，經(jīng)歷廣泛的脫甲基化，并在受精卵種植階段經(jīng)歷DNA的從頭甲基化，從而使生后及成年期各器官、組織基因組DNA是呈現(xiàn)器官特異性的甲基化形式。

當(dāng)基因組DNA的甲基化模式在胎兒發(fā)育時(shí)期發(fā)生紊亂，可導(dǎo)致基因的異常表達(dá)，影響心臟及血管的發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。

1.2.DNA甲基化的影響因素這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列,但它明確調(diào)控了基因的表達(dá)。

影響DNA甲基化的因素主要是組蛋白甲基化、DNMT（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）、RNA干擾、飲食等。

二、DNA甲基化與先天性心臟病關(guān)系的研究先天性心臟病的病因目前還不能完全被闡明,但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,除了少數(shù)先天性心臟病是單基因突變和染色體畸變引起的,大多數(shù)先天性心臟病屬于多基因遺傳病,是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用引起的，心臟發(fā)育是一系列基因、轉(zhuǎn)錄因子在時(shí)間、空間上高度協(xié)調(diào)配合而共同完成的，其發(fā)育過程中的某些關(guān)鍵基因啟動子區(qū)域甲基化的異常改變，將影響心臟的發(fā)育，因此，尋找DNA甲基化的靶基因，將有助于了解先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步干預(yù)提供有用的分子靶標(biāo)。

目前與先心病發(fā)生相關(guān)的甲基化基因研究敘述如下：

2.1T-box轉(zhuǎn)錄因子家族該基因家族存在一個(gè)高度保守序列，即18－aa特異性DNA末端結(jié)合區(qū)域，稱為T－box。

T－box家族分為5個(gè)不同的亞家族，在脊椎動物心臟中表達(dá)的主要有TBX1和TBX2亞家族，其中與心臟發(fā)育相關(guān)的基因主要是TBX1亞家族的TBX1、TBX18、TBX20及TBX2亞家族中的TBX2、TBX3、TBX5人類TBX1基因定位于22q11.2，參與胚胎心臟發(fā)育，在心月牙、原始心肌和原始次級心區(qū)中表達(dá)，參與流出道心肌細(xì)胞增殖。

TBX1基因突變可導(dǎo)致DiGeorge綜合征的發(fā)生，該病累及多個(gè)器官，心臟畸形主要為心臟神經(jīng)嵴遷移異常所致，包括：

主動脈離斷、永存動脈干（Persistenttruncusarteriosus，PTA）、法洛四聯(lián)癥（TetralogyofFallot，TOF）、右室雙出口和大動脈換位基因敲除小鼠表現(xiàn)為類似DiGeorge綜合征的咽弓及心臟畸形。

人ASH2L基因是果蠅ash2的同源基因,ASH2L所在的復(fù)合體具有H3-K4甲基化酶活性。

JasonZStollerTBX1轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而影響心臟的發(fā)育。

TBX5基因定位于12q24.1，DNA全長2133bp，含有8個(gè)外顯子，編碼518個(gè)氨基酸。

Hateher[5]等對胚胎和成人心臟TBX5的表達(dá)情況的研究表明，TBX5在4個(gè)心腔的心外膜和心肌細(xì)胞核中表達(dá)，且還在左心室的心內(nèi)膜層表達(dá)。

TBX5已被［2］。

［3］。

TBX1［4］等研究證實(shí)，Ash2l(含組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(HMT)復(fù)合物)參與依賴于確認(rèn)為HoltOmm綜合征(HOS)的致病基因。

HOS-又稱心手綜合征，屬常染色體顯性遺傳病，患者表現(xiàn)為以房間隔缺損(ASD)為主的心臟異常及上肢不同部位、不同程度的畸形。

BassonCTASD多見，也可并存多種畸形如大血管錯(cuò)位、TOF等復(fù)雜畸型。

近年來有關(guān)TBX5與表觀遺傳調(diào)控之間的關(guān)聯(lián)研究表明，TBX5通過結(jié)合增強(qiáng)子，與其他心臟特異轉(zhuǎn)錄信號和染色體修飾酶例如HATs，調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因表達(dá)色譜(DHPLC)技術(shù)和甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法分析單純性CHD患者TBX5基因啟動子區(qū)域的突變及甲基化情況，結(jié)果表明TBX5基因啟動子區(qū)域的突變、甲基化可能不是引起TBX5基因表達(dá)下調(diào)的原因，由于樣本量有限，故可能未檢測到有意義的突變，有待于擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

