CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞在人胎回腸的發(fā)育

1/1CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞在人胎回腸的發(fā)育CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞在人胎回腸的發(fā)育作者：

胡蓉,黃悅,蘇敏,李紅,姜俸蓉單位：

貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng)550004【摘要】目的探討CD20免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞在人胎回腸的分布、定位及發(fā)育。

方法收集因故終止妊娠人胎回腸30例，采用形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)SP法染色顯示CD20免疫反應(yīng)陽(yáng)性B細(xì)胞，用BioMias29圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，有關(guān)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié)果12周胎齡，回腸壁間充質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，單個(gè)散在分布，數(shù)量少。

14周胎齡，可見(jiàn)CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞染色深，反應(yīng)增強(qiáng)。

16周胎齡，CD20陽(yáng)性細(xì)胞散在或成群分布于絨毛中軸或深部結(jié)締組織內(nèi)。

18周胎齡，CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞聚集形成淋巴小結(jié)。

24周后，CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，大量細(xì)胞參與構(gòu)成集合淋巴小結(jié)。

結(jié)論人胎回腸B淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，12周開(kāi)始表達(dá)CD20分子。

隨胎齡增加，CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，參與構(gòu)成淋巴小結(jié)。

【關(guān)鍵詞】胎兒;回腸;CD20陽(yáng)性細(xì)胞;發(fā)育Abstract:ObjectiveTostudythedistribution,locationanddevelopmentofCD20positiveimmunoreactioncellsinhumanfetalileum.MethodsTotally30samplesofhumanfetalileumswerecollected.CD20positiveimmunoreactioncellsweredisplayedbyimmunohistochemicalultrasensitiveSPmethodandmorphology.TheimmunoreactivepositivecellswerecountedbyBioMias29photographanalysissoftwareandanalyzedbystatisticssoftware.ResultsAtthe12thgestationalweek(g.w),therewereafewCD20positiveimmunoreactioncells,distributedsinglelyinthemesenchymeoftheilealwall.Atthe14thg.w,theresponseintensityofCD20positivecellswasincreased.Atthe16thg.w，CD20positivecellsweredistributeddiffuselyorgatheredtogetherinthevilluscentralaxisorinthedeepconnectivetissueofmucosa.Atthe24thg.w，thenumbersofCD20positivecellswereincreaseddistinctlyandlymphoidnoduleswereformed.ConclusionTheexpressionsofCD20moleculebeganatthe12thg.wduringthedevelopmentofBlymphocytesinhumanfetalileum.TheCD20positiveimmunoreactioncellswereincreasedwiththegrowingoffetalageandbegantoparticipateintheformingoflymphoidnodules.Keywords:fetus;ileum;CD20positivecell;developmentB淋巴細(xì)胞是構(gòu)成回腸壁淋巴組織的重要成分，CD20分子是一種磷酸化蛋白質(zhì)分子，相對(duì)分子質(zhì)量為33000～37000，是B淋巴細(xì)胞表面分化抗原，主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)中起重要作用，常被用作鑒定B細(xì)胞的標(biāo)記[1]。

目前能夠特異性識(shí)別CD20陽(yáng)性B淋巴細(xì)胞的單克隆抗體研制成功，這使得應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究B淋巴細(xì)胞在人胎回腸淋巴組織中的定位、分布和發(fā)育成為可能[24]。

以往關(guān)于人胎回腸的研究主要涉及組織發(fā)生、集合淋巴小結(jié)的發(fā)育等方面，而對(duì)人胎淋巴細(xì)胞個(gè)體發(fā)育，特別是回腸CD20陽(yáng)性B淋巴細(xì)胞發(fā)育的研究報(bào)道較少[5]，因此，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法研究不同發(fā)育階段正常人胎回腸內(nèi)CD20陽(yáng)性B淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為人胎適時(shí)免疫的建立和疾病防治等相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1材料與方法1.1材料收集貴陽(yáng)市各醫(yī)院因故終止妊娠的人胎30例。

鼠抗人CD20單克隆抗體(mousemonoclonalantibodyantihumanCD20)來(lái)源于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，SP免疫組化染色試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.2方法1.2.1人胎胎齡計(jì)算所有人胎標(biāo)本均測(cè)量頂臀長(zhǎng)(crownrumplength，CRL),按Patten標(biāo)準(zhǔn)確定胎齡：

9～12周5例,CRL為39.0～79.0mm;13～16周7例，CRL為91.0～137.0mm;17～20周6例，CRL為147.0～185.0mm;21～24周6例，CRL為197.0～230.0mm;25～28周6例，CRL為240.0～270.0mm。

1.2.2取材、制片和染色各例均取回腸，用10%Formalin固定，經(jīng)乙醇梯度脫水，透明，石蠟包埋，4mu;m連續(xù)切片、貼片，染色。

免疫組織化學(xué)SP染色顯示CD20陽(yáng)性細(xì)胞。

主要步驟如下：

切片脫蠟下行入水，PBS洗3mintimes;3，熱抗原修復(fù)10min，試劑A室溫10min，PBS洗3mintimes;3，試劑B室溫下10min，一抗(CD20，1∶100)4℃過(guò)夜，PBS洗5mintimes;3，試劑C室溫10min，PBS洗3mintimes;3，試劑D室溫下10min，PBS洗3mintimes;3，DABH2O2液顯色，中性樹(shù)膠封片。

1.2.3細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各胎齡段標(biāo)本隨機(jī)取非連續(xù)切片5張，應(yīng)用BioMias29圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，在高倍鏡下(物鏡40倍)每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的CD20陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)plusmn;標(biāo)準(zhǔn)差(plusmn;s)表示，并采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5進(jìn)行分析。

