體外診斷檢驗系統(tǒng) 病原微生物檢測和鑒定用基于核酸擴增的檢驗程序 實驗室質(zhì)量實踐指南 征求意見稿

1GB/T39367—20XX/ISO17822:2020體外診斷檢驗系統(tǒng)基于核酸擴增的病原微生物檢測和鑒定程序?qū)嶒炇屹|(zhì)量指南本文件描述了基于核酸擴增的微生物病原體檢測、鑒定和定量方法，規(guī)定了在臨床實驗室使用過程中相關的質(zhì)量保證要求。醫(yī)療器械的研發(fā)。但是，本文件包含實驗室實施和使用過程中，對醫(yī)療器械和/或相應過程的性能驗證和性能確認。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ISO15189醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1準確度accuracy測試結(jié)果或測量結(jié)果與真值間的一致程度。2GB/T39367—20XX/ISO17822:20203.2擴增產(chǎn)物amplificationproduct通過DNA擴增技術(shù)產(chǎn)生的特定DNA（3.17）片段，如聚合酶鏈反應（PCR3.34）。3.3分析特異性analyticalspecificity特異性specificity測量系統(tǒng)的能力，用指定的測量程序，對一個或多個被測量（3.28）給出的測量結(jié)果互不依賴也不依賴于接受測量的系統(tǒng)中的任何其他量。3.4生物風險biorisk可能導致危害的特定不良事件（在本文件中：意外感染或未經(jīng)授權(quán)的訪問、丟失、盜竊、誤用、轉(zhuǎn)移或故意釋放）發(fā)生的概率或機會。[來源：世衛(wèi)組織生物風險管理，實驗室生物安保指南，2006年9月]3.5生物安全biosafety描述為防止意外暴露于病原體和毒素或其意外釋放而實施的遏制原則、技術(shù)和實踐。[來源：世衛(wèi)組織生物風險管理實驗室生物安保指南，2006年9月]3.6生物安保biosecurity3GB/T39367—20XX/ISO17822:2020一套預防措施和行動，以減少有意或無意傳播傳染性疾病的風險。注2：這些預防措施是實驗室為防止危險病原體和毒素被惡意使用而3.7校準calibration在規(guī)定條件下的一組操作，第一步是確定由測量標準提供的具有相關測量不確定度的量值與相應示值之間的關系，第二步是用此關系根據(jù)示值確定測量結(jié)果。3.8有證參考物質(zhì)certifiedreferencematerial；CRMRM（3.41）以一種或多種指定特性的計量有效程序表征，并附有RM（3.41）證書，提供規(guī)定屬性的值、相關不確定度和計量學追溯性聲明。3.9臨床性能clinicalperformance<檢驗醫(yī)學>體外診斷檢驗程序產(chǎn)生的特定臨床條件或生理狀態(tài)相關的結(jié)果與目標人群和預期使用者一致的能力。3.10臨床靈敏度clinicalsensitivity診斷靈敏度diagnosticsensitivity<檢驗醫(yī)學>體外診斷檢驗程序可以識別與特定疾病或狀態(tài)相關的目標標志物存在的能力。4GB/T39367—20XX/ISO17822:2020注1：在目標標志物已知存在的樣品（3.443.11臨床特異性clinicalspecificity診斷特異性diagnosticspecificity<檢驗醫(yī)學>體外診斷檢驗程序可以識別特定疾病或狀態(tài)相關的目標標志物不存在的能力。注1：在目標標志物已知不存在的樣品（3.443.12互補DNAcomplementaryDNA；cDNA在逆轉(zhuǎn)錄酶存在下合成的與給定的RNA（3.42）互補的單鏈DNA（3.17作為合成DNA（3.17）拷貝的模板（3.47）。3.13污染contamination非預期材料或物質(zhì)的引入。3.14臨界值（陽性判斷值）cut-offvalue用于鑒別樣品（3.44）,作為判斷特定疾病、狀態(tài)或被測量（3.28）存在或不存在的界限的量值。3.15變性denaturation5GB/T39367—20XX/ISO17822:2020導致核酸雙螺旋分離的物理和/或化學處理。3.16脫氧核糖核苷三磷酸deoxyribonucleosidetriphosphate，dNTP和/或脫氧尿苷三磷酸(dUTP)的溶液。