2.2CHD7人類CHD7基因位于染色體8q12．1，編碼一個(gè)含有2997個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。

VissersCHARGE綜合征患者常合并CHD，其中最常見的是法洛氏四聯(lián)癥(約占33％)。

CHD7屬于ATP依賴性染色體重構(gòu)蛋白，該種蛋白調(diào)控DNA包裝蛋白的運(yùn)動以影響特定基因的可及性，而基因的可及性可控制細(xì)胞的命運(yùn)。

Wysocka實(shí)驗(yàn)室利用爪蟾胚胎研究發(fā)現(xiàn)，抑制CHD7表達(dá)或其活性會影響神經(jīng)脊細(xì)胞的遷移能力，產(chǎn)生的蝌蚪表現(xiàn)出類人CHARGE綜合癥的畸形。

神經(jīng)脊細(xì)胞在發(fā)育早期一部分折疊成一個(gè)將來發(fā)育成脊髓和大腦的管狀結(jié)構(gòu)。

神經(jīng)脊細(xì)胞在神經(jīng)管接縫處形成，并快速遷移到身體各個(gè)部位，形成心臟組織、外周神經(jīng)系統(tǒng)及身體其它部分。

Schnetz不連續(xù)區(qū)域，對每一種細(xì)胞類型來說都具有特異性，CHD7的細(xì)胞特異性結(jié)合區(qū)與一組甲基化組蛋白H3賴氨酸4(H3K4me)有關(guān)聯(lián)。

Vermeulen組蛋白H3賴氨酸4(H3K4me3)是一種在活躍基因上發(fā)現(xiàn)的特殊甲基化標(biāo)志，它為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子TFIID提供了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，從而支持轉(zhuǎn)錄激活，組蛋白H3賴氨酸4發(fā)生甲基化可以改變基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因突變。

2.3LINE1該基因是哺乳動物基因組廣泛分布的散布性長核酸元件(longinterspersednucleotideacidselement-1,L1)，已發(fā)現(xiàn)L1與多種生物學(xué)現(xiàn)象有關(guān)聯(lián)，包括基因突變，X染色體失活，等位基因排斥，基因組重排，基因表達(dá)沉默，腫瘤發(fā)生，生物進(jìn)化等。

L1基因全長5～7kb,反轉(zhuǎn)座子長約6kb，5端為約910bp的非翻譯區(qū)(5UTR),其后為兩個(gè)蛋白的編碼區(qū)(ORF1和ORF2)，兩ORF之間為63bp的連接區(qū)，3端為約205bp的非翻譯區(qū)(3UTR)，末端是長度多變的多聚A尾。

L1甲基化狀態(tài)的改變已在結(jié)腸癌、神經(jīng)管缺陷和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中廣泛發(fā)生且被證實(shí)。

WeiSheng風(fēng)險(xiǎn)。

ShimulChowdhury此，LINE-1可能作為早期診斷，判斷胎兒TOF發(fā)生可能性。

2.4JAG1基因該基因編碼Notch家族受體配體蛋白jagged1蛋白，該基因在人類胚胎發(fā)育中起著重要作用，且主要在心血管系統(tǒng)表達(dá)，突變率較高，目前已發(fā)現(xiàn)有200余種突變存在。

該基因突變在大多數(shù)Alagille綜合征（AGS）中被發(fā)現(xiàn)，被證實(shí)是AGS致病基因，其中90%以上常合并心血管異常，大多數(shù)表現(xiàn)為肺動脈狹窄、法洛四聯(lián)癥等右心發(fā)育缺陷。

族性法洛四聯(lián)癥。

國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)Notch1及其配體JAG1基因低甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但該基因啟動子發(fā)生甲基化與先心病是否相關(guān)仍有待于進(jìn)一步研究。

［6］等研究發(fā)現(xiàn)TBX5突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟畸形，以［7］。

