ER應(yīng)激蛋白在免疫性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達

1/1ER應(yīng)激蛋白在免疫性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達ER應(yīng)激蛋白在免疫性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達#馮利杰1,4，周宬玥2,4，余長亮3，沈玉君4，沈玉先1,4，李俊2*（1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，合肥，230032；2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥，230032；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥，230032；4.安徽醫(yī)科大學(xué)生物藥物研究所，合肥，230032）摘要：

目的觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激蛋白在免疫性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達，探討ER應(yīng)激51015在免疫性關(guān)節(jié)炎癥中的作用。

方法13只雌性新西蘭大白兔，隨機分為正常對照組和模型組。

模型組兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射甲基化牛血清白蛋白（mBSA）誘導(dǎo)免疫性關(guān)節(jié)炎模型，HE染色觀察滑膜組織病理改變；RT-PCR檢測滑膜組織中ER應(yīng)激蛋白BiP、CHOP的mRNA水平；免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)檢測BiP和CHOP在滑膜組織中的表達和細胞定位。

結(jié)果模型組兔出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)炎癥狀，病理改變表現(xiàn)為滑膜組織增生，炎性細胞浸潤等；巨噬細胞激活的標(biāo)志性蛋白CD68及成纖維細胞的標(biāo)志物a-SMA表達明顯增多。

在炎性增厚的滑膜，BiP、CHOP表達明顯增加，免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示BiP在a-SMA、CD68陽性細胞中均有表達，而CHOP主要在a-SMA陽性細胞表達，在CD68陽性細胞中幾乎不表達。

結(jié)論免疫性關(guān)節(jié)炎癥能誘導(dǎo)ER應(yīng)激，CHOP在不同滑膜細胞中的選擇性表達可能與滑膜細胞抵抗凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：

免疫性關(guān)節(jié)炎；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；未折疊蛋白反應(yīng)；BiP；CHOP；滑膜細胞中圖分類號：

R593.2220Selectivelyexpressedendoplasmicreticulumstressinducibleproteinsinantigen-inducedarthritisFENGLijie1,4,ZHOUChengyue2,YUChangliang3,SHENYujun4,SHENYuxian1,4,LIJun2(1.Instituteofmedical,anhuimedicaluniversity,Hefei,230032;2.Instituteofpharmacy,Anhuimedicaluniversity.hefei,230032;3.ThefirstaffiliatedhospitalofAnhuimeidicaluniversity,hefei,230032;4.Biopharmaceuticalresearchinstitute,Anhuimedicaluniversity,hefei,230032)Abstract:ObjectiveThepurposesofthisstudyweretoinvestigatethecharacteristicsandimplicationofERstress-relativeproteininantigen-inducedarthritis(AIA)model.MethodsAIAmodelwasinducedbyinjectingmBSAandFreund’scompleteadjuvant(FCA)inadultfemalerabbits.Fibroblast-likeandmicrophage-likesynoviocytesinthesynoviumsweredetectedwiththespecificantibodiesofanti--SMAandanti-CD68,respectively.ThemRNAexpressionsofBiPandCHOPweredeterminedbyRT-PCR.ThecellularlocalizationofBiPandCHOPinthesynoviumswasexaminedbydouble-labeledimmunofluorescence.ResultsAIAmodelwasestablishedsuccessfullyand-SMAandCD68expressionremarkablyincreased.BiPwasextensivelyexpressedinbothmicrophage-andfibroblast-likesynoviocytesofinflammatorysynoviums.However,CHOPlocalizedmainlyinfibroblast-likesynovicytes,butfewexpressedinmicrophage-likesynoviocytes.ConclusionERstressinducibleproteinexhibitedselectiveexpressionininflammatorysynovium,whichmaybeexplainwhyinflammatorysynoviocytesresistanttoERstressinducedapoptosis.Keywords:Rheumatoidarthritis;endoplasmicreticulumstress;unfoldedproteinresponse;BiP;CHOP;synoviocyte基金項目：

基金項目：

國家自然科學(xué)基金（編號81173074）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目（編號20093420110002，20113420110004）；安徽省自然科學(xué)基金（編號11040606Q14）作者簡介：

馮利杰（1980-），女，講師，功能性蛋白與藥物作用靶點.E-mail:fenglijie1128@通訊聯(lián)系人：

沈玉先，教授，功能性蛋白與藥物作用靶點，E-mail：

shenyx@李俊，教授，抗炎免疫藥理學(xué)，E-mail：

lijun@-1-253035400引言4550類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的慢性、系統(tǒng)性自身免疫病，其發(fā)病機制十分復(fù)雜，至今尚不明確[1]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmicreticulumstress，ERstress）是真核細胞的一種保護性應(yīng)激反應(yīng)，通過激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfoldedproteinresponse，UPR）通路來減少細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白的異常聚集，從而起到細胞保護作用[2]。

