《單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)平臺(tái)及案例分析》

北京義翹神州·在線講座一一《單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)平臺(tái)及案例分析》答疑環(huán)節(jié)匯總非常感謝大家對(duì)北京義翹神州在線講座的大力支持，本次講座已圓滿結(jié)束，我們對(duì)直播過(guò)程中答疑環(huán)節(jié)大家的問(wèn)題以及老師的解答進(jìn)行整理如下。如果有需要補(bǔ)充的，有任何建議或想聽到其他更多相關(guān)主題的講座，歡迎來(lái)信和我們交流，我們會(huì)根據(jù)您的寶貴意見不斷完善，以后給大家?guī)?lái)更多更精彩的在線講座！marketing@問(wèn)題1:SingleBcellsorting得到大量的序列，如何快速找到與抗原高親和力的序列？答：在分選之后，先做—個(gè)介入檢測(cè)，比如做培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)上清，先判斷—下上清與抗原結(jié)合的陽(yáng)性，然后再多針對(duì)這些陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。問(wèn)題2：請(qǐng)問(wèn)Bcellculture的過(guò)程中，總是會(huì)有Bcell死掉，請(qǐng)問(wèn)你們的培養(yǎng)最后有多少比例的Bcell能存活下來(lái)？答：我們常規(guī)培養(yǎng)的話，B細(xì)胞正常的存活比例大概能在50%-60°/o,甚至更高。問(wèn)題3:有沒(méi)有從人分離B細(xì)胞產(chǎn)生單抗的案例？答：有的。比如H7N9,EV71這兩個(gè)靶點(diǎn)的抗體都是從人的B細(xì)胞中制備的。問(wèn)題4：請(qǐng)問(wèn)beacon除了抗原抗體親和能力，還能獲得哪些重要的信息？主要是抗體答：beacon除了可以檢測(cè)親和力，還可以進(jìn)行多種屬的結(jié)合檢測(cè)、競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、RNA表達(dá)、抗體亞型、表面Marker檢測(cè)等。問(wèn)題5：你們B細(xì)胞培養(yǎng)是為了將記憶細(xì)胞誘導(dǎo)為漿細(xì)胞嗎/B細(xì)胞是如何擴(kuò)增的？答：我們分選的是lgM＋的記憶B,最后檢測(cè)到lgG,理論上是向漿細(xì)胞分化了。但因?yàn)榕囵B(yǎng)起來(lái)的細(xì)胞數(shù)較少，沒(méi)有進(jìn)行更多表型的驗(yàn)證。問(wèn)題6:單細(xì)胞培養(yǎng)的目的主要是誘導(dǎo)分化和擴(kuò)增嗎？答：是的。單細(xì)胞培養(yǎng)的另—個(gè)目的，是通過(guò)中間介入的檢測(cè)，可以能夠更有效的確定哪些是我們需要的抗原特異性的B細(xì)胞；同時(shí)擴(kuò)增的細(xì)胞可以增加這個(gè)抗體的基因數(shù)量，為后面的擴(kuò)增，能更容易得到抗體。問(wèn)題7：記憶細(xì)胞誘導(dǎo)分化成抗體分泌細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)增的條件是—樣的嗎？答：記憶細(xì)胞誘導(dǎo)分化成抗體分泌細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)增的條件是—樣的。問(wèn)題8:beacon需要做b細(xì)胞培養(yǎng)嗎？答：beacon不做長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)，在短時(shí)間內(nèi)維持細(xì)胞狀態(tài)。問(wèn)題9:beacon可以直接在小室里面測(cè)出抗體滴度，流式只能標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白，還是有差別的吧？答：所以流式分選完后要檢測(cè)培養(yǎng)的上清。問(wèn)題10:請(qǐng)問(wèn)，Bcellsorting和beaconoptofluidic都可以分析占比非常低的亞細(xì)胞群，那哪—個(gè)更有優(yōu)勢(shì)呢？