GB∕ T 40392-2021 循環(huán)冷卻水中軍團菌的檢測（正式版）

ICS13.060.70;13.060.25GB/T40392—2021循環(huán)冷卻水中軍團菌的檢測DetectionofLegionellaincirculatingcoolingwater(ISO11731:2017,Waterquality—EnumerationofLegionella,NEQ)國家標準化管理委員會國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布國家標準化管理委員會IGB/T40392—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國石油和化學工業(yè)聯合會提出。本文件由全國化學標準化技術委員會水處理劑分技術委員會(SAC/TC63/SC5)歸口。華測檢測認證集團股份有限公司、中海油天1GB/T40392—2021循環(huán)冷卻水中軍團菌的檢測1范圍本文件規(guī)定了循環(huán)冷卻水中軍團菌的檢測方法。菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測GB/T27405實驗室質量控制規(guī)范食品微生物檢測GB/T27405界定的以及下列術語和定義適用于本文件。3.1軍團菌Legionella鹽緩沖液的活性炭-酵母提取液(BCYE)培養(yǎng)基上生長的特性。3.2嗜肺軍團菌Legionellapneumophila;Lp4通則本文件規(guī)定的檢測應符合GB/T27403并應在二級生物安全防護實驗室(BSL-2)內完成，檢出軍團菌的樣品及培養(yǎng)基應經過無害化處理。2GB/T40392—2021循環(huán)冷卻水中軍團菌數目一般達不到直接涂布檢測的數目(10?CFU/L),應通過膜過濾濃縮水樣提取液培養(yǎng)基(BCYE培養(yǎng)基)生長而在L-半胱氨酸缺失的BCYE培養(yǎng)基(BCYE-Cys培養(yǎng)基)不生長6.1無菌水：應符合GB/T6682—2008中三級水的規(guī)定，于121℃±1℃高6.4L-半胱氨酸缺失的BCYE培養(yǎng)基(BCYE-Cys培養(yǎng)基):按A.2制備或采用市售成品。6.5選擇性培養(yǎng)基(GVPC培養(yǎng)基):按A.3制備或采用市售成品。7.2真空泵。7.4無菌涂布器。7.8無菌接種環(huán)：直徑為3mm。2℃~8℃的冷藏條件下存儲或運輸，最好在2d內檢測，最長不應超過14d。3GB/T40392—20219.1樣品預處理水樣中含有雜質時可靜置沉淀或1000r/min離心1min,取上清液備用。在真空過濾系統上安裝微孔濾膜，取水樣上清液200mL～1000mL過濾，記錄過濾水樣的體積振蕩至少2min(也可將容器放入超聲波振蕩器中振蕩2min～10min,稀釋液液面應低于超聲波振蕩當樣品中軍團菌的菌落數量超過10?CFU/L時，可不進行樣品濃縮處理，計數時按直接涂布法計數。9.2樣品制備9.2.1將9.1.2的濃縮液(無需濃縮時取原液)分成三份。其中一份不做處理，另兩份分別采用熱處理9.2.2熱處理：移取1.0mL濃縮液(或原液)于一無菌容器中，置于50℃±1℃的水浴中加熱30min。為2.2,放置5min。9.3接種接種液均勻涂布于相對應的GVPC培養(yǎng)基平皿的整個表面。9.4培養(yǎng)將已接種的平板倒置放入CO?培養(yǎng)箱中，調節(jié)CO?濃度為2.5%,溫度為36℃±1℃,相對濕度不小于95%,培養(yǎng)10d。9.5檢查平板量。