klf2、klf4預(yù)測(cè)內(nèi)毒素所致急性肺損傷大鼠的研究

1/1klf2、klf4預(yù)測(cè)內(nèi)毒素所致急性肺損傷大鼠的研究KLF2、KLF4預(yù)測(cè)內(nèi)毒素所致急性肺損傷大鼠的研究【摘要】目的研究Krppel樣轉(zhuǎn)錄因子KLF2、KLF4在內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷時(shí)的動(dòng)態(tài)表達(dá)，分析兩者與急性肺損傷的相關(guān)性。

方法將100只SD大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為健康對(duì)照組和模型組，模型組進(jìn)一步隨機(jī)分成3組。

模型組采用尾靜脈注射LPS（5mg/kg）復(fù)制ALI模型，分別于尾靜脈注射后2、4、24h后采血及肺組織。

觀察各組病理表現(xiàn)、RT-PCR檢測(cè)KLF2mRNA、KLF4mRNA在血清中及肺組織的表達(dá)，分析KLF2、KLF4在急性肺損傷中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié)果病理顯示造模后4h肺損傷最為明顯，KLF2mRNA、KLF4mRNA在正常大鼠肺組織及血清中均有明顯表達(dá)，模型組各組KLF2、KLF4的表達(dá)較對(duì)照組顯著減弱（P0.01），其中KLF2mRNA在2h表達(dá)明顯低于4h組和24h組（P0.01），KLF4mRNA在4h表達(dá)明顯低于2h組和24h組（P0.01）。

結(jié)論KLF2在大鼠急性肺損傷表達(dá)變化早于病理變化，KLF4具有同步性；KLF2、KLF4可作為急性肺損傷早期診斷的分子標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】KLF2；KLF4；急性肺損傷；內(nèi)毒素；早期診斷StudytherolesofKLF2，KLF4inpredictionofacutelunginjuryinratsinducedbyendotoxinYangYong，ShenYoukui，DongLiwen，LouZhengqing，WangJun，F(xiàn)uXiaoqing.DepartmentofCardiothoracicSurgery，GuangxinAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310007，ChinaCorrespondingauthor：

ShenYoukui，Email：

shenyoukui@126.com【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionsofKLF2mRNAandKLF4mRNAintheacutelunginjury（ALI）ratsinducedbylipopolysaccharide（LPS），andtoanalyzethecorrelationbetweenKLF2，KLF4andALI.MethodsAtotalof100SDratswererandomlydividedinto2groups：

normalcontrolgroupandLPStreatedgroup，thenthelattergroupwasrandomlyfurtherdividedinto3subgroupsaspertheserumandlungtissuesamplestakenseparatelyat2，4and24haftermodeling.TheALImodelwasmadebyinjecting5mg/kgLPSintotailvein.Thepathologicalchangesoflungtissuewereobservedineachgroup，andtheexpressionsofKLF2，KLF4mRNAinserumandlungtissueweredetectedbyRT-PCR.ThedataoflaboratoryfindingswereanalyzedwithSPSS17.0softwareforstatisticalanalysis.ResultsThehistopathologicalchangesshowedthemostobviousdamageoflungtissueoccurredat4hoursaftermodeling.TheexpressionsofKLF2mRNAandKLF4mRNAinthelungtissueandserumofcontrolgroupweresignificantlyhighercomparedtoLPStreatedsubgroups（P【Keywords】KLF2；KLF4；Acutelunginjury；Endotoxin；Earlydiagnosis急性肺損傷（acutelunginjury，ALI）是源于直接或間接的急性進(jìn)行性肺泡毛細(xì)血管膜的炎癥性損傷，臨床表現(xiàn)為頑固性低氧血癥、進(jìn)行性加重的呼吸困難和非心源性肺水腫等，隨著病情發(fā)展進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙院粑狡染C合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS），ARDS是臨床中發(fā)病率和病死率都很高的一種疾病。

目前臨床上主要根據(jù)其病理生理改變和臨床表現(xiàn)，采取綜合性治療措施[1-4]，但其發(fā)病率和病死率仍居高不下。

因此預(yù)防和治療此疾病在臨床中具有重要的意義。

KLF2，KLF4是鋅指Krppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)KLF2，KLF4在許多肺部疾病中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)情況，在許多肺部疾病的發(fā)病中可能具有關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)試圖通過觀察急性肺損傷大鼠血清及肺組織中KLF2，KLF4的動(dòng)態(tài)表達(dá)，探討其早期診斷急性肺損傷的可行性。

1材料與方法1.1動(dòng)物健康成年SD大鼠100只，雌雄不拘，體質(zhì)量（25020）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要儀器與試劑脂多糖（LPS，EscherichiacoliO127：