比如同—個(gè)樣本，positivepopulationBcell都很少，哪—個(gè)system更有優(yōu)勢(shì)？答：Beacon是分選和檢測(cè)結(jié)合，功能—體化；流式結(jié)合培養(yǎng)上清檢測(cè)，同樣可以實(shí)現(xiàn)分選加檢測(cè)。前者成本較高且不能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞大量擴(kuò)增，而后者在培養(yǎng)后有更多細(xì)胞做為模板可以用于下游基因擴(kuò)增，性價(jià)比更高。問(wèn)題11:單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的濃度上清ELISA可以檢測(cè)到嗎？答：是的，可以檢測(cè)到。問(wèn)題12:B細(xì)胞怎么做到收集上清？不是培養(yǎng)—段時(shí)間就死亡了嘛？答：我們是整個(gè)96孔板離心，然后排槍取部分上清去檢測(cè)；檢測(cè)陽(yáng)性的孔，也會(huì)鏡下大概觀察單個(gè)B細(xì)胞集落的生長(zhǎng)情況。問(wèn)題13:B細(xì)胞培養(yǎng)的上清里抗體的濃度范圍？答：?jiǎn)蝹€(gè)B細(xì)胞長(zhǎng)起來(lái)的集落大小不等，相應(yīng)抗體分泌量差異也很大；從幾個(gè)μg/ml到幾百μg/ml不等。問(wèn)題14:請(qǐng)問(wèn)，新冠抗體的篩選，—般用多少ml全血，分選出來(lái)的細(xì)胞夠用？答：—次取血20ml。問(wèn)題15:—只小鼠脾臟，能分離出多少陽(yáng)性的B細(xì)胞？答：這個(gè)取決于脾細(xì)胞的總量及陽(yáng)性細(xì)胞的比例，—般情況可以分出800個(gè)細(xì)胞左右。問(wèn)題16:你們—般最后拿多少個(gè)細(xì)胞去測(cè)序？答：取決于最后獲得的抗體數(shù)量，幾十到幾百都有。問(wèn)題17:怎樣獲得B細(xì)胞重鏈輕鏈？答：與輕鏈—樣，都是單細(xì)胞PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)。問(wèn)題18:輕重鏈不是不同染色體編碼的嗎？答：是的，輕重鏈?zhǔn)俏挥诓煌旧w上。問(wèn)題19:為什么我擴(kuò)增VH鏈擴(kuò)不出，VL鏈卻能很好的擴(kuò)出，什么原因呢？答：這是因?yàn)槲覀兲酭NA的時(shí)候，輕鏈處于這個(gè)RNA的3'端的位置，而重鏈離3'端比較遠(yuǎn)，所以當(dāng)我們做反轉(zhuǎn)，尤其是用了Oligod(T)做反轉(zhuǎn)的時(shí)候，更容易擴(kuò)出輕鏈，輕鏈擴(kuò)增效率更高，重鏈會(huì)低—些。問(wèn)題20:分離出來(lái)的B細(xì)胞克隆時(shí)發(fā)現(xiàn)很多重鏈或輕鏈序列相同，表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)不與抗原結(jié)合是怎么回事？答：—般來(lái)說(shuō)是不會(huì)出現(xiàn)這種情況，這種就要去看—下是否是是在做PCR的時(shí)候，會(huì)有交叉污染的情況，擴(kuò)出來(lái)的序列應(yīng)該都是特異的；而且表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)不與抗原結(jié)合，那么分選的時(shí)候因?yàn)橛玫目乖菢?biāo)記后的，標(biāo)記后的抗原它的活性與未標(biāo)記的會(huì)有—定的差異，所以標(biāo)記后的抗原去分選B細(xì)胞，這里特異性是有—個(gè)成功率的問(wèn)題。問(wèn)題21:怎樣設(shè)計(jì)B細(xì)胞重鏈輕鏈的引物／通用引物的設(shè)計(jì)是根據(jù)什么呢？答：根據(jù)抗體可變區(qū)序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。問(wèn)題22:請(qǐng)問(wèn)引物是設(shè)計(jì)的fr區(qū)嗎？答：是的。問(wèn)題23:RT-PCR通用還是每種記憶B細(xì)胞需要設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物？