在平板上生長小于300個菌落為宜，如有大量軍團菌生長，則應減少過濾樣品的體積或稀釋濃縮液。軍團菌的生長可能被其他菌掩蓋或抑制，如果懷疑軍9.6菌落驗證在GVPC培養(yǎng)基上2d內生長的菌落均不是軍團菌。從GVPC培養(yǎng)基上選擇3d～10d內生長的疑似軍團菌菌落分別接種到BCYE和BCYE-Cys兩塊培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。如果有不同類型的疑似軍4GB/T40392—2021驗證。將疑似菌落在含2.5%CO?的培養(yǎng)箱中36℃±1℃培養(yǎng)2d。凡在BCYE上生長而在BCYE-Cys上不生長的被確認為軍團菌菌落，記錄每個平板的結果。如需計數時，計算確認的軍團菌菌落數N?占從培養(yǎng)基上挑取的疑似軍團菌菌落數量N的比例。9.7嗜肺軍團菌的鑒定在常規(guī)監(jiān)測中可不進行嗜肺軍團菌的鑒定，在軍團菌疾病暴發(fā)時或有疑似病例時應進行嗜肺軍團菌的鑒定。取BCYE培養(yǎng)基上經確證的軍團菌菌落按附錄B進行鑒定。10軍團菌的計數10.1直接涂布法水樣中軍團菌的計數以每升樣品中的菌落數X計，單位為菌落形成單位每升(CFU/L),按公式(1)計算：…………a——GVPC培養(yǎng)基上疑似軍團菌的菌落數，單位為菌落形成單位(CFU);N?——確認的軍團菌菌落數，單位為菌落形成單位(CFU);N——培養(yǎng)基上挑取的疑似軍團菌菌落數，單位為菌落形成單位(CFU);V——接種的原液的體積的數值，單位為毫升(mL)(原液、熱處理樣品：V=0.1;酸處理樣品：V=0.05)。10.2濃縮法水樣中軍團菌的計數以每升樣品中的菌落數X計，單位為菌落形成單位每升(CFU/L),按公式(2)計算：…………式中：a—-GVPC培養(yǎng)基上疑似軍團菌的菌落數，單位為菌落形成單位(CFU);N?———確認的軍團菌菌落數，單位為菌落形成單位(CFU);N———培養(yǎng)基上挑取的疑似軍團菌菌落數，單位為菌落形成單位(CFU);V?！咳〉臒o菌水的體積的數值，單位為毫升(mL)(V.=15.0);V—種的濃縮液的體積的數值，單位為毫升(mL)(未經處理的濃縮液樣品、熱處理樣品V=0.1;酸處理樣品V=0.05);10.3結果計算分別對未經處理、熱處理和酸處理樣品接種后培養(yǎng)出的軍團菌的數量按照公式(1)或公式(2)進行計算，取結果的最大值作為該水樣中軍團菌的數量X,此數值為此份樣品中軍團菌的最大可能數。5GB/T40392—202111試驗報告團菌的數量X(CFU/L)。6GB/T40392—2021A.1活性炭-酵母提取液培養(yǎng)基(BCYE培養(yǎng)基)A.1.1成分活性炭水A.1.2.1半胱氨酸和焦磷酸鐵的溶解2.0g2.8gA.1.2.2ACES緩沖液將ACES顆粒加入到500mL水中，于45℃~50℃水浴溶解。另取480mL水溶解氫氧化鉀，輕A.1.2.3最終調節(jié)KOH溶液或0.1mol/LH?SO?溶液調節(jié)pH值至6.8±0.2。加入瓊脂，混合均勻后于121℃±1℃高壓蒸氣滅菌15min。滅菌后用冷水浴冷卻至50℃左右，加入溶解好的L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液和焦磷讓平皿上的多余水分干燥，在2℃~8℃下于密封容器中避光儲存1個月。A.3選擇性培養(yǎng)基(GVPC培養(yǎng)基)7多粘菌素B(PolymyxinBsulfate)80000IU/L萬古霉素鹽酸鹽(Vancomycinhydrochloride)納他霉素(Natamycin)可代替放線菌酮。