anxa10對人原發(fā)性肝癌細(xì)胞株hepg2中的vegfa akt3 pik3ca基因表達(dá)影響的研究

1/1anxa10對人原發(fā)性肝癌細(xì)胞株hepg2中的vegfaakt3pik3ca基因表達(dá)影響的研究摘要目的：

1、構(gòu)建攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）的人膜聯(lián)蛋白A10基因（ANXA10）過表達(dá)慢病毒，然后轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2。

2、采用轉(zhuǎn)錄組測序的方法檢測ANXA10過表達(dá)慢病毒對HepG2基因表達(dá)譜所產(chǎn)生的影響，初步闡明ANXA10對HepG2生物學(xué)行為的影響、可能涉及的基因及相關(guān)的信號通路，為原發(fā)性肝癌形成中的ANXA10作用的深入研究奠定基礎(chǔ)。

方法：

構(gòu)建攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）的人膜聯(lián)蛋白A10基因（ANXA10）過表達(dá)慢病毒LV-ANXA10，體外培養(yǎng)的HepG2分為三組：

實(shí)驗(yàn)組、空載體對照組和空白對照組，各組分別轉(zhuǎn)染LV-ANXA10、慢病毒空載體以及等量的Polybrene（病毒及空載體以MOI=10濃度轉(zhuǎn)染），轉(zhuǎn)染72小時(shí)后使用熒光倒置顯微鏡觀察增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）的表達(dá)情況，從而來確定ANXA10的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后96小時(shí)和120小時(shí)分別提取三組細(xì)胞的RNA行轉(zhuǎn)錄組測序比較三組細(xì)胞相同時(shí)間點(diǎn)及同組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)譜的差異，并采用qPCR驗(yàn)證部分差異表達(dá)基因。

結(jié)果：

1、ANXA10過表達(dá)慢病毒能影響HepG2的基因表達(dá)譜。

通過對轉(zhuǎn)錄組信息的分析，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后96小時(shí)的空白對照組與實(shí)驗(yàn)組比較發(fā)生顯著轉(zhuǎn)錄差異的基因有69個(gè)，其中26個(gè)基因上調(diào)，43個(gè)基因下調(diào)；空載體對照組與實(shí)驗(yàn)組相比發(fā)生顯著轉(zhuǎn)錄差異的基因有53個(gè)，其中25個(gè)基因上調(diào)，28個(gè)基因下調(diào)；空載體對照組與空白對照組比較發(fā)生顯著轉(zhuǎn)錄差異的基因有12個(gè)，其中8個(gè)基因上調(diào)，4個(gè)基因下調(diào)。

而在轉(zhuǎn)染后120小時(shí)的空白對照組與實(shí)驗(yàn)組的比較中發(fā)生顯著轉(zhuǎn)錄差異的基因有742個(gè)，其中110個(gè)基因上調(diào)，632個(gè)基因下調(diào)；空載體對照組與實(shí)驗(yàn)組的比較中發(fā)生顯著轉(zhuǎn)錄差異的基因有313個(gè)，其中168個(gè)基因上調(diào)，145個(gè)基因下調(diào)；空載體對照組與空白對照組比較發(fā)生顯著轉(zhuǎn)錄差異的基因有36個(gè)，其中24個(gè)基因上調(diào)，12個(gè)基因下調(diào)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染96小時(shí)及120小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與空載體對照組及空白對照組比較VEGFA、AKT3、IIPIK3CA的表達(dá)均是下調(diào)的，而空載體對照組與空白對照組比較無上述變化。

2、采用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證，其結(jié)果表明，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組與空載體對照組及空白對照組三組比較，實(shí)驗(yàn)組中VEGFA、AKT3、PIK3CAmRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），但空載體對照組與空白對照組相比較無明顯差異（Pgt;0.05），與轉(zhuǎn)錄組測序的分析結(jié)果吻合，從而證實(shí)VEGFA、AKT3、PIK3CA在轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒ANXA10的HepG2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載慢病毒的HepG2細(xì)胞及HepG