抗HIV藥物非臨床藥效學研究的一般方法

PAGE14抗HIV藥物非臨床藥效學研究的一般方法HIV可用傳代人T淋巴細胞或原代人外周血單個核細胞培養(yǎng)，T嗜性的病毒株可導致人T淋巴細胞出現(xiàn)特征性細胞病變，如細胞融合、多核巨細胞等。M嗜性的病毒株一般不導致細胞病變，可通過檢測培養(yǎng)上清液的HIVp24抗原、病毒RNA或逆轉(zhuǎn)錄酶活性監(jiān)測病毒復制的情況。體外藥效學試驗一般應重復三次。目前尚缺乏理想的HIV感染動物模型，常采用替代模型或經(jīng)過改造的小動物模型來評價藥物的體內(nèi)抗HIV活性，如感染猴免疫缺陷病毒（Simianimmunodeficiencyvirus，SIV）或嵌合病毒（Simian/humanimmunodeficiencyvirus，SHIV）的猴模型和感染HIV的人淋巴組織重建的嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠模型(Severcombinedimmunodeficient-human，SCID-hu)。本附錄收入了目前較成熟和常用的抗HIV體外、體內(nèi)藥效學試驗方法，供研發(fā)者參考。今后可根據(jù)研究進展情況進一步修訂。一、體外藥效學試驗1、病毒和細胞（1）病毒：應盡可能選擇多種生物學表型和基因型的病毒株，包括HIV實驗室適應株和有代表性的HIV臨床分離株。在進行抗HIV耐藥性毒株的藥效學研究時，應選用耐藥性毒株；對于明確作用靶點的藥物，應首先選擇對該作用靶點藥物耐藥的毒株。（2）細胞：應盡可能選擇多種細胞。常用的有傳代人T淋巴細胞系（如CEM、MT4、MT2、C8166、H9等）、單核巨噬細胞系（如U937等）和活化的人原代外周血單個核細胞（PBMC）。（3）病毒感染劑量的確定：測定HIV的感染劑量一般采用在96孔細胞培養(yǎng)板上微量培養(yǎng)滴定的方法，通過觀察細胞病變或檢測病毒標記物，如HIVp24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶等，計算出病毒的感染性滴度（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量，50%Tissuecultureinfectiousdose，TCID50）。在不同的細胞系/病毒株培養(yǎng)系統(tǒng)，使用的病毒感染劑量不盡相同，一般選用100～1000TCID50。2、藥物的細胞毒性測定：將不同濃度的藥物加入細胞培養(yǎng)板中，在特定條件下培養(yǎng)一定時間，用適宜的方法測定活細胞的比例，計算藥物對細胞的毒性（半數(shù)細胞毒性濃度，Mediantoxicconcentration，TC50）。3、抗HIV活性測定：（1）試驗分組空白對照組：正常培養(yǎng)的細胞。陽性對照組：陽性對照藥與病毒和細胞共同培養(yǎng)。陽性對照藥一般選擇與受試藥物作用靶點相同的臨床有效藥物。陰性對照組：藥物溶媒與病毒和細胞共同培養(yǎng)。病毒對照組：病毒和細胞共同培養(yǎng)。藥物對照組：受試藥物與細胞共同培養(yǎng)。試驗組：受試藥物與病毒和細胞共同培養(yǎng)。（2）感染和給藥方法：一般采用藥物、病毒、細胞同時培養(yǎng)的方式，也可以根據(jù)藥物作用的靶點采取藥物先與HIV作用再加細胞、藥物先與細胞作用再加HIV或HIV先感染細胞再加藥物的感染和給藥方式。（3）監(jiān)測指標和方法：細胞病變：在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，觀察有無HIV特征性的細胞病變（合胞體以及細胞融合）。HIV抗原：用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中的HIVp24抗原濃度。根據(jù)細胞病變觀察、p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶檢測的結果，計算藥物對病毒的抑制活性（半數(shù)抑制濃度，Medianinhibitionconcentration,IC50）。4、藥效學評價指標由于病毒的存活與復制依賴于宿主細胞，而抗病毒藥物本身有一定的細胞毒性，因此不能僅以細胞病變、p24抗原或逆轉(zhuǎn)錄酶活性作為藥效學評價的指標，而應以治療指數(shù)（TI）為主要的評價指標。一般認為治療指數(shù)大于10的藥物可能具有體外抗HIV活性。5、藥物的聯(lián)合抗HIV活性測定將2～3種不同的藥物加入到同一實驗體系中，按照前述的方法監(jiān)測病毒的抑制情況，判斷藥物對病毒的聯(lián)合作用。實驗中除了設置一般體外藥效學研究需要的對照以外，還應有各單藥對照。聯(lián)合二、體內(nèi)藥效學試驗1、SIV感染猴模型（1）病毒：SIV毒株，靜脈注射或粘膜感染。（2）動物：恒河猴、食蟹猴等，體重5公斤左右，動物數(shù)應滿足評價的要求，一般每組4～6只。（3）病毒感染劑量的測定：可采用兩種方法，一種方法是用保存的毒種在體外感染猴淋巴細胞，初步確定病毒的感染劑量。