微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

第四章微生物營養(yǎng)與培養(yǎng)基微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基營養(yǎng)(nutrition)：生物體從外部環(huán)境中攝取對其生命活動必須的能量和物質(zhì)，以滿足正常生長和繁殖需要的一種最基本的生理功能。營養(yǎng)物(nutrient)：具有營養(yǎng)功能的物質(zhì)。

營養(yǎng)物提供生命活動的結(jié)構(gòu)物質(zhì)、能量、代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和良好的生理環(huán)境。一些微生物可利用非物質(zhì)形式的能源

光能。

微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基一、細胞化學(xué)組成

整個生物界大體相同，主要是C、H、O、N（占干重90－97%），C占約50%，此外為各種無機元素，由這些元素再組成化合物。

第一節(jié)微生物的六種營養(yǎng)要素微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基元素大量元素：碳、氫、氧、氮、磷、硫其他元素：鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、錳、銅、鈷、鋅、鉬等存在方式有機物：蛋白質(zhì)、糖、脂類、核酸、維生素、降解產(chǎn)物、代謝中間產(chǎn)物無機鹽灰分水—細胞濕重的70%~90%微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基元素細菌酵母菌霉菌碳5049.847.0氮157.55.2氫85.76.7氧2031.140.2磷31.51.2硫10.30.2

微生物細胞中幾種主要元素的相對含量（%干重）

微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基一般生物能利用的，微生物能利用；一般生物不能利用的，微生物也能利用；對一般生物有害的，微生物還能利用。微生物是雜食性的：微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基二、主要營養(yǎng)物及其功能

碳源（Carbonsource）氮源（Nitrogensource)能源（Energysource)生長因子（Growthfactor)無機鹽(Inorganicsalt)水(Water)六種營養(yǎng)要素

微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

參與微生物細胞的組成提供微生物機體進行各種生理活動所需的能量形成微生物代謝產(chǎn)物的來源功能:營養(yǎng)物質(zhì)是微生物新陳代謝和一切生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，失去這個基礎(chǔ)，生命也就停止。微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

異養(yǎng)微生物：必須利用有機碳源自養(yǎng)微生物：能利用無機碳源（一）碳源(carbonsource)

提供微生物營養(yǎng)所需碳元素的營養(yǎng)源。

有機碳源：蛋白質(zhì)，核酸，淀粉，葡萄糖等無機碳源：CO2,

Na2CO3,CaCO3等微生物對碳源選擇性：糖類一般是良好碳源和能源，對不同糖利用不同。E.Coli在G和半乳糖培養(yǎng)基生長，G為速效碳源，后者為遲效碳源。微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

有機氮源：蛋白胨、黃豆粉、玉米漿無機氮源：NH4NO3、(NH4)2SO4

氣態(tài)氮源：大氣N2（二）氮源(nitrogensource)凡能提供微生物營養(yǎng)所需氮元素的營養(yǎng)源。

氮源一般不作能源。速效氮源遲效氮源微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基能為微生物的生命活動提供最初能量來源的化學(xué)物質(zhì)或輻射能。（三）能源(energysource)無機物：化能自養(yǎng)微生物的能源能源譜化學(xué)物質(zhì)輻射能：光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)微生物的能源有機物：化能異養(yǎng)微生物的能源微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基單功能：輻射能雙功能：還原態(tài)無機養(yǎng)料，如NH4+既是硝酸鹽細菌的能源，又是氮源三功能：N·C·H·O類營養(yǎng)物質(zhì)常是異養(yǎng)微生物的能源，碳源兼氮源

一種營養(yǎng)物具有一種以上營養(yǎng)要素的功能微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基一類對微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳源，氮源自行合成的、所需極微量的有機物。培養(yǎng)基中生長因子來源：酵母膏、玉米漿、麥芽汁等。(四)生長因子(growthfactor)

作用：輔酶或酶活化所需。微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基狹義：維生素廣義：維生素、氨基酸、堿基、脂肪酸等