答：相同的種屬，用的都是通用的引物。問(wèn)題24:兔單b分選可用的方法，—般是用通用的羊抗兔igG,再加特異性抗原選擇吧？因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)兔b細(xì)胞表面標(biāo)志物抗原對(duì)應(yīng)的抗體很少商品化的。答：是的。問(wèn)題25:請(qǐng)問(wèn)在做B細(xì)胞分選時(shí)，需要固定細(xì)胞后，再進(jìn)行抗原抗體結(jié)合分選嗎？答：不需要。問(wèn)題26：請(qǐng)問(wèn)流式分選時(shí)特異性抗原標(biāo)記—種marker和雙標(biāo)記差異大么？答：取決于抗原特異性B細(xì)胞的比例和標(biāo)記后的抗原活性。問(wèn)題27:流式分選和細(xì)胞培養(yǎng)階段如何減少RNA酶的污染？答：流式分選階段，在分選前對(duì)分選孔板放置的環(huán)境用事先配好的去RNA酶試劑進(jìn)行噴霎處理，細(xì)胞培養(yǎng)階段沒(méi)有刻意采取措施避免RNA酶的污染，只是做到嚴(yán)格的無(wú)菌操作即可。問(wèn)題28：有沒(méi)有推薦的單細(xì)胞分選儀的品牌及型號(hào)？答：市面上常見的流式分選儀比如BD的Aria系列、Beckman的都可以做單細(xì)胞分選。問(wèn)題29:FACS分選后得到的抗原特異性B細(xì)胞可以擴(kuò)增出輕重鏈序列，但是瞬轉(zhuǎn)到表達(dá)載體后，再進(jìn)行ELISA檢測(cè)均和抗原不結(jié)合，請(qǐng)問(wèn)這是為什么？假設(shè)FACS分選會(huì)有假陽(yáng)性，但是會(huì)有這么多假陽(yáng)性嗎？另外對(duì)千在FACS分選時(shí)二抗非特性結(jié)合現(xiàn)象，貴公司是采用什么方法排除的？謝謝～答：會(huì)有假陽(yáng)性?？梢酝ㄟ^(guò)排除死細(xì)胞干擾、優(yōu)化流式樣品制備的方法來(lái)減少染色過(guò)程造成的假陽(yáng)性。問(wèn)題30:假陽(yáng)性是因?yàn)镸l3抗體非特異導(dǎo)致的嗎？答：B細(xì)胞沒(méi)用到噬菌體技術(shù)，沒(méi)有Ml3干擾。問(wèn)題31：為什么分選出來(lái)的b細(xì)胞，有的得到的hit概率只有1%?陽(yáng)性率和發(fā)現(xiàn)率有什么區(qū)別？答：1%這里指的是得到候選抗體分子的概率，陽(yáng)性率—般指ELISA陽(yáng)性率。問(wèn)題32：抗原陽(yáng)性分選的理論上陽(yáng)性率應(yīng)該挺好的，為啥只有10%左右？答：抗原特異細(xì)胞比例很低，分選和染色都會(huì)有假陽(yáng)性，而且B細(xì)胞培養(yǎng)存活比例是30-60%,中間損失很多。問(wèn)題33:你好，你們是用抗原分選了記憶B細(xì)胞，然后誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)漿細(xì)胞么，為什么陽(yáng)性率才20％左右，有其他廠家據(jù)說(shuō)能到80-90％陽(yáng)性？答：培養(yǎng)不會(huì)達(dá)到這么高的比例；單個(gè)B直接擴(kuò)增是有可能達(dá)到80-90％陽(yáng)性的。問(wèn)題34:您好，咨詢下兔b細(xì)胞怎么分選的？目前還沒(méi)有商業(yè)化的兔b細(xì)胞分選kit答：利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選。問(wèn)題36:請(qǐng)問(wèn)這個(gè)3T3-CD40L的feedercell在共培養(yǎng)之前如何處理？可以用絲裂霉素C處理么？答：可以。問(wèn)題37:從篩選到測(cè)序，到表達(dá)全長(zhǎng)抗體大概要多久？答：常規(guī)時(shí)間的話是大概要兩到三個(gè)月的時(shí)間。問(wèn)題38:免疫完血清效價(jià)大約在多少就算合格了，可以用？答：我們—般免疫完的話，比如兔，它的血清效價(jià)在0.1,就是在稀釋十萬(wàn)倍，十萬(wàn)倍以上的時(shí)候，OD在0.1,那我們就認(rèn)為它可以用了。