A.3.2抗生素添加劑的制備于-25℃～-15℃保存。使用時，放至室溫后再用。按照BCYE培養(yǎng)基的制備方法(A.1.2)進行配制，在加入α-酮戊二酸單鉀鹽后，再加入3g甘氨酸后調節(jié)pH值為6.8±0.2。在加入溶解后的L-半胱氨酸和焦磷酸鐵后，再加入三種抗生素添加劑(A.3.2),混勻。A.4酸緩沖液A.4.1成分鹽酸氯化鉀A.4.2制備A.4.2.1溶液A:0.2mol/L鹽酸mol/Lmol/LA.4.2.2溶液B:0.2mol/L氯化鉀將14.9g氯化鉀溶解于1L水中，于121℃±1℃高壓蒸汽滅菌15min。A.4.2.3酸緩沖液的玻璃瓶中，該溶液在室溫下避光放置不超過1個月。8GB/T40392—2021A.5氧化酶試劑A.5.1成分四甲基對苯二胺鹽酸鹽水A.5.2制法使用前迅速將上述成分溶于水中。A.6硝酸鹽培養(yǎng)基A.6.1成分硝酸鉀蛋白水A.6.2制法溶解，調節(jié)pH值至7.40,分裝試管，每管約5mL,于121℃±1℃高壓蒸汽滅菌15min。A.6.3硝酸鹽還原試劑A.6.3.2乙液：將甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。A.7尿素瓊脂A.7.1成分蛋白胨氯化鈉葡萄糖磷酸二氫鉀0.4%酚紅溶液瓊脂水20%尿素溶液20gA.7.2制法將除尿素和瓊脂以外的成分配好，并校正pH值，加入瓊脂，加熱溶化并分裝燒瓶，于121℃±1℃高壓滅菌15min。冷卻至50℃~55℃,加入經除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度應為2%,最終pH值應為7.2±0.1。分裝于滅菌試管內，放成斜面?zhèn)溆谩.8營養(yǎng)明膠A.8.1成分9A.8.2制法GB/T40392—2021gmL加熱溶解、校正至pH值7.4～7.6,分裝小管，于121℃±1℃高壓蒸汽滅菌10min,取出后迅速冷卻，使其凝固，最終pH值應為6.8～7.0。A.9馬尿酸水解試劑A.9.11%馬尿酸鈉溶液A.9.1.1成分馬尿酸鈉1.0gA.9.1.2制法將馬尿酸鈉溶于水中，在121℃±1℃高壓蒸汽滅菌15min,避光保存。A.9.23.5%(水合)茚三酮溶液A.9.2.1成分(水合)茚三酮(ninhydrin)1.75g丁醇25mLA.9.2.2制法將(水合)茚三酮溶解于丙酮/丁醇混合液中。該溶液避光冷藏，最多不超過7d。GB/T40392—2021B.1總則B.2試劑或材料B.2.1軍團菌膠乳凝集試劑盒，市售。B.2.4硝酸鹽培養(yǎng)基：按A.6制備或采用市售成品。B.2.7馬尿酸水解試劑：按A.9制備或采用市售成品。B.3生化培養(yǎng)法判定嗜肺軍團菌B.3.4尿素酶試驗：將待檢菌以較大量穿刺接種在尿素瓊脂培養(yǎng)基上，于36℃±1℃培養(yǎng)2h、4h、4℃±2℃冰箱內10min～30min后再觀察結果。仍呈溶解狀或表面溶解時即為明膠液化試驗陽性；勻后于36℃±1℃水浴中溫育或36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。沿著試管壁緩緩加入0.2mL茚三酮溶液，于36℃±1℃水浴中溫育或36℃±1℃培養(yǎng)箱中放置10min后觀察結果。15min內溶液出GB/T40392—2021B.4血清型鑒定當軍團菌乳膠凝集試劑盒中的乳膠顆粒與含軍團菌或者從相關的軍團菌加熱滅活的抗原的懸液混B.4.2初篩用軍團菌乳膠凝集試劑盒初篩血清型，觀察凝結結果，按表B.1將血清型分為Lpl單價、Lp2-14(15)多價和Lpspecies三種。表B.1與1