生長因子自養(yǎng)型微生物（auxoautotrophs)

生長因子異養(yǎng)型微生物（auxoheterotrophs)營養(yǎng)缺陷型微生物（nutritionaldeficiency)變株生長因子過量合成型微生物微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

維生素微生物的種硫胺素(B1)Bacillusanthracis(炭疽芽孢桿菌)核黃素Clostridiumtetani(破傷風梭菌)煙酸Brucellaabortus(流產(chǎn)布魯氏桿菌)吡哆酸(B6)Lactobacillusspp.(各種乳酸桿菌)生物素Leuconostocmesenteroides(腸膜狀明串珠菌)泛酸Proteusmorganii(摩氏變形桿菌)葉酸Leuconostocdextranicum(葡聚糖明串珠菌)鈷胺酸(B12)Lactobacillusspp.維生素KBacteroidesmelaninogenicus(產(chǎn)黑素擬桿菌)

若干細菌所需要的維生素

微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

維生素轉(zhuǎn)移的對象代謝功能硫胺素(B1)

乙醛基焦磷酸硫胺素是脫羧酶、轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶的輔基，與a－酮酸的氧化脫羧和酮基轉(zhuǎn)移有關(guān)吡哆醇(B6)

氨基磷酸吡哆醛是氨基酸消旋酶、轉(zhuǎn)氨酶與脫羧酶的輔基，參與氨基酸的消旋、脫羧和轉(zhuǎn)氨葉酸甲基即輔酶F(四氫葉酸)，參與一碳基的轉(zhuǎn)移，與合成嘌呤、嘧啶、核甘酸、絲氨酸和甲硫氨酸有關(guān)維生素B12

羧基，甲基鈷酰胺輔酶，參與一碳基的轉(zhuǎn)移，與甲硫氨酸和胸苷酸有關(guān)

維生素的生理功能微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基（五）無機鹽(inorganicsalts)所需濃度在10-3-10-4M的元素為大量元素

所需濃度在10-6-10-8M的元素為微量元素微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基無機鹽的生理功能無機鹽大量元素微量元素一般功能特殊功能細胞內(nèi)一般分子成分(P、S、Ca、Mg、Fe等)生理調(diào)節(jié)物質(zhì)滲透壓的維持(Na+等)酶的激活劑(Mg等)pH的穩(wěn)定化能自養(yǎng)菌的能源(S、Fe2+、NH4+、MO2-等)

無氧呼吸時的氫受體(NO3-、SO42-等)酶的激活劑(Cu2+、Mn2+、Zn2+等)特殊分子結(jié)構(gòu)成分(Co、Mo等)微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基生理作用：細胞組成成分生化反應(yīng)溶劑化學(xué)、生理反應(yīng)介質(zhì)物質(zhì)運輸媒體調(diào)節(jié)細胞溫度維持細胞的滲透壓（六）水存在狀態(tài)：游離態(tài)（溶劑）和結(jié)合態(tài)（結(jié)構(gòu)組成）微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

依碳源不同：異養(yǎng)型(heterotrophs):不能以CO2為主要或唯一碳源自養(yǎng)型(autotrophs):能以CO2為主要或唯一碳源第二節(jié)微生物營養(yǎng)類型依能源不同：光能營養(yǎng)型(phototrophs):光反應(yīng)產(chǎn)能化能營養(yǎng)型(chemotrophs):物質(zhì)氧化產(chǎn)能依生長因子的不同：原養(yǎng)型(prototroph)或野生型(wildtype)

營養(yǎng)缺陷型(auxotroph)微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基微生物的營養(yǎng)類型

營養(yǎng)類型能源碳源實例光能自養(yǎng)型光能CO2藍細菌紫硫細菌綠硫細菌藻類光能異養(yǎng)型光能CO2

及簡單有機物紅螺細菌化能自養(yǎng)型

無機物CO2硝化細菌硫化細菌鐵細菌氫細菌化能異養(yǎng)型有機物有機物絕大多數(shù)微生物，原生動物微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