國內(nèi)采用高效液相［8］等首次證實(shí)該基因是CHARGE綜合征的易感基因。

［9］等研究指出CHD7基因突變可引起心肌缺陷。

CHD7定位于染色體的［10］等發(fā)現(xiàn)甲基化［11］等證實(shí)LINE-1低甲基化水平會增加發(fā)生TOF［12］等證實(shí)產(chǎn)婦LINE-1DNA甲基化與CHDs相關(guān)，因［13］有報(bào)道JAG1基因突變引起家2.5NKX2-5該基因定位于染色體5a35，含2個(gè)外顯子，編碼324個(gè)氨基酸，是同源盒基因家族中的重要成員,它主要通過同源結(jié)構(gòu)域(homodomain,HD)與目的基因中相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄因子啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，在胚胎發(fā)育和器官形成過程中發(fā)揮重要作用。

NKX2-5是心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子，高度保守，是脊椎動物心臟育生中較早表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，是心臟祖細(xì)胞最早的標(biāo)志物，貫穿心臟發(fā)育的整個(gè)過程。

NKX2-5自胚胎發(fā)育第7.5天開始持續(xù)表達(dá),其正常表達(dá)對心臟的環(huán)化、心房及心室發(fā)育、動脈干分隔、房室瓣形成及房室傳導(dǎo)的維持均起重要作用。

NKX2-5基因敲除小鼠表現(xiàn)為環(huán)化后的心臟發(fā)育停滯、血管發(fā)育異常，并在心臟完全環(huán)化前死亡。

因此，可表明NKX2-5對于哺乳動物心臟的正常發(fā)育十分關(guān)鍵[14]。

臨床研究顯示，NKX2-5基因在法洛四聯(lián)癥和房間隔缺損患者中有4%突變率。

近年來，從表觀遺傳學(xué)角度探討，該基因在先心病中的作用機(jī)制，成為熱點(diǎn)。

馬端性圓錐干下畸形發(fā)病密切相關(guān)。

NKX2-5可能通過調(diào)節(jié)Jarid2(Jarid2/Jmj)表達(dá)參與組蛋白去甲基化和甲基化的表觀遺傳調(diào)控2.65，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(methylenetrahydrofolatereductase,MTHFR)位于染色體1p36.3,編碼區(qū)整個(gè)長度為1980bp,其cDNA序列長度為2200bp。

MTHFR基因由11個(gè)外顯子組成,長度為102～432bp不等,編碼具有活性的蛋白相對分子質(zhì)量約為70000。

MTHFR是甲硫氨酸-葉酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶,可將體內(nèi)的5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，為體內(nèi)葉酸主要活性形式。

5-甲基四氫葉酸一方面作為細(xì)胞內(nèi)一碳單位的載體，參與嘌呤和嘧啶的合成，并為DNA、RNA和蛋白質(zhì)的甲基化提供甲基，從而影響DNA的合成和修復(fù)；另一方面作為甲基供體，在甲硫氨酸合酶催化下，以維生素B12為輔酶，使血中同型半胱氨酸發(fā)生再甲基化，生成甲硫氨酸，從而維持血中同型半胱氨酸正常水平活性能夠保持循環(huán)葉酸和甲硫氨酸池的有效性，保證DNA合成和甲基化的正常進(jìn)行。

MTHFR基因突變可使酶活性降低，則導(dǎo)致5-甲基四氫葉酸生成障礙，血漿同型半胱氨酸水平高，引起DNA合成和甲基化異常，從而導(dǎo)致包括心血管疾病、巨幼細(xì)胞性貧血、高同型半胱氨酸血癥及胚胎發(fā)育異常等多種疾病的發(fā)生，特別是神經(jīng)管缺陷和CHD許多研究證實(shí)MTHFR基因的多態(tài)性與先天性動脈導(dǎo)管未閉、房間隔缺損的發(fā)生密切相關(guān)。

張文迪基因啟動子甲基化水平與先心病的關(guān)聯(lián)，表明該基因啟動子區(qū)域發(fā)生超甲基化可導(dǎo)致先心病。

2.7GATA-4該基因位于染色體8p23．1～p22．包括7個(gè)外顯子，編碼442個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為44627u。

該基因是與心臟發(fā)育密切相關(guān)的一種特定細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，屬于鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，含有DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域。

DNA結(jié)合區(qū)由兩個(gè)位于羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)和鄰近C末端堿性氨基酸富集區(qū)組成。

在中胚層和內(nèi)胚層起源的組織中廣泛表達(dá)，通過與其他轉(zhuǎn)錄因子如，血漿應(yīng)答因子（SRF）、NKX2.5等相互作用，調(diào)控心肌中特異的基因表達(dá)。

