微生物的生長及其控制

第六章

微生物的生長及其控制概論生長：細胞物質不可逆地增加，體積增大的過程。（量變過程）繁殖：生命個體數(shù)量增加的過程。（質變過程）群體生長：指在一定時間和條件下細胞數(shù)量的增加；實質上包含著個體細胞生長與繁殖交替進行的過程。

群體生長=個體生長+個體繁殖個體生長

→個體繁殖→群體生長單個微生物細胞合適的外界條件，吸收營養(yǎng)物質，進行代謝。同化作用的速度超過了異化作用個體的生長原生質的總量（重量、體積、大小）就不斷增加如果各細胞組分是按恰當?shù)谋壤鲩L時，則達到一定程度后就會發(fā)生繁殖，引起個體數(shù)目的增加。群體內各個個體的進一步生長群體的生長第一節(jié)測定生長繁殖的方法一、測生長量：單位時間里微生物重量上的變化（一）直接法（精確的稱干重法；粗放的測體積法）（二）間接法（比濁法，生理指標法）將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來，然后烘干（干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃）、稱重。一般干重為濕重的10%～20%，而一個細菌細胞一般重約10-12～10-13g。該法適合菌液濃度較高的樣品。（一）直接法（二）間接法1.比濁法：借助于分光光度計，在一定波長（450-650nm波段)下測定菌懸液的光密度，就可反應出菌液的濃度。原理：在一定范圍內，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。特點：快速、簡便。濁度儀2.生理指標法測含氮量：蛋白質是細胞的主要物質，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。其他方法：含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產CO2、產酸、產熱、粘度等，都可用于生長量的測定。二、計繁殖數(shù)：單細胞微生物細胞個體數(shù)目的檢測法1.直接法：

(1)計死活總菌數(shù)：顯微鏡下計數(shù)

(2)死活菌分別計數(shù)：

酵母：美藍染色，活細胞無色，死細胞藍色

細菌：丫啶橙染色，活細胞有橙色熒光，死細胞發(fā)綠色熒光細胞密度＝（4個大格細胞總數(shù)/4）×104個/ml2.間接法：是一種活菌計數(shù)法(1)平板菌落計數(shù)：好氧菌、厭氧菌均可（實驗）

菌樣稀釋→澆注平板→倒置培養(yǎng)→統(tǒng)計菌落形成單位cfu→乘以稀釋倍數(shù)→菌樣含菌數(shù)

用活菌指示劑TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)可使菌落在短時間內形成玫瑰紅色——快速鑒定(2)厭氧菌的菌落計數(shù)法亨蓋特滾管培養(yǎng)法和半固體深層瓊脂法第二節(jié)微生物的生長規(guī)律一、微生物的個體生長和同步生長

1、同步培養(yǎng)（synchronousculture）：即設法使群體中的所有細胞盡可能都處于同樣細胞生長和分裂同期中，然后分析此群體的各種生物化學特征，從而了解單個細胞所發(fā)生的變化。

2、同步生長（synchronousgrowth）：通過同步培養(yǎng)而使細胞群體處于分裂步調一致的生長狀態(tài)，稱同步生長。方法：①環(huán)境條件誘導法：氯霉素抑制細菌蛋白質合成；細菌芽胞誘導發(fā)芽②機械篩選法：過濾法；離心法；膜洗脫法

二、單細胞微生物的典型生長曲線1、典型生長曲線：

生長曲線：定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實驗曲線。典型生長曲線：將菌種接種在液體培養(yǎng)基中隔一定時間取樣，計算菌數(shù)，以菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標，生長時間為橫坐標作圖，繪出一條包括延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段的曲線。