寄生型(parasitism)——寄生于活的生物體腐生型(saprophytism)——寄生于死亡的生物有機體化能異養(yǎng)型營養(yǎng)類型劃分不是絕對的，不同生活條件下，可相互轉(zhuǎn)變。異養(yǎng)微生物：至少需提供一種大量有機物才能滿足其正常要求的微生物,即其碳源必須是有機物，氫供體是有機物，能源則可以利用氧化有機物或吸收日光能而獲得。自養(yǎng)微生物：不依賴于任何有機營養(yǎng)物即可正常生活的微生物。微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基第三節(jié)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收

營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的分泌，涉及到物質(zhì)的運輸、營養(yǎng)物吸收至胞內(nèi)被利用、代謝物分泌到胞外以免積累，這就是物質(zhì)運輸過程。在營養(yǎng)物質(zhì)運送方面，細胞壁僅簡單地排阻分子量過大(>600Da)的溶質(zhì)進入,而具有磷脂雙分子層和嵌合蛋白分子的細胞膜則是控制營養(yǎng)物質(zhì)進入和排除的主要屏障。

通透性與吸收是不同概念

一般大分子先水解為小分子，再吸收

脂溶性物質(zhì)：易透過微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基一、單純擴散

(simplediffusion)依靠胞內(nèi)外溶液濃度差，順濃度梯度運輸；不消耗代謝能，無特異性；運輸氧、二氧化碳、甘油、乙醇、某些氨基酸等小分子；

親脂性分子從高濃度到低濃度的擴散來運輸，利用細胞膜的通透性，細胞膜是一道屏障。

微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基二、促進擴散(facilitateddiffusion)利用膜內(nèi)、膜外被運輸物質(zhì)和載體蛋白的親和力的不同。特點：需要特異性的載體蛋白順濃度梯度運輸不消耗能量運輸硫酸根、磷酸根、糖（真核）載體蛋白(carrierprotein)，即透性酶（大多為誘導(dǎo)酶），有底物特異性，每種載體蛋白運輸相應(yīng)的物質(zhì)。載體蛋白可加快運輸速度，但不能逆濃度運輸。微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基單純擴散、促進擴散、主動運輸：被運輸?shù)娜苜|(zhì)分子不發(fā)生改變。

3、主動運輸

(activetransport)特點：是微生物吸收營養(yǎng)的主要方式可逆濃度梯度運輸，耗能需載體蛋白，有特異性運輸有機離子、無機離子、氨基酸、乳糖等糖類

微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基特點：屬主動運輸類型溶質(zhì)分子發(fā)生化學(xué)修飾

定向磷酸化需復(fù)雜的運輸酶系參與運輸葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等4、基團轉(zhuǎn)位(grouptranslocation)膜對大多數(shù)磷酸化合物具有高度的不滲透性。每輸入一個葡萄糖分子，就要消耗一個ATP的能量。微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基主要依賴磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)。PEP+HPrEI丙酮酸+P-HPrP-HPr+糖EII糖-P+HPr1.熱穩(wěn)定性載體蛋白(heatstablecarrierprotein,HPr)的激活

2.糖磷酸化后運入膜內(nèi)

微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基基團轉(zhuǎn)位運輸葡萄糖示意圖兩類磷酸烯醇式丙酮酸：糖基磷酸轉(zhuǎn)移酶(PTS)系統(tǒng)高能磷酸從HPr轉(zhuǎn)移至溶解態(tài)EIIA,EIIA與EIIB在甘露糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中相連，在葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中分開。無論那種形式，磷酸都從EIIA轉(zhuǎn)移至EIIB，再經(jīng)過穿膜的轉(zhuǎn)運過程而轉(zhuǎn)移至糖基。磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),第一個酶I(EI),低分子量熱穩(wěn)定性載體蛋白(HPr),第二個酶I(EII)胞質(zhì)細胞質(zhì)基質(zhì)微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基培養(yǎng)基(medium，culturemedium)：是一種人工配制的、適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物用的混合養(yǎng)料。第四節(jié)培養(yǎng)基微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基（一）四個原則