Garg[19]等研究表明，該基因突變可導(dǎo)致先心病-室間隔缺損的發(fā)生。

ZeisbergGATA4可調(diào)節(jié)心肌的增值，并且對右心室和房室管的發(fā)育具有特殊的階段效應(yīng)。

GATA4表達(dá)減少，將導(dǎo)致ASD、VSD、TOF等各種先心病。

GATA-5是心臟原基胚胎中線的遷移和內(nèi)胚層的形態(tài)所需的。

GATA-5的過度表達(dá)引起包括心肌基因NKX2-5和產(chǎn)生病灶的搏動心肌組織異常的表達(dá)。

在斑［15］等研究表明NKX2-5基因啟動子甲基化可能與先天［7］。

［16］。

正常的MTHFR［17］。

［18］等采取MSP（甲基化特異性PCR）方法研究MTHFR［20］等研究發(fā)現(xiàn)，心肌的馬魚模式動物研究中表明GATA-5控制斑馬魚生長、形態(tài)發(fā)生和心臟及內(nèi)胚層的分化，并指出GATA-5調(diào)節(jié)心肌早期基因NKX2-5的表達(dá)基因小鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，GATA-4和GATA-5表達(dá)減少可致心室壁變薄。

GATA-5第二等位基因的缺失可導(dǎo)致房間隔缺損，室間隔缺損，心內(nèi)膜墊缺損等心臟畸形。

因此，辛格等得出：

GATA-4和GATA-5在心臟發(fā)育中起關(guān)鍵角色，但GATA-5在這個(gè)過程中確切機(jī)制，需進(jìn)一步研究。

Akiyama,Y動子發(fā)生了甲基化。

GATA-5啟動子甲基化和過度表達(dá)，在胰腺癌中有報(bào)道。

同時(shí)GATA4/5在胃低度上皮內(nèi)瘤變和不典型增生中研究發(fā)現(xiàn)成高頻率的甲基化狀態(tài)化水平與先心病相關(guān)性未見有報(bào)道，仍需進(jìn)一步探討。

2.8NOX5基因?qū)儆贜ADPH氧化酶家族一員，該家族有七個(gè)成員，目前從血管及內(nèi)皮分離出的有NOX1、2、4、5，其中NOX5發(fā)現(xiàn)時(shí)間短，研究較少，已有研究顯示該基因主要調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子生成等。

國內(nèi)研究NOX基因在缺血性心肌病患兒中表達(dá)上調(diào)。

CHUNZHU平與先天性心臟病相關(guān)性，證實(shí)該基因在室間隔缺損患兒中CPG島呈超甲基化水平（先心患兒甲基化水平為66.67%，而正常兒童中為20%）。

2.9PLAGL1基因抑癌基因PLAGL1定位于人染色體6p24-25，編碼一種含有鋅脂機(jī)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子。

PLAGL1具有廣泛的抗細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤生長的功能。

國內(nèi)外研究均表明該基因表達(dá)下降與胃癌、乳腺癌、骨肉瘤等發(fā)生密切相關(guān)。

ChaoXuan蛋白質(zhì)編碼的外顯子2發(fā)生了同義突變，也許單純VSD發(fā)病機(jī)制與這種突變無直接關(guān)聯(lián)，可能與PLAGL1基因表達(dá)其他調(diào)控模式相關(guān)比如甲基化依賴模式。

三、DNA甲基化檢測方法新進(jìn)展隨著DNA甲基化與諸多疾病相關(guān)性的深入研究，各種甲基化檢測方法被相繼開發(fā)。

目前臨床上進(jìn)行大規(guī)模分析多重CpG島的方法包括:限制性標(biāo)記基因組掃描、特定的甲基化雜交、DNA微陣列法等，但在處理樣本時(shí)尚存在一些實(shí)際問題，如由于在甲基化和非甲基化等位基因中雜交效率的不同而降低了探針的分辨能力，且這些檢測方法有損于先進(jìn)的芯片學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，使其應(yīng)用受到限制。

以下是常用的甲基化檢測方法。

3.1直接測序法用重亞硫酸鹽處理DNA，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?而甲基化的胞嘧啶不變,然后用不含任何CpG位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增時(shí)區(qū)分甲基化或非甲基化。

擴(kuò)增后尿嘧啶全部轉(zhuǎn)為胸腺嘧啶，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，且與未處理的序列比較，根據(jù)缺失條帶判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。