ER應(yīng)激與很多因素所致疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，越來越多的證據(jù)表明，ER應(yīng)激及UPR通路可能參與了RA的病理過程[3]。

因此，本研究擬在兔免疫性關(guān)節(jié)炎（antigen-inducedarthritis，AIA）模型上，觀察ER應(yīng)激蛋白在滑膜組織中的表達和細胞定位，為進一步探討ER應(yīng)激在RA病理機制中的作用提供理論依據(jù)。

1材料與方法1.1材料1.1.1動物5513只新西蘭大耳白兔，雌性，體重2.0～2.5Kg，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

主要試劑1.1.2弗氏完全佐劑（Freund’scompleteadjuvant，F(xiàn)CA），甲基化牛血清白蛋白（methylatedbovineserumalbumin，mBSA）購自Sigma公司；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）60購自Amresco公司；TRIzol，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；BiP、CHOP和-actin上下游引物委托上海生物工程有限公司合成；鼠抗CD68抗體購自AbDserotec公司；兔抗CHOP抗體購自SantaCruz公司；鼠抗-SMA抗體、兔抗BiP抗體購自Abcam公司。

1.2方法1.2.1免疫性關(guān)節(jié)炎模型建立65將mBSA（8mg/ml）與FCA等體積混合，制成混懸液；模型組兔背部多點皮內(nèi)注射0.5ml抗原混懸液，對照組注射等量生理鹽水；14d模型組再次皮內(nèi)注射0.5ml抗原混懸液；致敏后第28天，模型組兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.5ml抗原混懸液（2mg/mlmBSA，溶于5％生理鹽水)，對照組注射等量生理鹽水[4]；觀察兔肢體活動情況，膝關(guān)節(jié)腫脹程度。

HE染色1.2.270切片常規(guī)脫蠟至水，入蘇木精3min，0.5％鹽酸乙醇溶液分化30s，自來水藍化20min,70％、80％乙醇溶液各5min，伊紅lmin。

梯度乙醇溶液至二甲苯透明，中性樹膠封片。

反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測滑膜組織中BiP和CHOP的mRNA水平1.2.3分別取正常和炎癥滑膜組織，在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入1mlTRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。

采用Trizol一步法提取總RNA；紫外分光光度計測RNA產(chǎn)量和純度。

75根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，然后進行PCR。

分別設(shè)計并合成BiP、CHOP和-actin的上下游引物（見表1）。

反應(yīng)條件：

95C預(yù)變性5min，94C變性60sec，58C退火60sec，72C延伸60sec，擴增35個循環(huán)，72C延伸10min；取PCR擴增產(chǎn)物3ul，加樣于1%瓊脂糖凝膠，按100V20min電泳，紫外燈下觀察PCR產(chǎn)物并拍照。

-2-ABCD分析及Dunnetts檢驗，P﹤0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

80表1.BiP,CHOP,和-actin的RT-PCR引物Table1.PrimersusedforBiP,CHOP,Hrd1and-actininRT-PCRmRNABiPPrimerSenseSequence(5’-3’)Size(bp)GGTATTGAAACTGTGGGAGG275bpAntisenseTTGTCTTCAGCTGTCACTCGSenseGGAGCTGGAAGCCTGGTATGA402bpAntisenseTCCCTGGTCAGGCGCTCGATTTSenseTCACCAACTGGGACGACAT192bpAntisenseGCACAGCCTGGATAGCAACCHOP-actin1.2.4免疫熒光雙標(biāo)記切片常規(guī)脫臘至水，微波抗原修復(fù)，用含0.5%TritonX-100，5%羊血清的PBS封閉液室溫封閉30min，一抗4C孵育過夜；熒光標(biāo)記的二抗37C避光孵育1h；80%甘油封片。

85用PBS緩沖液替代一抗作陰性對照。

熒光顯微鏡下觀察，攝像。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法計量資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗采用單因素方差，2結(jié)果90951002.1AIA兔滑膜的病理組織學(xué)變化光學(xué)顯微鏡下可見正常關(guān)節(jié)滑膜襯里層由1~2層滑膜細胞組成，且部分不連續(xù)，滑膜襯里下層為脂肪細胞，未見炎癥細胞浸潤（圖1A，C）；而模型組滑膜襯里層明顯增厚，襯里層細胞由1~2層逐漸增加至10~15層，有較多的乳頭樣突起（圖1B），滑膜下層纖維組織增生，大量炎細胞浸潤，脂肪細胞消失，新生血管明顯增多，血管周圍可見大量淋巴樣細胞浸潤（圖1D）。

圖1兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色Fig.1HEstainingoftherabbitssynovialtissues(A)正?；そM織；（B）炎癥滑膜組織；（C）A圖方框區(qū)域放大圖片；（D）B圖方框區(qū)域放大圖片。