B8，L3129，Sigma，美國(guó)）；RM-80呼吸頻率監(jiān)測(cè)器（美國(guó)Columbus公司），ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國(guó)ABI公司），TotalRNAExtractionReagent（Trizol）購自杭州碩盟生物，ReverTraAceqPCRRTkit購自TOYOBO公司，Bestar-RealTimePCRMasterMix（SYBRGreen染料法）購自德國(guó)DBIBioscience公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)前期研究結(jié)合文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道，將100只SD大鼠隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字法）分為正常對(duì)照組（A組，n=10）和模型組（n=90），其中模型組被進(jìn)一步隨機(jī)分成三組：

B組（造模2h，最初階段，ALI形成，n=30），C組（造模4h、ALI高峰組，n=30），和D組（造模24h，ALI減輕組，n=30）。

1.4模型復(fù)制采用尾靜脈注射LPS復(fù)制ALI模型，劑量均為5mg/kg。

對(duì)照組尾靜脈注射1mL生理鹽水。

用2.5%戊巴比妥（2mL/kg）在大鼠腹腔注射麻醉后開胸；心臟取血制備血清，分離后置于-80℃冰箱保存待檢；取右肺上葉制作肺組織勻漿，-80℃冰箱保存待檢；取右下葉肺組織馬上備檢，用于肺濕/干質(zhì)量比測(cè)定；取左下葉肺組織以10%甲醛固定24h，用于病理組織檢查。

1.5呼吸頻率的測(cè)定處死大鼠前用呼吸頻率監(jiān)測(cè)器測(cè)定大鼠的呼吸頻率。

1.6肺組織含水量測(cè)定取右下葉肺組織，濾紙吸干表面水分，置于干燥稱量紙上稱得濕質(zhì)量（W），置70℃恒溫箱，烘烤至恒重后稱量干質(zhì)量（D），以濕重干質(zhì)量（W/D）比值表示肺組織含水量。

1.7肺臟組織學(xué)觀察取左下葉肺放入10%甲醛溶液固定，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

任選10個(gè)視野從五項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行肺損傷評(píng)分，累加各項(xiàng)評(píng)分取其平均值作為ALI的病理評(píng)分，見表1。

1.8KLF2mRNA的表達(dá)測(cè)定采用SYBRGreen染料法相對(duì)定量PCR對(duì)肺組織及血清分別進(jìn)行檢測(cè)。

選用3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，采用PrimerExpress2.0和Beacondesigner軟件進(jìn)行熒光引物的設(shè)計(jì)，然后由浙江大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)合成，序列如表2。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，以SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。

多組間比較采用One-wayANOVA方差分析，組間差異采用LSD檢驗(yàn)方法。

以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果2.1一般情況變化試驗(yàn)前各組動(dòng)物在靜息狀態(tài)下呼吸平穩(wěn)，頻率為60次/min左右，實(shí)驗(yàn)組在注入脂多糖后逐漸出現(xiàn)呼吸急促、煩躁，2h左右出現(xiàn)呼吸窘迫狀，輕度發(fā)紺，呼吸頻率增加，4h后發(fā)紺明顯，頻率100次/min左右。

24h時(shí)大鼠無明顯發(fā)紺，呼吸頻率仍較快。

統(tǒng)計(jì)顯示B、C、D組較A組呼吸頻率均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），C組呼吸頻率較B、D組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），見表3。

2.2肺組織含水量改變模型各組濕干比重較對(duì)照組均有明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），C組肺組織濕干比重較B、D組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），見表3。

2.3肺組織病理改變健康對(duì)照組：

肺組織結(jié)構(gòu)清晰、肺泡壁薄且光滑，肺泡間隔均勻一致；B組：

肺泡腔輕度變窄，部分肺泡壁增厚，肺充血，肺間質(zhì)輕度水腫，小灶狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)；C組：

肺泡腔變窄或消失，腔內(nèi)可見炎細(xì)胞明顯增多，肺泡壁明顯增厚，肺充血，肺間質(zhì)水腫，炎細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)。

D組：

肺泡腔變窄，腔內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚，肺充血，肺間質(zhì)水腫，灶狀炎細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1。

B、C、D組較A組病理學(xué)評(píng)分均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），C組病理學(xué)評(píng)分較B、D組亦明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），見表2。

2.4KLF2、KLF4mRNA的表達(dá)2.4.1組織及血清中KLF2mRNA結(jié)果B、C、D組組織及血清中KLF2mRNA的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P2.4.2組織及血清中KLF4mRNA結(jié)果B、C、D組組織及血清中KLF4mRNA的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，其中B，C組與A組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），D組與A組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；C組KLF4mRNA的表達(dá)水平最低，與B、D組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。

見表4。

3討論急性肺損傷（ALI）的發(fā)生和發(fā)展涉及到多種病理生理過程，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡等。

其中炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激被認(rèn)為是ALI早期最主要病理生理機(jī)制[4，7]。