該方法可靠性和精確性均較高，且能明確目的片段中每一個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。

缺點(diǎn)是需要大量的克隆測序，操作過程繁雜，費(fèi)用較高。

3.2MSP(甲基化特異性的PCR法)先將DNA用重亞硫酸鹽處理,隨后進(jìn)行引物特異性的PCR。

該方法核心是設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)出的特異性引物與含有一個(gè)或多個(gè)CpG位點(diǎn)的待測序列結(jié)合，根據(jù)待測序列是否發(fā)生甲基化，則用相應(yīng)的引物擴(kuò)增出片段。

該法的優(yōu)點(diǎn)是:快速敏感性高,可用于超微量及同源分析,特異性接近100%,而且可用于石蠟包埋［21］。

辛格[22]等在轉(zhuǎn)［23］等研究表明GATA-4，5在結(jié)直腸癌（CRC）和胃癌中發(fā)生啟［24］的超甲基化現(xiàn)象在人類腫瘤中普遍存在，GATA-4［25］。

GATA4/5啟動子甲基［26］等研究該基因啟動子甲基化水［27］等通過病例對照研究，發(fā)現(xiàn)在中國單純VSD病人中PLAGL1樣品的檢測分析。

缺點(diǎn)是引物設(shè)計(jì)要求高，可靠的MSP引物設(shè)計(jì)需包含兩個(gè)或多個(gè)完全甲基化或非甲基化的CpG位點(diǎn)，只能做定性研究,不能作為定量檢測存在。

存在重亞硫酸處理不完全導(dǎo)致的假陽性問題。

3.3結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combinedbisulfaterestrictionanylysis,COBRA)，該方法是先后對樣本DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理、PCR擴(kuò)增，處理后原甲基化的胞嘧啶被保留,而非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぁ?/p>

然后利用限制性內(nèi)切酶BstUI（CGCG）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切割,來識別DNA甲基化的狀況。

該方法的優(yōu)點(diǎn):不需要預(yù)先知道CpG位點(diǎn)及樣本序列;可進(jìn)行甲基化水平定量研究;所需樣本量少,可用于石蠟包埋樣本的分析。

缺點(diǎn)：

只能獲得特殊酶切位點(diǎn)甲基化的情況,檢測陰性不能排除樣本存在DNA甲基化的可能，由于限制性內(nèi)切酶和PCR的使用，序列分析受到限制。

3.4甲基化敏感性斑點(diǎn)分析(methylation-sensitivedotblotassay,MS-DBA)，該方法是先用重亞硫酸鹽處理標(biāo)本DNA片段,而后以非CG區(qū)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,用3端DIG標(biāo)記的含有2個(gè)CG或TG的雙核苷酸探針與DNA雜交,然后用帶有熒光標(biāo)記的抗DIG抗體與之反應(yīng),通過比較斑點(diǎn)上熒光的強(qiáng)度進(jìn)行甲基化水平的定量。

該方法能夠定量或半定量分析樣本甲基化水平，簡便易行,能檢測多種樣本。

但檢測序列不能過長，若重亞硫酸鹽處理不完全或探針錯(cuò)誤雜交,則可能出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果3.5甲基化特異性多連接依賴性探針擴(kuò)增(Methylation-Specificmultiplexligation-dependentprobeamplification，MS-MLPA)法，用MS-MLPA探針與標(biāo)本DNA進(jìn)行雜交形成DNA-探針復(fù)合物,然后加入連接酶及甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶,如果DNA中被識別的CpG位點(diǎn)存在甲基化,則探針順利連接,PCR照常進(jìn)行;若為非甲基化,則兩個(gè)寡核苷酸鏈不能連接,復(fù)合物將消化而不能擴(kuò)增。

其優(yōu)點(diǎn)是所需的樣本數(shù)量少,可分析大量的混合樣本，可用于定量檢測。

缺點(diǎn)是探針連接位點(diǎn)受限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的限制,還要考慮所用酶的適宜反應(yīng)溫度。