R(生長速率常數(shù))=分裂次數(shù)(代)/單位時間（一）延滯期（lagphase）

或停滯期--“萬事開頭難”1.特點：細胞數(shù)目不增加(R=0)細胞長、大細胞內RNA尤其是rRNA含量增高合成代謝旺盛，誘導酶迅速合成對不良條件敏感2.影響延滯期長短的因素菌種接種齡：即“種子”的群體生長年齡，即處在生長曲線上的哪一個階段。接種量：接種量的大小明顯影響延滯期的長短。培養(yǎng)基成分：接種到營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基中的微生物，要比接種到營養(yǎng)單調的組分培養(yǎng)基中的延滯期短。種子損傷度3.產生原因①接種后，新的培養(yǎng)基與原來的培養(yǎng)基成分不同，細胞需要時間合成新的酶來利用新的營養(yǎng)物質；②接種后，細胞內的一些關鍵小分子、離子或酶由于稀釋作用導致濃度下降，恢復到原來水平需要時間；③種子較老，缺乏ATP，必需的輔助因子及核糖體；④細胞可能受損傷而需要一段時間恢復。（二）指數(shù)期（exponentialphase）或對數(shù)期1.特點：生長速率常數(shù)最大，繁殖數(shù)>死亡數(shù)細胞每分裂一次所需的時間——代時（generationtime，G，增代時間）或原生質增加一倍所需的倍增時間（doublingtime）最短。細胞平衡生長，成分均勻酶系活躍，代謝旺盛。2.三個重要參數(shù)一些細菌的代時菌名 培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度 代時E.coli（大腸桿菌） 肉湯 37℃ 17minE.coli

牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（產氣腸細菌） 肉湯或牛奶37 16~18 E.aerogenes

組合 37 29~44B. Cereus（蠟狀芽孢桿菌） 肉湯 30 18B.thermophilus（嗜熱芽孢桿菌） 肉湯 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳桿菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸鏈球菌） 牛奶 37 26S.lactis

乳糖肉湯 37 48Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacteriumtuberculosis（結核分枝桿菌）組合 37 792~93 Nitrobacteragilis（活躍硝化桿菌） 組合 27 12003.影響指數(shù)期微生物代時長短的因素菌種：代時隨菌種而異營養(yǎng)成分營養(yǎng)物濃度：營養(yǎng)物在低濃度時影響菌體的生長速率，在高濃度時影響菌體的生長量。凡處于較低濃度范圍內可影響生長速率和菌體產量的某營養(yǎng)物，稱生長限制因子。培養(yǎng)溫度4.對數(shù)生長期的意義①研究代謝和生理性能的好材料；②生產中用其作種子；③增殖噬菌體的最佳宿主（三）穩(wěn)定期（stationaryphase）或恒定期

1.特點：細胞數(shù)目不增加(R=0)，即處于新繁殖的細胞數(shù)與衰亡的細胞數(shù)相等，或正生長與負生長相等的動態(tài)平衡之中。菌體產量達到了最高點，而且菌體產量與營養(yǎng)物質的消耗間呈現(xiàn)出一定的比例關系。2.穩(wěn)定期到來的原因主要是：營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡；營養(yǎng)物的比例失調，如C／N比值不合適；酸、醇、毒素或H20等有害代謝產物的累積；pH、氧化還原勢等物化條件越來越不適宜。3.穩(wěn)定期的意義①若以生產菌體或次級代謝物為目的，穩(wěn)定期是最佳收獲期。②對生物測定來說，穩(wěn)定期是最佳測定時期。（四）衰亡期（declinePhase或deathPhase）1.特點：個體死亡的速度超過新生的速度(繁殖數(shù)<死亡數(shù))，整個群體就呈現(xiàn)出負生長（R<0）細胞形態(tài)多樣，例如會產生很多膨大、不規(guī)則的退化形態(tài)有的微生物因蛋白水解酶活力的增強就發(fā)生自溶有的微生物在這時產生或釋放對人類有用的抗生素等次生代謝產物在芽胞桿菌中，芽胞釋放往往也發(fā)生在這一時期2.產生原因營養(yǎng)物質耗盡、有毒代謝產物的大量積累、理化環(huán)境的不利。分解代謝速度>>合成速度，大量菌體死亡。生長特點成因菌體特征應用及其它調整期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期不立即繁殖繁殖速度最快出生率等于死亡率,活菌數(shù)最大,代謝產物大量積累死亡超過繁殖適應新環(huán)境條件適宜生存條件開始惡化生存條件極度惡化代謝活躍,體積增長較快個體形態(tài)和生理特性穩(wěn)定有些種類出現(xiàn)芽孢出現(xiàn)畸變與菌種和培養(yǎng)條件有關生產用菌種科研材料改善和控制條件,延長穩(wěn)定期細胞裂解釋放產物單細胞微生物生長的四個時期三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）又稱開放培養(yǎng)（openculture），是相對于上述繪制典型生長曲線時所采用的單批培養(yǎng)（batchculture）或密閉培養(yǎng)（closedculture）而言的。單(分)批培養(yǎng)：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)：當微生物培養(yǎng)物進入對數(shù)期或穩(wěn)定期后，連續(xù)供給其新鮮培養(yǎng)液，同時不斷地移出多余的培養(yǎng)液和代謝產物，從而使微生物始終處于較適宜的條件下生長繁殖，這種方式叫連續(xù)培養(yǎng)。單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細胞數(shù)（個/ml）連續(xù)培養(yǎng)原理：通過認識穩(wěn)定期到來的原因，并采取相應的有效措施：反“穩(wěn)定期”的到來。連續(xù)培養(yǎng)器的類型恒濁器（turbidostat）這是根據(jù)培養(yǎng)器內微生物的生長密度，并借光電控制系統(tǒng)來控制培養(yǎng)液流速，使細菌培養(yǎng)液濁度保持恒定的微生物細胞的連續(xù)培養(yǎng)器。在恒濁器中的微生物，始終能以最高生長速率進行生長。不斷調節(jié)流速而使細菌培養(yǎng)液濁度保持恒定