2結(jié)果2.1CD20陽(yáng)性細(xì)胞的分布和定位12周胎齡，回腸壁間充質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，散在分布，反應(yīng)較弱，數(shù)量少(圖1a)。

14周可見(jiàn)CD20陽(yáng)性細(xì)胞染色深，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。

16周胎齡，CD20陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，散在或成群分布于絨毛中軸或深部結(jié)締組織內(nèi)(圖1b)。

18周胎齡，CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞聚集成群，形成明顯的淋巴小結(jié)(圖1c)。

24周后，CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，大量細(xì)胞參與構(gòu)成集合淋巴小結(jié)，部分細(xì)胞散在分布于結(jié)締組織內(nèi)(圖1d)。

a：

12周，回腸壁CD20陽(yáng)性細(xì)胞單個(gè)分布，times;400;b：

16周，回腸壁CD20陽(yáng)性細(xì)胞分布于絨毛中軸，times;400;c：

18周，回腸壁CD20陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，聚集形成淋巴小結(jié)雛形，times;400;d：

24周，回腸壁CD20陽(yáng)性細(xì)胞聚集形成集合淋巴小結(jié)，times;100圖1不同胎齡人胎回腸壁CD20陽(yáng)性細(xì)胞分布(SP免疫組化染色)2.2CD20陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)各胎齡回腸組織切片CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1。

9～12周與13～16周比較，細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性差異(Pgt;0.05)。

13～16周以后，隨胎齡增長(zhǎng)，CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量逐漸增加(Plt;0.05)，尤以25～28周細(xì)胞數(shù)量最多，與21～24周相比Plt;0.01。

表1各胎齡CD20陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)3討論腸道是機(jī)體內(nèi)最大的免疫器官之一，其免疫誘導(dǎo)部位包括腸集合淋巴小結(jié)、孤立淋巴小結(jié)和闌尾。

其中回腸因有豐富的集合淋巴小結(jié)和散在分布的淋巴組織而在消化道免疫中占據(jù)極其重要的地位，成為消化道免疫的研究熱點(diǎn)。

回腸腸壁內(nèi)淋巴細(xì)胞作為腸道相關(guān)淋巴組織中的一個(gè)特殊組成部分,是機(jī)體免疫系統(tǒng)與外來(lái)抗原以及微生物較早接觸的免疫細(xì)胞,同時(shí)也是較早發(fā)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞,其通過(guò)分泌一些細(xì)胞因子，誘導(dǎo)腸粘膜免疫應(yīng)答。

因此，回腸內(nèi)淋巴細(xì)胞的類型、數(shù)量以及分布可以反映回腸局部粘膜免疫屏障的建立情況及其免疫防御功能的完善程度。

有研究證實(shí)，B淋巴細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程最早由胎兒肝臟開(kāi)始，在人胚中,曾于7.5周的肝內(nèi)發(fā)現(xiàn)有免疫球蛋白合成的最早表現(xiàn)[6]。

但B淋巴細(xì)胞在人胚胎時(shí)期何時(shí)遷移進(jìn)入回腸內(nèi)，未見(jiàn)報(bào)道。

CD20是是存在于所有B細(xì)胞特異性抗原,CD20通過(guò)參與組成鈣離子通道對(duì)B細(xì)胞的分化和成熟進(jìn)行調(diào)控,同時(shí)它還通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。

這種磷酸化蛋白質(zhì)分子，主要參與調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的增殖與分化，在免疫系統(tǒng)中起重要作用。

CD20首先在前B細(xì)胞中表達(dá)，成熟的B細(xì)胞也表達(dá)CD20，CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞參與構(gòu)成淋巴小結(jié)。

B細(xì)胞激活和處于生長(zhǎng)進(jìn)化的B細(xì)胞均有CD20高表達(dá)。

B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化時(shí)，CD20的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，在漿細(xì)胞中不表達(dá)。

有證據(jù)表明，CD20陽(yáng)性B細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞功能[78]。

本研究顯示人胚胎回腸12周開(kāi)始表達(dá)CD20分子，隨胎齡增加，CD20陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，尤以28周最為明顯。

證實(shí)了12周胎齡的回腸內(nèi)已有B淋巴細(xì)胞遷入，胎兒免疫功能已開(kāi)始建立。

從血液內(nèi)進(jìn)入回腸壁粘膜并主要位于結(jié)締組織內(nèi)的B淋巴細(xì)胞最終將發(fā)育分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞的終末效應(yīng)細(xì)胞,具有合成和分泌抗體的重要功能。

許多研究證實(shí),消化管粘膜是免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生抗體的重要效應(yīng)部位。

有人曾預(yù)測(cè)未來(lái)的疫苗主要經(jīng)腸道免疫,原因是腸壁為機(jī)體最大的免疫器官,粘膜產(chǎn)生的抗體遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于體液中的抗體[9]，本研究結(jié)果支持這一預(yù)測(cè)。

此外,人的消化管淋巴細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)量結(jié)果也證實(shí),盲腸和回腸的淋巴組織密度在消化管中最大,尤其回腸是消化管最主要的免疫功能部位。

CD20陽(yáng)性細(xì)胞在回腸的分布亦如此。

隨著胎兒的出生及進(jìn)食，腸道中的B細(xì)胞將發(fā)育分化為漿細(xì)胞，因?yàn)槟c道是食物等外來(lái)抗原接觸機(jī)會(huì)較多、時(shí)間較長(zhǎng)的部位,故漿細(xì)胞在腸道分布較為集中。

此外,回腸中含有豐富的淋巴組織,尤其在孤立和集合淋巴小結(jié)中B細(xì)胞數(shù)量較多,也提示回腸具有漿細(xì)胞產(chǎn)生的巨大潛力。

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