綜上所述,DNA甲基化在人類先心病發(fā)病機(jī)制究中起重要作用。

探討其發(fā)病機(jī)制，可以為從事該項(xiàng)目研究的科研人員提供有價(jià)值的參考以及為先心病的早期臨床診治提供理論依據(jù)。

隨著DNA甲基化檢測技術(shù)的提高,先心病的甲基化檢測將得到有力的技術(shù)支持。

但是由于樣本量有限，以及無法準(zhǔn)確獲得心肌組織等諸多外因，無法明確外周血甲基化情況可否真實(shí)反映心肌組織甲基化水平。

同時(shí)先心病的是多因素相互作用的復(fù)雜疾?。òōh(huán)境因素，母體因素等），甲基化靶基因存在時(shí)空表達(dá)差異，故就增加了先心病診斷和治療的復(fù)雜性，故DNA甲基化在揭示先心病發(fā)病機(jī)制的價(jià)值需進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]HoffmanJI,KaplanS.Theincidenceofcongenitalheartdisease[J].JAmCollCardiol.2002,12:1890-1900.[2]GreulichF,RudatC,KispertA.MechanismsofT-boxgenefunctioninthedevelopingheart.CardiovascRes.2011,91(2):212-22.[3]HermanSB，GuoT，McGinn,DM,etal.OvertcleftpalatephenotypeandTBX1genotypecorrelationsinvelo-cardio-facial/DiGeorge/22q11.2deletionsyndromepatients.AmJMedGenetA.2012.158A(11):2781-7.[4]StollerJZ，HuangL，TanCC,etal.Ash2linteractswithTbx1andisrequired［28］。

duringearlyembryogenesis.ExpBiolMed(Maywood).2010,235(5):569-76.[5]HatcherCJ，GoldsteinMM，MahCS，etal．Identiflcationandlocaliza-tionofTBX5transcriptionfactorduringhumancardiacmorphogenesis．DevDyn.2000,219：

9095．[6]McDermottDA，F(xiàn)ongJC，BassonCT,etal.1993，Holt-OramSyndrome.[7]VallasterM，VallasterCD，WuSM.Epigeneticmechanismsincardiacdevelopmentanddisease.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai).2012,44(1):92-102.[8]DamienS,AlanV.CHARGEsyndrome:anupdae[外文期刊]2007(4)[9]SchnetzMP，BartelsCF，ShastriK,etal.GenomicdistributionofCHD7onchromatintracksH3K4methylationpatterns.GenomeRes.2009,19(4):590-601.[10]VemeulenM，MuIderKW，DenissovS，eta1．Selectiveancho-ringofTFIIDtonucleosomesbytrimethylationofhistoneH3lysine4.Cell.2007,131(1)：

5869．[11]ShengW，WangH，MaX,etal.LINE-1methylationstatusanditsassociationwithtetralogyoffallotininfants.BMCMedGenomics.2012,5:20.[12]ChowdhuryS,ClevesMA,MacLeodSL,etal.MaternalDNAhypomethylationandcongenitalheartdefects.BirthDefectsResAClinMolTeratol.2011,91(2):69-76.[13]EldadahZA,HamoshA,BieryNJ,etal.FamilialTetralogyofFallotcausedbymutationinthejagged1gene.HumMolGenet.2001,10(2):163-9.[14]UeyamaT，KasaharaH．IshiwataT，eta1．Myocardinexpressionisreg-ulatedbyNkx2.5，anditsfunctionisrequiredforcardiomyogenesis．MolCellBiol.2003,23：

92229232．[15]盛偉,王慧君,馬曉靜等.先天性心臟病圓錐動脈干畸形NKX2-5基因CpG島甲基化狀態(tài)分析[J].中國產(chǎn)前診斷雜志（電子版）.2010,02(3):12-16.[16]FrisoS,ChoiSW,GirelliD,etal.Acommonmutationinthe5,10-methylenetetrahydrofolatereductasegeneaffectsgenomicDNAmethylationthroughaninteractionwithfolatestatus[J].ProcNatlAcadSciUSA.2002,99(8):560625611.[17]BlomHJ，SmuldersY．Overviewofhomocysteineandfolatemetabolism．Withspecialreferencestocardiovasculardiseaseandneuraltubeefects［J］．JInheritMetabDis.2011,34(1):75－81.[18]張文迪.MTHFR啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)與先天性心臟病的關(guān)系[D].華中科技大學(xué).2010.[19]GargV,KathiriyaIS,BarnesR,etal.GATA4mutationscausehumancongenitalheartdefectsandwithTBX5[J].Nature.2003,424(6947):443-447.DOI:10.1038/nature01827.[20]ZeisbergEM,MaQ,JuraszekAL,etal.MorphogenesisoftherightventriclerequiresmyocardialexpressionofGata4.JClinInvest.2005,115