恒化器（chemostat或bactogen）：以恒定流速使營養(yǎng)物質濃度恒定而保持細菌生長速率恒定的方法。微生物始終在低于其最高生長速率下進行生長繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)裝置。這是一種通過控制某一種營養(yǎng)物（如碳、氮源；生長因子；無機鹽等）的濃度，使其始終成為生長限制因子的條件下達到的。保持恒定的流速,使營養(yǎng)物質濃度保持恒定裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產物應用范圍恒濁器菌液密度（內控制）無限制生長因子不恒定最高速率大量菌體或與菌體生長平行的代謝產物生產為主恒化器培養(yǎng)液流速（外控制）有限制生長因子恒定低于最高速率不同生長速率的菌體實驗室為主恒化器與恒濁器的比較和單批培養(yǎng)相比，連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點有：①高效：減少設備清洗、準備和滅菌等非生產時間，提高了設備利用效率②便于自控③產品質量相對穩(wěn)定連續(xù)培養(yǎng)法的缺點：①需要專門儀器，投資高②由于是開放系統(tǒng)，加上反應周期長，容易染菌③在長周期連續(xù)培養(yǎng)中，菌種易于退化④營養(yǎng)物的利用率一般低于單批培養(yǎng)新加入的培養(yǎng)基與原有的培養(yǎng)基不易完全混合，影響培養(yǎng)和營養(yǎng)物質的利用四、微生物的高密度培養(yǎng)（highcell-densityculture,HCDC）指微生物在液體培養(yǎng)基中細胞群體密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術?，F(xiàn)代高密度培養(yǎng)技術主要是用于基因工程菌生產多肽類藥物。高密度培養(yǎng)的方法主要有：選取最佳培養(yǎng)基成分和各成分含量補料提高溶解氧的濃度防止有害代謝產物的生成保持合適pH第三節(jié)影響微生物生長的主要因素影響微生物生長的外界因素很多，除了營養(yǎng)因素之外，還有許多理化因素，如：O2、溫度、pH值、水活度、滲透壓、輻射、UV、電離輻射、超聲波、化學藥劑等。一、溫度溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在直接影響細胞內的各種生化反應：影響酶活性：溫度變化影響酶促反應速率，最終影響細胞合成。影響細胞膜的流動性：溫度高，流動性大，有利于物質的運輸，溫度低，流動性降低，不利于物質運輸。影響物質的溶解度，對生長有影響。最低生長溫度：一般在-10℃～-5℃，極端的可達-30℃。最適生長溫度最高生長溫度：一般80-95℃，極端的