圖中標(biāo)尺=50m.-3-2.2AIA兔滑膜細胞的激活免疫熒光染色檢測滑膜組織中巨噬細胞激活的標(biāo)志性蛋白CD68及成纖維細胞的標(biāo)記物-SMA的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正?；そM織中CD68和-SMA的熒光強度較弱（圖2A和C），而模型組滑膜組織中CD68和-SMA的免疫熒光強度明顯增強，提示這兩種蛋105白的表達量增加（圖2B和D），表明在兔AIA模型中這兩類滑膜細胞均被激活。

ACBD圖2.AIA兔滑膜細胞中-SMA和CD68的表達Fig.2ExpressionsofCD68and-SMAinsynovialtissueofrabbits免疫熒光染色檢測-SMA（A、B）和CD68（C、D）在正常（A，C）和炎癥（B，D）滑膜組織中的表達。

圖中標(biāo)尺=100m1101151202.3ER應(yīng)激蛋白BiP在滑膜組織中的表達和定位BiP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的分子伴侶，其作用是保持底物蛋白處于易于折疊的狀態(tài)，因此常作為ER應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白[5]。

我們用抗BiP多克隆抗體對兔滑膜組織進行免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正?；ぶ杏猩倭緽iP表達（圖3A），而炎性增厚的滑膜組織中BiP表達明顯增多，且主要定位于胞漿（圖3B）；RT-PCR結(jié)果也同樣顯示，模型組滑膜組織中BiP的mRNA水平明顯高于正常對照組（圖3C和D），提示炎癥能誘導(dǎo)BiP的表達上調(diào)。

為了鑒定滑膜組織中表達BiP的細胞類型，我們將BiP分別和CD68、-SMA進行免疫熒光雙標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BiP在-SMA、CD68陽性細胞中均有表達（圖4）。

提示炎癥能誘導(dǎo)滑膜組織中FLS和巨噬細胞樣滑膜細胞（macrophage-likesynoviocytes，MLS）發(fā)生ER應(yīng)激。

-4-125130135圖3.BiP在兔滑膜組織中的表達Fig.3ExpressionofBiPinrabbitsynovialtissues(A)BiP在正?；そM織中的表達；（B）BiP在炎癥滑膜組織中的表達；圖中標(biāo)尺=50m；(C)RT-PCR檢測正常和炎癥滑膜組織中BiP的mRNA水平；(D)對C圖的半定量分析，與正?；そM織相比，**P0.01。

圖4.滑膜組織中表達BiP的細胞類型Fig.4ThecellularlocalizationofBiPinsynovialtissuesfromAIArabbits(A1-A3)免疫熒光雙標(biāo)檢測炎癥滑膜組織中a-SMA和BiP的表達；a-SMA(紅)，BiP(綠)，A3是A1,A2合并后的圖片；(B1-B3)免疫熒光雙標(biāo)檢測炎癥滑膜組織中CD68和BiP的表達，CD68(紅)，BiP(綠)，B3是B1,B2合并后的圖片。

圖中標(biāo)尺=50m。

2.4ER應(yīng)激蛋白CHOP在滑膜組織中的表達和定位核轉(zhuǎn)錄因子CHOP是C/EBP家族成員，正常情況下低表達或不表達，ER應(yīng)激能誘導(dǎo)其表達上調(diào)，也常被作為ER應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白[6]。

免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正?；は啾龋?5-炎性增厚的滑膜組織中CHOP表達增加（圖5B）；RT-PCR結(jié)果顯示，模型組滑膜組織中CHOP的mRNA水平較正常對照組略有增加（圖5C和D）。

提示關(guān)節(jié)炎癥能誘導(dǎo)CHOP表達上調(diào)。

同樣，為了鑒定滑膜組織中表達CHOP的細胞類型，我們將CHOP分別和-SMA、140145150CD68進行免疫熒光雙標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHOP只在-SMA陽性細胞中表達，而在CD68陽性細胞中不表達（圖6）。

提示CHOP可能在炎癥誘導(dǎo)的FLSER應(yīng)激中起重要作用，而不參與MLS的功能調(diào)節(jié)。

圖5.CHOP在兔滑膜組織中的表達Fig.5ExpressionofCHOPinrabbitsynovialtissues(A)CHOP在正?；そM織中的表達；(B)CHOP在炎癥滑膜組織中的表達；圖中標(biāo)尺=50m；(C)RT-PCR檢測正常和炎癥滑膜組織中CHOP的mRNA水平；(D)對C圖的定量分析，與正?；そM織相比，*P0.05。