1、目的明確（根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基）

培養(yǎng)什么微生物、獲得什么產(chǎn)物、用途二、選擇和配制培養(yǎng)基的原則和方法2、營養(yǎng)協(xié)調(diào)

營養(yǎng)協(xié)調(diào)(注意營養(yǎng)物的濃度和配比，特別是碳氮比C/N比)微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基C/N比:微生物培養(yǎng)基中所含的碳源中的碳原子與氮源中氮原子的摩爾數(shù)之比。不是簡單的某碳源的重量與氮源的重量之比。因為，不同種類的碳源和氮源，其中含碳量和含氮量差別很大。一般培養(yǎng)基的C/N比為100/0.5～2。以含氮量來看：NH3(82%)>CO(NH2)2(46%)>NH4NO3(35%)>(NH4)2CO3(29.2%)>(NH4)2SO4(21%)微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基適宜營養(yǎng)物質(zhì)的選擇表3微生物常見的有機碳源種類舉例說明單糖葡萄糖，麥芽糖，果糖，麥芽糖，半乳糖，木糖用作速效碳源，但會加速菌體呼吸，溶氧下降中間代謝物積累二糖蔗糖用作速效碳源，但會加速菌體呼吸，溶氧下降中間代謝物積累多糖淀粉，玉米粉，纖維素遲效碳源。纖維素只有少數(shù)微生物能夠作為碳源。糖蜜甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜是非常好的碳源，成分復(fù)雜，在發(fā)酵工業(yè)中常用酵母發(fā)酵、抗生素和丙酮丁醇生產(chǎn)常用它為碳源。一般包括蔗糖35%，葡萄糖9%，果糖7%，8種其它糖類4%，其它還原物質(zhì)3%，24種氨基酸占4.5%，有機酸5%，蠟質(zhì)、甾醇和磷脂占0.4%，灰分12%，水20%。麥芽發(fā)芽的大麥主要培養(yǎng)酵母用，工業(yè)上用麥芽汁發(fā)酵，制作啤酒。油脂棉籽油，玉米油，豆油，葵花籽油等。熱值高，液體培養(yǎng)時消耗氧氣多。在工業(yè)上常常少量添加作為消泡劑使用。醇類甲醇，甘油甲醇被用來培養(yǎng)酵母。烴類CH4，C2H6，C4H10，C12~C20烷烴溶解性不好，液體培養(yǎng)對攪拌要求高。有機酸乙酸，乳酸，檸檬酸等利用會導(dǎo)致pH上升微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基表不同能源培養(yǎng)細胞的得率碳源基質(zhì)葡萄糖（糖蜜）甲烷正烷烴甲醇乙醇醋酸鹽順丁烯二酸鹽細胞得率（g細胞/g基質(zhì)）0.510.621.030.400.680.340.36微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基表常見微生物氮源種類可以利用的微生物特點有機氮源：牛肉浸膏、酵母浸膏、花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉、麥麩、尿素等大部分微生物，如青霉，酵母，大腸桿菌。含有豐富的氨基酸，是微生物的優(yōu)良氮源。無機氮源：銨鹽、硝酸鹽、氨水等部分微生物（氨基酸異養(yǎng)型不能利用）硝酸鹽要還原后才能用，可以同時調(diào)節(jié)pH。N2少數(shù)細菌（約50多個屬，100多種）生物固氮是地球上僅次于光合作用的第二個重要的生物化學(xué)反應(yīng)。微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基表常用的培養(yǎng)基中的無機鹽及參考濃度（g/L）無機鹽提供的元素參考濃度培養(yǎng)基名稱MgSO4Mg0.5察氏培養(yǎng)基KH2PO4/K2HPO4K，P0.12/1.0克氏培養(yǎng)基KClK0.5察氏培養(yǎng)基NaClNa5牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基CuSO4﹒5H2OCu0.016氧化硫酸桿菌培養(yǎng)液ZnSO4﹒7H2OZn0.22氧化硫酸桿菌培養(yǎng)液FeSO4Fe0.01察氏培養(yǎng)基CaCl2﹒2H2OCa0.25氧化硫酸桿菌培養(yǎng)液NaHCO3Na0.1藍細菌培養(yǎng)基MnCl2﹒4H2OMn0.05氧化硫酸桿菌培養(yǎng)液（NH4）6Mo7O24﹒4H2OMo0.01氧化硫酸桿菌培養(yǎng)液微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基pH