問(wèn)題39：你們篩選的時(shí)候，血清ICSO—般是多少，篩選出來(lái)的ICSO是0.09ug/ml?答：我們沒(méi)有這樣的數(shù)據(jù)積累，血清上沒(méi)有檢測(cè)過(guò)ICSO。問(wèn)題40:您好，我想問(wèn)—下，你們單細(xì)胞制備抗體，重組表達(dá)后，ICSO(ECSO)大概是多少呢？答：沒(méi)有絕對(duì)的數(shù)值，與抗原的不同，免疫情況，個(gè)體差異，以及篩選的方法都有關(guān)系。問(wèn)題41:怎么做到高通量表達(dá)所有抗體的？答：孔板表達(dá)，上清檢測(cè)。問(wèn)題42:直接單克隆植板嗎，需要上單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)嗎？答：只有l(wèi)OX的方法需要高通量測(cè)序，beacon和流式都不需要。問(wèn)題43:SingleB抗體平臺(tái)能做針對(duì)多重跨膜蛋白靶點(diǎn)的抗體篩選嗎？答：只要有合適的抗原就可以。問(wèn)題44:B細(xì)胞平臺(tái)篩出來(lái)的抗體親和力相比雜交瘤、噬菌體展示，有優(yōu)勢(shì)嗎？答：B細(xì)胞平臺(tái)篩選出來(lái)的抗體，它的通量更大，多樣性更好，而且它的抗體都是天然配對(duì)的，所以跟前兩個(gè)篩選方式比是有它自己獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的。問(wèn)題45:請(qǐng)問(wèn)這幾種系統(tǒng)的recovery效率各有多高？比如放le7個(gè)細(xì)胞進(jìn)去，最后能回收到的單細(xì)胞比例有多少？答：—般我們分選的是抗原特異性的—種記憶B細(xì)胞，在整個(gè)我們分選的細(xì)胞里面，它的比例也就是萬(wàn)分之—，甚至有時(shí)候會(huì)更低。問(wèn)題46：沒(méi)看到你們有b細(xì)胞培養(yǎng)的casestudy，三個(gè)全部是FACS分選，是b細(xì)胞培養(yǎng)還沒(méi)完成嗎？答：這三個(gè)case里面有—個(gè)是通過(guò)流式分選的，另外兩個(gè)是流式分選加B細(xì)胞培養(yǎng)的。問(wèn)題47:請(qǐng)問(wèn)，抗體親和力實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照是如何選擇的？答：選擇陽(yáng)性抗體做對(duì)照。問(wèn)題48:免疫劑量大，可以節(jié)省時(shí)間，但是如果免疫劑量過(guò)大，對(duì)小鼠或者兔子影響大嗎？答：大劑量短時(shí)間免疫—般不做推薦，lgG的轉(zhuǎn)化、抗體親和力的成熟都需要—定的時(shí)間周期。免疫劑量過(guò)大，可能造成動(dòng)物的不耐受而中途死亡，也會(huì)在—定程度上犧牲lgG型抗體比例和所獲得抗體的親和力。問(wèn)題49:免疫動(dòng)物快速免疫程序是如何的？采用什么方式進(jìn)行免疫？答：快速免疫是通過(guò)短時(shí)間內(nèi)大劑量剌激來(lái)達(dá)到—定標(biāo)準(zhǔn)血清效價(jià)的免疫方法，主要借助改變免疫間隔，多免疫途徑、不同免疫佐劑等多方面因素組合完成，快速免疫的合格效果需要經(jīng)后續(xù)抗體制備平臺(tái)驗(yàn)證并確定。問(wèn)題50:—個(gè)B細(xì)胞可擴(kuò)增到多少個(gè)？答：—般單個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)以后，能至少擴(kuò)增到成百上千個(gè)是可以的。問(wèn)題51：?jiǎn)蝹€(gè)B細(xì)胞，是培養(yǎng)＋篩選后挑出—小部分，大概多少個(gè)？來(lái)進(jìn)行提RNA測(cè)序嗎？對(duì)小鼠或者兔子影響大嗎？能否細(xì)化講—講答：幾十到上百都有，根據(jù)靶點(diǎn)。這個(gè)不是提RNA測(cè)序，是直接將細(xì)胞裂解。對(duì)小鼠是直接處死，分選是取脾；兔子分選是取外周血，對(duì)兔子沒(méi)有那么大影響。問(wèn)題52:能用這項(xiàng)技術(shù)找TCRT嗎？答：理論上可以。問(wèn)題53:義翹有沒(méi)有兔B細(xì)胞相關(guān)商業(yè)化抗體？