一般選擇三個劑量組，每組間10倍稀釋，每個稀釋度接種兩只猴，感染后不同時間取血，通過細胞培養(yǎng)測定病毒滴度，并定量檢測SIVRNA，以兩只猴均感染的最小劑量作為最小感染量（Monkeyinfectiousdose，MID100）。另一種方法是用感染猴的血漿接種猴，感染后每周取血測定SIV抗原和細胞培養(yǎng)病毒，計算半數(shù)感染量（Medianinfectiousdose,ID50）。（4）SIV感染猴治療試驗：急性感染治療試驗：猴靜脈注射10～100ID50或5MID100的SIV，同時或4小時后口服或注射最大無毒劑量以下2倍遞減2個劑量的藥物，每天給藥，連續(xù)8周。每周取血，培養(yǎng)病毒，測定SIVp27抗原滴度和SIVRNA，計算保護百分率，并與病毒對照組進行比較。給藥前、停藥當天和停藥后8周進行淋巴結檢查，觀察免疫系統(tǒng)的病理改變。另外，還要測定CD4+、CD8+細胞數(shù)和CD4+/CD8+比值。慢性感染治療試驗：猴靜脈注射10～100ID50或5～10MID100的SIV，感染后60天左右開始給藥，一般試驗組在最大無毒劑量以下2倍遞減2個劑量。每天給藥，連續(xù)8周。于給藥前、給藥第8周、停藥當天和停藥后8周取血，測定SIVp27抗原滴度和SIVRNA，計算保護百分率，并與病毒對照組進行比較。給藥前、停藥當天、停藥后8周進行淋巴結檢查，觀察免疫系統(tǒng)的病理改變。另外，還要測定CD4+、CD8+細胞數(shù)和CD4+/CD8+比值。2、HIV感染SCID-hu小鼠模型（1）動物：SCID小鼠，4～8周齡，雌性，靜脈注射人PBMC或移植人胚胸腺/肝臟組織。（2）HIV感染劑量測定：將HIV細胞培養(yǎng)上清液10倍連續(xù)稀釋5個濃度，靜脈注射或移植組織注射感染小鼠。1周后取小鼠的血液、脾、淋巴結和腹腔洗液，定量培養(yǎng)，測定病毒滴度，HIVp24抗原、病毒載量，計算ID50。（3）藥物毒性測定：SCID-hu小鼠灌服或靜脈注射給藥，測定急性毒性和亞急性毒性，計算半數(shù)致死量（Medianlethaldose,LD50）和最大耐受量（0%Lethaldose,LD0）。（4）HIV感染SCID-hu小鼠藥物治療試驗：SCID-hu小鼠腹腔注射10～100ID50HIV，2～24小時后灌服或靜脈注射給藥。感染1周后，取血液、脾、淋巴結和腹腔洗液，定量培養(yǎng)，測定病毒滴度，HIVp24抗原、病毒載量，計算抑制率和半數(shù)有效劑量（Medianeffectivedose,ED50），并與病毒感染對照組進行比較。附錄二：耐藥性研究的相關問題考察藥物對HIV耐藥性毒株是否有抗病毒活性，至少應該評價對相同作用靶點的耐藥性毒株的抗病毒活性，所選用的耐藥性毒株應該經(jīng)過全面的鑒定。由于抗HIV藥物已經(jīng)有很多種，交叉耐藥性是臨床上的一個重要問題，因此應關注藥物對于相同作用靶點有耐藥性的病毒的抗病毒活性，及已上市藥物對受試藥物誘導的耐藥毒株的抗病毒考察藥物是否容易導致病毒產(chǎn)生耐藥性以及耐藥性毒株的生物學特性，可在體外進行耐藥毒株的誘導試驗，以確定藥物是否容易導致病毒產(chǎn)生耐藥性以及耐藥性毒株的基因型和表型特征，并檢驗交叉耐藥性。有些藥物的遺傳閾值比較低，病毒基因發(fā)生1～2個點突變就可產(chǎn)生耐藥性，而有些藥物的遺傳閾值比較高，需要多個基因位點的突變才能產(chǎn)生耐藥性?？刹捎脙煞N方法誘導藥物的耐藥毒株：（1）病毒在固定的藥物濃度下連續(xù)傳代，可使用多個不同藥物濃度的培養(yǎng)系統(tǒng)，這種方法對于遺傳閾值低的藥物比較有效；（2）病毒在逐漸增加藥物濃度的情況下連續(xù)傳代培養(yǎng)，藥物濃度從IC50值的一半起始，監(jiān)測病毒復制的情況并誘導出耐藥毒株。用基因型和表型方法對誘導出的耐藥毒株進行鑒定?；蛐头治隹梢源_定哪些基因突變導致HIV對藥物的敏感性下降，主要方法是對HIV基因組中藥物作用的靶基因進行核酸序列測定，并與野生毒株的靶基因序列進行比較。對傳代過程中不同代次的毒株進行序列測定可確定多個突變出現(xiàn)的先后順序。表型耐藥性分析能夠確定突變的病毒是否對藥物的敏感性下降以及下降的程度。耐藥性相關基因突變的確定有助于使用重組病毒系統(tǒng)評估這些突變導致的表型耐藥性，也就是使用定點誘變系統(tǒng)或PCR方法擴增病毒基因組相應的部分引入這些特定的突變，以便檢測重組病毒在體外對藥物的敏感性；也可以采用在含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方法，通過測定HIV抗原、HIVRNA、HIV逆轉(zhuǎn)錄酶、細胞毒性或報告基因的表達等確定IC50值并與參附錄三：名詞解釋是使50%細胞感染的病毒稀釋度。半數(shù)有效量（Medianeffectivedose）：是能引起50%陽性反應或50%最大效應的濃度或劑量，分別用半數(shù)有效濃度（EC50）、半數(shù)抑制濃度（IC50）或半數(shù)有效劑量（ED50）表示。如果效應指標為毒性或死亡，則可改為半數(shù)毒性濃度（TC50）、半數(shù)毒性劑量（TD50）或半數(shù)致死濃度（