2.2.3動物細胞的融合與單克隆抗體

2002年１２月３０日，

兩場籌備了10年的“太空婚禮”首次在神舟四號飛船上舉行，植物細胞“新人”—黃花煙草和革新一號煙草葉肉細胞原生質(zhì)體，動物細胞“新人”是小鼠B淋巴細胞和骨髓瘤細胞，兩批新人同時在“產(chǎn)房”—電融合儀內(nèi)孕育新生命。一段時間后，我國首批”太空娃娃”終于順利誕生。對照實驗結(jié)果表明，細胞融合率大大提高。一、課堂導入“太空婚禮”“太空婚禮”科研項目一：“太空婚禮”科研項目二：

挑戰(zhàn)自我植物體細胞雜交技術動物細胞融合技術植物細胞A植物細胞B去掉細胞壁去掉細胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細胞壁雜種細胞脫分化再分化愈傷組織雜種植株溫故知新:植物體細胞雜交過程二、自主學習1.單克隆抗體的制備和應用2.單克隆抗體的制備過程3.動物融合的過程植物細胞A植物細胞B去掉細胞壁去掉細胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細胞壁雜種細胞細胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株思考：1、動物細胞融合的概念是什么？2、動植物細胞在結(jié)構(gòu)上有何區(qū)別？這對它們雜交或融合過程有什么影響？3、植物體細胞雜交誘導原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？那動物細胞融合呢？4、動物細胞融合與植物原生質(zhì)體融合的基本原理是否相同？是什么原理？5、動物細胞融合有什么意義？主要應用在哪些方面？三、講練結(jié)合（一）、動物細胞融合動物細胞A動物細胞B誘導、融合雜合的細胞有絲分裂2個完整的雜交細胞AB討論：6、植物體細胞雜交可得到雜種植株，動物細胞融合后能象電影上一樣形成雜種動物個體嗎?為什么？植物細胞A植物細胞B去掉細胞壁去掉細胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細胞壁雜種細胞細胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株

1970年，有兩位科學家做了一個著名的實驗：人—鼠細胞融合的實驗，以證明細胞膜上的蛋白質(zhì)分子是運動的。人—鼠細胞是怎樣實現(xiàn)融合的？動物細胞融合有什么實踐意義呢？一、動物細胞融合1.細胞融合：是指兩個或兩個以上的細胞融合為一個細胞的過程。⑴自然發(fā)生：

受精卵⑵人工誘導：

利用誘導劑誘導動物細胞融合

誘導因素：聚乙二醇、滅活的病毒或電激等。

鼠細胞人細胞人工誘導動物細胞融合雜交細胞仙臺病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細胞）保留融合活性（誘導細胞融合）①什么是病毒的滅活？滅活是指用物理或化學手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。②滅活病毒誘導細胞融合的原理病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜交細胞（細胞膜具有一定的流動性）正在融合的淋巴細胞與骨髓瘤細胞正在融合的雞血細胞⑶動物細胞融合的原理：細胞膜的流動性

把兩個不同的動物細胞放在一起，用滅活的病毒處理細胞，它們先發(fā)生質(zhì)融合，再出現(xiàn)核融合，進而形成雜交細胞。融合后的雜交細胞經(jīng)過有絲分裂后仍能形成兩個完整的雜交細胞細胞膜的流動性滅活病毒、PEG、電激等融合后的細胞進行有絲分裂，形成完整的雜交細胞誘導的手段？融合后細胞的類型？AB雜種細胞遺傳物質(zhì)有什么特點？三種AA、AB、BB（A、B）含兩種生物的遺傳物質(zhì)動物細胞融合過程原理？物理法的融合效率較高,且對細胞（原生質(zhì)體）的傷害小,易操作、控制和觀察。太空中處于失重狀態(tài)，不同種細胞（原生質(zhì)體）更容易親近；為什么在太空中細胞（原生質(zhì)體）融合率會大大上升？為什么選用物理法誘導？2、動物細胞融合的應用1.突破有性雜交方法的局限,使遠緣雜交成為可能。2.成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等3、重要用途：制備單克隆抗體。四、合作探究比較植物、動物細胞融合獲得雜種植株物理、化學方法（同左）滅活的病毒