答：有的，具體靶點(diǎn)相關(guān)產(chǎn)品信息可咨詢我們工作人員：400-8909989;order@。問(wèn)題54:您好，請(qǐng)問(wèn)SingleB對(duì)比hybirdoma和phage在抗體的人源化上面有什么優(yōu)勢(shì)嗎？答：人源化是針對(duì)種屬來(lái)說(shuō)的，如果種屬都—樣的話，那么B細(xì)胞它的特點(diǎn)就是天然配對(duì)，然后拿到的克隆比較多，多樣性比較多，所以人源化后面的方法都是—樣。問(wèn)題55:請(qǐng)問(wèn)分選最后的抗原雙標(biāo)記是分別標(biāo)記兩種熒光的抗原，同時(shí)去標(biāo)記分選的細(xì)胞樣本嗎？答：是的。問(wèn)題56:單細(xì)胞檢測(cè)完后，進(jìn)行PCR構(gòu)建到載體上，是不是還得篩選？答：我們說(shuō)PCR構(gòu)建之后，然后到表達(dá)成全抗，肯定還是要再進(jìn)行鑒定的。問(wèn)題57：用什么板子培養(yǎng)B細(xì)胞？整個(gè)過(guò)程哪個(gè)步驟工作量最大？答：我們是分選到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程只需中間吸上清進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，最后收陽(yáng)性孔進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增時(shí)稍微耗時(shí)多—些的。問(wèn)題58：篩選后的b細(xì)胞培養(yǎng)的抗體可以做多少次Elisa實(shí)驗(yàn)？做病毒中和實(shí)驗(yàn)夠嘛？答：96孔培養(yǎng)體系也不是很大，三五次Elisa實(shí)驗(yàn)應(yīng)該是夠的；如果是做病毒中和實(shí)驗(yàn)恐怕不夠。問(wèn)題59:老師你好，請(qǐng)問(wèn)用康復(fù)患者的PBMC進(jìn)行單個(gè)B細(xì)胞篩選抗體，對(duì)康復(fù)患者有何要求？例如，經(jīng)手術(shù)和化療康復(fù)的患者的PBMC篩選B細(xì)胞，得到陽(yáng)性的概率會(huì)不會(huì)很低？答：經(jīng)化療的患者陽(yáng)性率可能會(huì)比較低。問(wèn)題60:細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中，需要在過(guò)程中補(bǔ)加處理過(guò)的Feedcell嗎？Feedcell用的小鼠的cd40l做兔子有沒(méi)有問(wèn)題？答：Feedcell是分選B細(xì)胞前鋪好的，不需要補(bǔ)加；目前用小鼠的cd40l做兔子沒(méi)有問(wèn)題。問(wèn)題61:最終出來(lái)的陽(yáng)性克隆序列多樣性如何？答：特異序列在90％以上。問(wèn)題62:記憶B是帶膜型的lgG,還是lgD?答：lgG。問(wèn)題63：你們有藥物開發(fā)平臺(tái)么，會(huì)提供—個(gè)靶點(diǎn)的外包服務(wù)么？答：可以的，具體相關(guān)內(nèi)容可以咨詢我們技術(shù)服務(wù)的同事：400-8909989;cro-service@。問(wèn)題64:成熟B細(xì)胞、漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞大小有區(qū)別嗎？兔PBMC分選有—個(gè)抗原陽(yáng)性細(xì)胞群比常規(guī)淋巴細(xì)胞大50％到100%答：成熟B細(xì)胞、漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞的大小區(qū)別不大。問(wèn)題65:B細(xì)胞測(cè)序血液里取B細(xì)胞和脾臟里面取B細(xì)胞哪個(gè)好？謝謝！做液滴時(shí)，最大的通量是14000B細(xì)胞？如果想測(cè)幾十萬(wàn)B細(xì)胞如何操作？答：從血液或脾臟中取都可以，脾臟細(xì)胞數(shù)量更多，多樣性更好，建議從脾臟取，如果分選時(shí)間有限，也可以取血。幾十萬(wàn)B細(xì)胞大部分都是非抗原特異性的，如果是為了篩選抗體，這么做沒(méi)必要。問(wèn)題66:—般測(cè)多少B細(xì)胞可以得到ICSO小