105-150℃。

最適生長溫度：某菌分裂代時最短、生長速率最高的溫度。嗜冷菌：<20℃中溫菌：20-45℃嗜熱菌：>45℃生長溫度的三基點對于同一微生物來說，其不同的生理生化過程有著不同的最適溫度。也就是說，最適生長溫度并不等于菌體生長量最高時的培養(yǎng)溫度；也不等于發(fā)酵速度最高時的培養(yǎng)溫度；更不等于積累某一代謝產物量最高時的培養(yǎng)溫度。二、氧氣1.微生物與O2關系2.厭氧菌受氧毒害機制五類與氧關系不同的微生物在半固體瓊脂柱中的生長狀態(tài)（模式圖）三、pH值pH值可影響微生物的生長和改變微生物的代謝產物。pH值對微生物的影響主要作用于：影響細胞膜的電荷分布，從而影響對營養(yǎng)物質的吸收；影響酶的活性，從而影響代謝過程；影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的離子化程度，從而影響營養(yǎng)物質的吸收或有毒物質的毒性。不同微生物對pH要求不同微生物的生長pH值范圍極廣，從pH<2-->10都有微生物能生長。但是絕大多數(shù)種類都生活在pH5.0~9.0之間。微生物生長的pH值三基點：各種微生物都有其生長的最低、最適和最高pH值。低于最低、或超過最高生長pH值時，微生物生長受抑制或導致死亡。

微生物名稱 pH值 最低最適最高Thiobacillusthiooxidans氧化硫硫桿菌

0.5 2.0~3.5 6.0Lactobacillusacidophilus嗜酸乳桿菌

4.0~4.65.8~6.6 6.8Rhizobiumjaponicum大豆根瘤菌

4.2 6.8~7.0 11.0Azotobacterchroococcum圓褐固氮

4.5 7.4~7.6 9.0Nitrosomonassp.硝化單胞菌

7.0 7.8~8.6 9.4Acetobacteraceti醋化醋桿菌

4.0~4.55.4~6.3 7.0~8.0Staphylococcusaureus

金黃葡球菌

4.27.0~7.5 9.3Chlorobiumlimicola泥生綠菌

6.0 6.8 7.0Thurmusaquaticus水生棲熱菌

6.07.5~7.8 9.5Aspergillusniger黑曲霉

1.55.0~6.0 9.0一般放線菌 5.0 7.0~8.0 10.0一般酵母菌 3.05.0~6.08.0不同微生物的生長pH值范圍注意：雖然微生物外環(huán)境的pH值變化很大，但細胞內環(huán)境的pH值卻相當穩(wěn)定，一般都接近中性。微生物的生命活動對環(huán)境pH值的影響固體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法好氧菌的固體培養(yǎng)厭氧菌的固體培養(yǎng)好氧菌的液體培養(yǎng)厭氧菌的液體培養(yǎng)試管培養(yǎng)三角瓶（搖瓶）臺式發(fā)酵罐高層瓊脂柱厭氧培養(yǎng)皿厭氧罐厭氧手套箱第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論一、實驗室培養(yǎng)法亨蓋特滾管技術

<>

厭氧罐anaerobicjarAnaerobicGloveBox二、生產實踐中培養(yǎng)微生物的裝置

固體培養(yǎng)法好氧菌-曲法培養(yǎng)厭氧菌-堆積培養(yǎng)液體培養(yǎng)法淺盤培養(yǎng)深層液體通氣培養(yǎng)（發(fā)酵罐）一、基本概念第五節(jié)有害微生物的控制1.滅菌2.消毒3.防腐4.化療滅菌（sterilization）：是指采用強烈的理化因素，使任何物體內外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施稱為滅菌。分殺菌和溶菌。消毒（disinfection）：指采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的病原菌，而對被消毒的物體基本無害的措施。防腐（antisepsis）：是指采用某種物理,化學或生物因素,抑制物體上的微生物進行生長繁殖,從而達到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。處理方法有:低溫、缺氧、干燥、高滲、高酸、高醇、加防腐劑等?！龌煟╟hemotherapy）即化學治療。利用具有高度選擇毒力（對病原菌具有高度毒力而對宿主無顯著毒性）的化學物質來抑制宿主體內病原微生物的生長繁殖，借以達到治療該傳染病的一種措施。二、高溫滅菌

濕熱滅菌效力高的原因：

1)有水，蛋白質易凝固

2)熱蒸汽的穿透力強

3)蒸汽有潛熱存在(一)干熱滅菌

1.干烤條件：150-170℃，維持1-2h。效果：可殺死細菌的芽胞，如梭狀芽胞桿菌。應用范圍：用于玻璃器皿、金屬用具等的滅菌。

2.灼燒滅菌利用火焰直接把微生物燒死應用范圍：適合于對接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或實驗動物尸體等的滅菌。(二)濕熱滅菌