研究發(fā)現(xiàn)ALI在細(xì)胞水平上表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞（PMN）、肺巨噬細(xì)胞（AM）等炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)與激活，及血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的損傷；在分子水平上則表現(xiàn)為腫瘤壞死因子（NF-B）的活化及眾多促炎因子、黏附分子及趨化因子等的過度表達(dá)，并伴有多種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，炎性介質(zhì)所形成的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致肺組織廣泛損傷。

研究表明，ALI時(shí)PMN在肺內(nèi)大量聚集激活，釋放白介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF-）等多種介質(zhì)加重肺損傷[8]，從動(dòng)物模型證實(shí)，如果去除肺內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集，肺損傷程度會(huì)大大減輕[9-10]；AM的激活通常是肺部炎勝反應(yīng)發(fā)生的導(dǎo)火索。

激活的AM可致NF-B的過度活化、肺IL-1和TNF-等的合成和釋放[11]；肺血管EC既是受損的主要靶細(xì)胞，更是活躍的炎性反應(yīng)和效應(yīng)細(xì)胞，IL-1和TNF-等可激活血管EC，使其上調(diào)表達(dá)ICAM-1等黏附分子。

黏附分子通過影響炎性介質(zhì)、炎性細(xì)胞等向肺泡遷移即黏附于肺泡或血管EC的強(qiáng)度而調(diào)節(jié)ALI的進(jìn)程。

同時(shí)由巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在急性炎癥過程中的大量激活和呼吸爆發(fā)現(xiàn)象導(dǎo)致了大量的氧自由基的產(chǎn)生[12]，自由基可引起生物細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA等的直接和間接的損傷。

KLF2、KLF4為Krppel樣轉(zhuǎn)錄因子子家族中的成員，KLFs廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡，以及胚胎發(fā)育等多個(gè)生命活動(dòng)的調(diào)控[13-15]。

最近的研究表明轉(zhuǎn)錄因子KLF2、KLF4在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮著重要的作用。

Das等[16]研究證實(shí)KLF2可抑制單核細(xì)胞的促炎癥活性，在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在單核細(xì)胞中細(xì)胞因子活化和分化時(shí)KLF2的表達(dá)降低，而給予KLF2轉(zhuǎn)染可抑制脂多糖介導(dǎo)的促炎因子、細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)和減少噬菌作用。

相反，給予siKLF2干擾則增加炎癥基因的表達(dá)，顯示了KLF2是單核細(xì)胞活化的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子；而Fledderus等[17]研究發(fā)現(xiàn)KLF2可以抑制活化轉(zhuǎn)錄因子-2（ATF-2）的核內(nèi)活性，從而抑制促炎癥基因的表達(dá)，也表明KLF2具有重要的抗炎作用。

Mahabeleshwar等[18]研究發(fā)現(xiàn)KLF2具有抑制NF-B及低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）的表達(dá)作用，從而抑制炎癥及氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損害，是感染和內(nèi)毒素?fù)p傷的一個(gè)關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因子。

Feinberg等[19]發(fā)現(xiàn)KLF4在巨噬細(xì)胞的活化中具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化，提示KLF4可能是一個(gè)可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。

周智君等[20]研究發(fā)現(xiàn)KLF4在內(nèi)毒素血癥小鼠和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7株中能抑制炎癥介質(zhì)細(xì)胞因子白介素-1（IL-1）的表達(dá)，而IL-1是LPS刺激下的炎癥細(xì)胞分泌的早期炎癥介質(zhì)之一。

因此KLF2、KLF4可能是內(nèi)毒素所致急性肺損傷的關(guān)鍵調(diào)控因子。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與健康對(duì)照組相比，模型各組的呼吸頻率、干濕比及病理學(xué)評(píng)分均有明顯的增高；說明造模是成功的，并且各組在4h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，可以得出LPS所致ALI模型在4h肺損傷最為明顯。

通過RT-PCR檢測(cè)可以觀察到，KLF2在肺組織和血液中的表達(dá)情況是一致的，在正常對(duì)照組KLF2呈高表達(dá)，而在模型各組表達(dá)均降低，并在2h表達(dá)最低，可以得出KLF2的表達(dá)減弱早于ALI的形成。

而KLF4在肺組織和血液中的表達(dá)情況亦是一致的，在正常對(duì)照組KLF4亦呈高表達(dá)，而在模型各組表達(dá)亦均降低，并在4h表達(dá)最低，可以得出KLF4的表達(dá)減弱與ALI的形成具有同步性。

因此結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，KLF2在大鼠急性肺損傷表達(dá)變化早于病理變化，KLF4具有同步性；KLF2、KLF4可作為早期診斷急性肺損傷的分子標(biāo)志物。

同時(shí)KLF2、KLF4在ALI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的調(diào)控因子，通過抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥等作用來抑制急性肺損傷的形成。

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