滲透壓和水活度氧化還原電位3、物理化學(xué)條件適宜:微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

細菌:pH7.0~8.0

放線菌：pH7.0~8.5

酵母菌:pH3.8~6.0

霉菌：pH4.0~6.0pH：微生物有最佳生長pH微生物在生長過程中培養(yǎng)基pH值可能發(fā)生的變化：在含糖基質(zhì)上生長,會產(chǎn)酸而使pH下降，在分解蛋白質(zhì)和氨基酸時,會產(chǎn)NH3而使pH上升，以(NH4)2SO4

作N源,會過剩SO42-,而使pH下降，分解利用陽離子化合物如：NaNO3,會過剩Na+而使

pH上升。微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

維持培養(yǎng)基pH的方法使用磷酸緩沖劑：

K2HPO4/Na2HPO4,H2PO4/NaH2PO4采用“備用堿”：CaCO3

、CaHCO3采用弱酸鹽：檸檬酸鹽、乳酸鹽等采用液氨或鹽酸微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基滲透壓(osmoticpressure):高濃度溶液向低濃度溶液滲透時，其溶質(zhì)分子所產(chǎn)生的壓力。

高滲溶液會導(dǎo)致微生物細胞發(fā)生質(zhì)壁分離低滲溶液會導(dǎo)致微生物細胞吸水膨脹甚至破裂微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

水的可利用性用水活度(wateractivity,aw)表示aw：在天然環(huán)境中，微生物可實際利用的自由水或游離水含量。aw=P/Po

P:溶液的蒸汽壓

Po:純水的蒸汽壓水活度需等滲適宜。微生物適宜生長的aw為0.6～0.998之間。在常溫常壓下，純水的aw為1.00在同溫同壓，某溶液的飽和蒸汽壓與純水的飽和蒸汽壓之比。微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基溶液aw30%葡萄糖溶液0.9641%葡萄糖+20%甘油0.9551%葡萄糖+40%蔗糖0.964飽和氯化鈉溶液0.78飽和氯化鈣溶液0.30飽和氯化鎂溶液0.30飽和氨化鋰溶液0.11幾種溶液的水活度值

微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基氧化還原電位Eh（redoxpotential）：氧化還原系統(tǒng)中的還原劑釋放電子或氧化劑接受電子的趨勢。好氧微生物：＞+0.1V。一般+0.3~+0.4V厭氧微生物：+0.1以下兼性微生物：+0.1以上好氧呼吸；+0.1以下進行發(fā)酵微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基4、原料來源的選擇

經(jīng)濟節(jié)約原則:以粗代精、以廢代好、以簡代繁原料來源要廣泛原料要易處理，處理成本要低原料處理后，廢物、廢液、廢氣要少微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基（二）四種方法生態(tài)模擬查閱文獻精心設(shè)計實驗比較微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基

通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型依對培養(yǎng)基成分的了解：

天然培養(yǎng)基(complexmedium,undefinedmedium)，指一些利用動、植物或微生物體或其提取物制成的培養(yǎng)基，成分未知。如培養(yǎng)細菌所用的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基等。

優(yōu)點：取材方便、營養(yǎng)豐富、種類多樣、配制方便微生物營養(yǎng)及培養(yǎng)基組合培養(yǎng)基(definedmedium)，或稱合成培養(yǎng)基

(syntheticmedium