圖6.滑膜組織中表達CHOP的細胞類型Fig.6ThecellularlocalizationofCHOPinsynovialtissuesfromAIArabbits(A1-A3)免疫熒光雙標(biāo)檢測炎癥滑膜組織中a-SMA和CHOP的表達；a-SMA(紅)，CHOP(綠)，A3是A1,A2合并后的圖片；(B1-B3)免疫熒光雙標(biāo)檢測炎癥滑膜組織中CD68和CHOP的表達，CD68(紅)，CHOP(綠)，B3是B1,B2合并后的圖片。

圖中標(biāo)尺=50m。

-6-3結(jié)論155越來越多的證據(jù)表明ER應(yīng)激以及UPR通路的功能失調(diào)與許多炎癥免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

大量體外實驗證明干擾ER平衡和線粒體代謝的病理因素都可以導(dǎo)致UPR和炎癥反應(yīng)。

而延長的UPR和炎癥反應(yīng)可能相互作用，共同構(gòu)成一些免疫性疾病，如代謝性疾病，神經(jīng)退行性疾病，自身免疫性疾病以及感染性疾病的病理基礎(chǔ)[7]。

在RA的發(fā)生發(fā)展過程中，增殖浸潤的滑膜細胞和其他炎性細胞均可分泌大量的炎性細160165170胞因子，后者又可誘導(dǎo)滑膜細胞合成各種蛋白，包括細胞因子和蛋白酶，以加重組織的破壞。

這種炎癥性的環(huán)境不可避免的影響局部細胞ER內(nèi)的蛋白折疊，并引起錯誤折疊的蛋白聚集。

另外，RA炎癥關(guān)節(jié)內(nèi)的長期缺氧也可能誘導(dǎo)ER應(yīng)激。

已有研究發(fā)現(xiàn)RA滑膜細胞核內(nèi)有ER定位的轉(zhuǎn)錄因子ATF6的激活[8]。

因此，我們推測ER應(yīng)激和UPR信號通路在RA的病理機制中起著重要的作用。

BiP是一類分子伴侶，屬于熱休克蛋白70（Heatshockprotein70，Hsp70）家族，在非應(yīng)激狀態(tài)下，BiP與PERK、IRE1和ATF6結(jié)合，封閉了它們的信號傳導(dǎo)通路。

當(dāng)非折疊蛋白在ER內(nèi)聚集時，BiP被釋放出來，并與非折疊蛋白結(jié)合，以便阻止非折疊蛋白輸出ER[5]。

因此，BiP常被作為ER應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白。

最近的研究發(fā)現(xiàn)BiP在RA滑膜組織中高表達，并選擇性刺激滑膜T細胞增殖，80%RA患者血清中存在抗BiP抗體[9]。

在膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎（collagen-inducedarthritis，CIA）模型和進展期骨關(guān)節(jié)炎病人中也存在類似的結(jié)果[10,11]。

此外，外源性的重組人BiP能促進外周血單核細胞中抗炎因子IL-10的表達，抑制TNF-的表達，從而起到抑制炎癥的作用[12]。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)BiP在炎癥滑膜組織中表達上調(diào)，且在FLS和MLS中均有表達。

提示免疫性關(guān)節(jié)炎癥能誘導(dǎo)ER應(yīng)激。

根據(jù)以往文獻報道，我們推斷BiP可能具有抑制炎癥的作用，那么如何解釋在BiP表達175180185190195上調(diào)以及ER應(yīng)激激活的情況下，炎性滑膜細胞仍然處于高度增殖的狀態(tài)？我們推測，RA中是否還存在其他調(diào)控細胞增殖與凋亡平衡的因素存在，從而影響滑膜細胞的功能。

因此我們檢測了CHOP的表達情況。

CHOP屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族的凋亡前因子，也是公認的ER應(yīng)激的標(biāo)志蛋白。

在生理情況下CHOP不表達或低水平表達，ER應(yīng)激能誘導(dǎo)其表達上調(diào)。

CHOP是ER應(yīng)激與細胞凋亡的重要中間信號分子，CHOP/細胞對ER應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的敏感性下降[13]。

研究發(fā)現(xiàn)CIA鼠FLS中CHOPmRNA和蛋白表達水平降低[14]；用ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑thapsigargin分別處理骨關(guān)節(jié)病和RA來源的FLS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ER應(yīng)激能導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)病FLS的凋亡，而RA滑膜細胞對ER應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡則不敏感，其原因可能與RA來源的FLS內(nèi)CHOP表達下調(diào)及細胞自噬作用增強有關(guān)[15]。

然而，本研究中我們卻發(fā)現(xiàn)炎癥滑膜組織中CHOP表達水平略有增加，并且與BiP的表達特點不同，CHOP僅表達于FLS，在MLS中不表達，說明CHOP的表達與FLS的ER應(yīng)激有關(guān)，而不參與MLS的功能調(diào)節(jié)；因此我們推測MLS中CHOP的表達缺失可能導(dǎo)致MLS能夠避免ER應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，從而起到促進炎癥的作用。

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