物理（離心、振蕩、電激）化學（聚乙二醇）直接誘導細胞融合去壁—原生質(zhì)體融合—誘導新壁—雜種植株細胞膜的流動性細胞膜的流動性結(jié)果誘導方法步驟融合的原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目獲得雜交細胞五、才華展示【例1】能使動物細胞融合的特有的誘導因子是（）A.離心B.滅活的病毒C.電刺激D.振動【例2】融合后的雜交細胞的遺傳物質(zhì)有何特點（）具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息B.能無限增殖C.可形成新個體D.培養(yǎng)過程會貼壁【例3】動物細胞融合的作用中最重要的是（）A.克服遠源雜交不親和B.制備單克隆抗體C.培育新物種D.生產(chǎn)雜種細胞

BB初試牛刀A使用相應的抗體檢測乙肝病毒——抗原(二)、單克隆抗體的制備

醫(yī)院一般怎樣檢測人體內(nèi)是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式圖

凡能夠引起機體產(chǎn)生特異性免疫應答的物質(zhì)叫做抗原。1、什么是抗原？例如花粉、病菌、病毒等。有時自身的組織或細胞也會成為抗原，如癌細胞等。抗原決定簇：抗原表面具有的某些特定的化學基團，能決定抗原特異性，是免疫細胞識別抗原的重要依據(jù)。各種抗原的決定簇數(shù)目不同，同一抗原的決定簇可能有多種。

2、什么是抗體？由何種細胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?起何作用？

當機體受到抗原刺激劑后由效應B細胞（漿細胞）產(chǎn)生的，并且能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白——抗體。

抗體分布于血清中，也分布于組織液及外分泌液中。抗體與相應抗原特異性結(jié)合

抗體由何種細胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?3、抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法：從血清中分離抗體多種漿細胞動物體內(nèi)多種抗體抗原血清抗體（也稱多克隆抗體）由血清中提取的抗體是由不同淋巴細胞產(chǎn)生的多種抗體的混合物，可達百萬種以上，稱為多克隆抗體。特點：產(chǎn)量低、純度低、特異性差、反應不夠靈敏?？乖患兛贵w不純

抗原動物體內(nèi)刺激效應B抗體

每一個B淋巴細胞只分泌一種化學性質(zhì)單一，特異性強的抗體。如果利用單個B淋巴細胞進行無性繁殖（克隆），形成細胞群，這樣的細胞群就有可能產(chǎn)生出化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體——單克隆抗體。問題：怎樣獲得化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體呢？在體外培養(yǎng)的條件下，一個B淋巴細胞能無限增殖形成細胞群嗎？什么樣的細胞能夠在體外無限增殖呢？

——腫瘤細胞！

抗體

抗原應答抗體的不純性

動物細胞受到抗原刺激,引起免疫反應產(chǎn)生的球蛋白.不是自己的而又能引起免疫應答反應的物質(zhì)就是抗原.一種抗原有多種不同的決定簇,刺激的是多種B細胞,作用于不同的B細胞后,會產(chǎn)生多種抗體,這是多克隆的,故不純!

4.制備單克隆抗體的思路抗原

B細胞漿細胞抗體

刺激怎么才能得到純的抗體?

光純還不行,還要大量.怎么辦?

但，有問題:

找，什么細胞能無限繁殖呢?

思路就出來了:要想獲單一的純抗體,就必須從一個B細胞出發(fā).讓B細胞大量繁殖(克隆)就可以產(chǎn)生大量抗體了.B細胞是不能無限繁殖的.怎么辦?癌!只有癌細胞.但它不能產(chǎn)生抗體.癌細胞能無限繁殖,但不能產(chǎn)生抗體.B細胞能產(chǎn)生抗體,但不能大量繁殖.融合呀!只要將兩個細胞融合即可互補.