1.常壓法

(1)巴氏消毒法用較低的溫度處理不宜進行高溫滅菌的液態(tài)風味食品或調料，以殺滅其中的無芽胞病原菌，又不影響其原有風味的消毒方法。適用于牛奶、啤酒、果酒和飲料等液態(tài)食品巴氏消毒條件：低溫維持（LTH）法：63℃，30min

高溫瞬時（HTST）法：72℃，15s

目前一般都采用超高溫滅菌法（ultrahightemperature,UHT）：135-150℃，2-6s(2)煮沸消毒法條件：100℃，加熱10-30min。應用范圍：飲用水、注射器、毛巾及解剖用具的消毒；水果罐頭、果醬等食品。(3)間歇滅菌法條件：80-100℃,加熱15-60min,冷卻后37℃保溫,重復三次效果：可殺死全部細菌及芽胞。應用范圍：不耐熱培養(yǎng)基滅菌。

2.加壓法(1)加壓蒸汽滅菌法條件：121℃（壓力1kg/cm2），15-20min，或115℃，35min。效果：可殺死全部細菌,大多數(shù)孢子應用范圍:實驗室、醫(yī)院、發(fā)酵工廠器材、物料及肉類、蔬菜、奶制品滅菌。(2)連續(xù)加壓蒸汽滅菌法條件：135-140℃，5-15s

效果：可基本達到無菌應用范圍：發(fā)酵工廠培養(yǎng)基及液態(tài)食品奶、果汁、蔬菜汁滅菌。（三）影響加壓蒸汽滅菌效果的因素

A、物體含菌量

B、排冷氣程度

C、PH值

D、體積

E、加熱和散熱程度如滅菌對象是砂土、石蠟油等體積大、含菌多、傳熱差的物品，則應適當延長時間。在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣。（四）高溫對培養(yǎng)基的有害影響及其防止

1、有害影響

(1)形成沉淀物：多肽類、磷酸鹽、碳酸鹽等。

(2)破壞營養(yǎng)，提高色澤：產生氨基糖、焦糖或黑色素——褐變

(3)降低PH值

(4)降低培養(yǎng)基濃度：氣溫低時增加冷凝水2、防止措施（1）采用特殊加熱滅菌法：分別滅菌后再混合；低壓或間歇滅菌；瞬時滅菌。（2）過濾除菌：使用濾膜或過濾器，如燒結玻璃板、石棉板,硅藻土過濾器等,缺點是無法去除病毒和噬菌體。（3）其它方法：易發(fā)生沉淀的，按配方逐一加入成分；加0.01%EDTA或0.01%NTA（氮川三乙酸）防止金屬離子沉淀；用氧化乙烯對個別成分滅菌。三、化學殺菌劑、消毒劑、治療劑關于化學性試劑的藥效和毒性的指標

1.最低抑制濃度（MIC）：評定某化學藥物藥效強弱的指標。指在一定的條件下，某化學藥劑抑制特定微生物的最低濃度。2.半致死量（LD50）：評定某藥物毒性強弱的指標。指在一定條件下，某化學藥劑能殺死50%實驗動物時的劑量。3.最低致死量（MLD）：評定某藥物毒性強弱的另一指標。指在一定條件下，某化學藥劑能引起實驗動物群體100%死亡率的最低劑量。(一)表面消毒劑對一切活細胞都有毒性、不能用作活細胞內的化學治療用的化學藥劑石炭酸系數(shù)：在一定時間內被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達到同效石炭酸的最高稀釋度的比率。作用機理①使微生物蛋白質凝固變性，發(fā)生沉淀。如酒精等；②破壞菌體的酶系統(tǒng)，影響菌體代謝。如過氧化氫等；③降低微生物表面張力，增加細胞膜的通透性，使細胞發(fā)生破裂或溶解。如來蘇兒等酚類物質。

類型

名稱及使用方法

作用原理

應用范圍

醇類70%—75%乙醇脫水、蛋白質變性皮膚、器皿

醛類0.5%—10%甲醛2%戊二醛（pH=8）蛋白質變性房間、物