MAPK信號通路presentation課件

MAPK信號通路presentation內(nèi)容概要研究背景研究思路及核心技術創(chuàng)新點展望內(nèi)容概要研究背景研究思路及核心技術創(chuàng)新點1.1阿爾茨海默癥（Alzheimer'sdisease,AD）1906年報道1例51歲女性患者，進行性記憶和語言能力喪失及識別能力障礙，病情逐漸惡化、4年半后死亡，病解發(fā)現(xiàn)腦萎縮、老年斑和神經(jīng)原纖維改變。65-6970-7475-7980-8485-8990-9495-99年齡(年)4病理特征：β淀粉樣蛋白沉積形成的細胞外老年斑和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結。老年斑神經(jīng)元纖維纏結51.2淀粉樣蛋白級聯(lián)假說AmyloidcascadehypothesisneurodegenerationFomationofbrainoligomericAβordepositionoffibrillarAβaccumulationAmyoidprecursorprotein(APP)Pathogenesis：increased，alteredproductionorreducedclearanceofAβhereditaryfactorenvironmentalfactorβ-secretaseγ-secretaseAβ（observedinthebrainofpatientswithADADandSAD）APP淀粉樣前體蛋白Aβ淀粉樣多肽β-secretaseβ分泌酶γ-secretaseγ分泌酶6APPC83APP水解途徑非淀粉樣途徑：被α-分泌酶（C83）和γ-分泌酶連續(xù)切割淀粉樣途徑：Aβ的產(chǎn)生，被β-分泌酶（C99）（670Met～671Asp之間）和γ分泌酶依次切割APP是一種跨膜蛋白質(zhì),在體內(nèi)各種組織廣泛存在,而在腦組織的表達最高。APP水解途徑β分泌酶水解670Met～671Asp之間的肽鍵，將APP一分為二，生成670個氨基酸的APP片段和帶完整Aβ的跨膜C段。非淀粉樣途徑：被α-分泌酶（C83）和γ-分泌酶連續(xù)切割淀粉樣途徑：Aβ的產(chǎn)生，被β-分泌酶（C99）和γ分泌酶依次切割8課題選取的5個APP突變選取理由：2個早期發(fā)現(xiàn)突變E693G和E693Q，剩余3個為近些年發(fā)現(xiàn)的突變。對比研究。內(nèi)容概要研究背景研究思路及核心技術創(chuàng)新點展望表征：APPlevelC99levelAβlevel本課題選取5個APP突變，研究不同APP突變對Aβ形成過程的不同作用2.1研究出發(fā)點2.2.1構建BACE1穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細胞株2.2.2突變構2.2.3轉(zhuǎn)染2.2.4檢測建APP突變基因真核表達載體構建APP突變基因真核表達載體2.2設計思路及核心技術2.2.1構建BACE1穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細胞株2.2.2突變構2.2.3轉(zhuǎn)染2.2.4檢測建APP突變基因真核表達載體構建APP突變基因真核表達載體2.2設計思路及核心技術2.2.1構建BACE1穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細胞株2.2.2突變構2.2.3轉(zhuǎn)染2.2.4檢測建APP突變基因真核表達載體構建APP突變基因真核表達載體2.2設計思路及核心技術APP基因序列重疊延伸法PCR引入突變位點pcDNA4A+BC+D

采用具有互補末端的引物,使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來的技術。重疊延伸PCR在基因的定點突變中具有重要應用。引物設計重疊延伸法PCR結果突變及檢驗MarkerⅢDNALadder2.3kb雙酶切結果5.0kb2.1kbA673TA673VE682KE693GE693QAPPWTA673TA673VE682KE693GE693QpcDNA420雙酶切驗證結果成功構建5個APP突變基因真核表達載體。野生APP基因約為2.3kb，pcDNA4為5.1kb，選用內(nèi)切酶為HindⅢ和XbaⅠ，下圖為瓊脂糖凝膠電泳結果（酶切后兩片段約為2.1kb和5.0kb）：重組檢驗自左向右：1為Maker；2、3為APPA673T；4、5為APPA673V;6、7為APPE682K;8、9為APPE693G;10、11為APPE693Q。其中，2、3、4、6、7、8、9、10、11為陽性結果。說明成功構建APP突變基因真核表達系統(tǒng)。2.2.1構建BACE1穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細胞株2.2.2突變構2.2.3轉(zhuǎn)染2.2.4檢測建APP突變基因真核表達載體構建APP突變基因真核表達載體2.2設計思路及核心技術脂質(zhì)體介導瞬時轉(zhuǎn)染2.2.1構建BACE1穩(wěn)轉(zhuǎn)HEK293細胞株2.2.2突變構2.2.3轉(zhuǎn)染2.2.4檢測

建APP突變基因真核表達載體構建APP突變基因真核表達載體2.2設計思路及核心技術檢測APP、C99和AβWesternBlot、ELlSA、質(zhì)譜APPC83APP水解途徑非淀粉樣途徑：被α-分泌酶（→C83）和γ-分泌酶連續(xù)切割淀粉樣途徑：Aβ的產(chǎn)生，被β-分泌酶（670Met～671Asp之間）（→C99）和