5.技術思路的重點雜交瘤細胞

HAT篩選

McAb大量培養(yǎng)PEG誘導細胞融合免疫B

脾礦物油骨髓瘤瘤問題:在培養(yǎng)體系中,有5種細胞.B細胞、瘤細胞,和雜交細胞。我們還是拿不到McAb,怎么辦?篩選！篩出雜交瘤細胞。怎么篩?

又是一個思路問題。關鍵一步⑵如何誘導融合？

加入聚乙二醇（PEG）⑴如何得到B淋巴細胞？6.制備單克隆抗體的過程⑶細胞兩兩融合后，有哪些類型？B-BB-瘤(雜交瘤細胞)瘤-瘤⑷如何篩選出雜交瘤細胞？

單克隆抗體制備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的。

①首先用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞①細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。②人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細胞中只有D途徑，沒有S途徑，可是能不斷分裂增殖。你想到篩選雜交瘤細胞的方案了么？

小資料：在培養(yǎng)液中加入氨基蝶呤，收集增殖細胞！加入氨基嘌呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的骨髓瘤細胞及其彼此融合的細胞就不能增殖，但人淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合后的雜種細胞因為可以利用淋巴細胞中的S途徑合成DNA而增殖。例：已知細胞增殖時合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。人淋巴細胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細胞中盡管沒有S途徑，但能不斷分裂增殖，將兩種細胞在培養(yǎng)液中混合，加聚乙二醇促融，在培養(yǎng)液中有種細胞。加入氨基喋呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的及其彼此融合的細胞不能增殖。人淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合后的雜交細胞中可利用淋巴細胞中的S途徑合成DNA而增殖。從培養(yǎng)液中分離出雜交細胞。如何篩選出培養(yǎng)液中的雜交瘤細胞？5骨髓瘤細胞通常采用有限稀釋克隆細胞的方法，將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使每孔細胞不超過一個，再由這些單細胞克隆生長，然后檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。最終選出分泌預定特異抗體的雜交細胞株進行擴大培養(yǎng)。②再篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細胞陽性孔方法——抗原-抗體雜交法

在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的原理和方法是不相同的。⑻如何得到大量的單克隆抗體？

體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)單克隆抗體

——化學性質(zhì)單一、特異性強注射抗原效應B細胞骨髓瘤細胞融合多種雜交細胞選擇性培養(yǎng)基

篩選1抗原-抗體雜交法克隆化單克隆抗體

篩選24.第一次篩選出的雜交瘤細胞為何需進行克隆化培養(yǎng)和專一抗體檢測？單克隆抗體篩選雜交細胞雜交瘤細胞體外或體內(nèi)細胞培養(yǎng)篩選骨髓瘤細胞誘導細胞融合特異性雜交瘤細胞雜交瘤細胞系提取經(jīng)過免疫的B淋巴細胞動物細胞融合技術動物細胞培養(yǎng)技術單克隆抗體的制備過程：特點：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點：特異性強靈敏度高可大量制備注射抗原免疫7、單抗隆抗體的應用①作為診斷試劑②定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病用于體外診斷人類和動植物疾病及病原鑒定，純度高、特異性強，具有準確、高效、簡易、快速的優(yōu)點。③用于治療疾病和運載藥物利用同位素標記單抗，在特定組織成像

制成生物導彈，將藥物定向帶到癌細胞所在的位置，在原位殺死癌細胞，療效高、副作用小。單克隆抗體的優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，并可以大量制備。用于治療疾病和運載藥物①特異性強、靈敏度高

生物導彈——單克隆抗體＋抗癌藥物

②療效高、毒副作用小結(jié)合同位素的單抗-----生物導彈1、動物細胞融合的目的中最重要的是（）

A.克服遠源雜交不親和

B.制備單克隆抗體

C.培育新物種

D.生產(chǎn)雜種細胞2、動物細胞融合過程中所用的誘導劑——滅活的病毒，抗原性和感染力的有無是（

）

A.失去抗原性，具有感染力

B.具有抗原性，也具有感染力

C.失去抗原性，也失去感染力

D.具有抗原性，失去感染力B六、課堂檢測D3、單克隆抗體是指（

）A.單個骨髓瘤細胞增殖產(chǎn)