3.17脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid，DNA以雙鏈(dsDNA)或單鏈(ssDNA)形式存在的脫氧核糖核苷酸聚合物。3.18PCR用DNA聚合酶DNApolymeraseforPCR反復催化DNA（3.17）合成的耐熱酶3.19DNA測序DNAsequencing確定DNA（3.17）分子中核苷酸堿基（腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶）的順序。3.20雜交hybridization在適當反應條件下互補核酸（3.32）序列特異性結(jié)合的過程。3.216GB/T39367—20XX/ISO17822:2020抑制inhibition降低擴增或干擾檢測過程，可能導致假陰性結(jié)果或質(zhì)量下降。3.22干擾物質(zhì)interferingsubstances臨床標本/樣品（3.44）中可改變檢查結(jié)果的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)。3.23內(nèi)部檢驗Inhouseassay實驗室自建檢測laboratorydevelopedtest,LDT在一個實驗室內(nèi)設計、制造和使用的一種體外診斷試驗。3.24線性linearity分析方法在一定范圍內(nèi)給出與實驗室樣品（3.44）中待測目標核酸序列（3.46）數(shù)量成比例的儀器響應或結(jié)果的能力。注2：術(shù)語線性經(jīng)常與方法的線性范圍相聯(lián)系，是指方法給出與目標核酸序列（3.46）濃度成正比例的響應或結(jié)果3.25檢出限limitofdetection，LOD由給定測量程序得到的測得量值，對于此值，在給定聲稱物質(zhì)中存在某成分的誤判概率為α時，聲稱不存在該成分的誤判概率為β。注2：在基于核酸的鑒定檢驗中，檢出限為在方法規(guī)定的實驗條件下注3：在定性分子方法和定量分子方法中，能夠穩(wěn)定檢測到的被測量的最低濃度（通常是在常規(guī)臨床實驗室條件7GB/T39367—20XX/ISO17822:20203.26定量限limitofquantification，LOQ在方法規(guī)定的實驗條件下能夠穩(wěn)定地以合理的統(tǒng)計確定性進行測量的，在特定體積中的目標核酸序列（3.46）的最低濃度或質(zhì)量。3.27反應混合液mastermix除目標DNA（3.17）和對照外，PCR（3.34）所需的試劑的混合物。3.28被測量measurand擬測量的量。-<擴增注1：被測量的規(guī)范要求了解量的種類，包括任何相關3.29陰性（PCR）質(zhì)控negative（PCR）control在沒有目標模板（3.47）的情況下進行的反應。3.30陰性（過程）質(zhì)控negative(process)control所采集標本的無目標病原體的樣品（3.44該樣品貫穿分析過程的所有階段。8GB/T39367—20XX/ISO17822:2020注：基于核酸的檢驗過程通常包括樣品（3.44）制備、富集、核酸（3.32）提取和靶擴增。3.31無模板對照notemplatecontrol，NTC包含除核酸（3.32）模板（3.47）外所有試劑的對照反應。3.32核酸nucleicacid作為遺傳信息或信息表達媒介的大分子。3.33核酸提取nucleicacidextraction從生物物質(zhì)材料中分離出核酸（3.32）。3.34聚合酶鏈反應polymerasechainreaction，PCR體外擴增DNA（3.17）的酶促反應程序。3.35多項式回歸polynomialregression使用不同階次多項式的最小二乘回歸。1X（一階多項式或線性擬合）2X2（二階多項式及2X23X3（三階多項式）9GB/T39367—20XX/ISO17822:20203.36PCR質(zhì)量級DNAPCR-qualityDNA具有足夠長度、純度和數(shù)量的，用于進行PCR（3.34）反應的DNA（3.17）模板（3.47）。3.37監(jiān)管機構(gòu)批準的試劑盒regulatorybodyapprovedassay由制造商設計和開發(fā)并由監(jiān)管機構(gòu)批準用于診斷目的的體外診斷產(chǎn)品。3.38逆轉(zhuǎn)錄reversetranscription，RT在一系列合適的條件下，利用與一條或多條寡核苷酸引物結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄酶的酶活性從RNA（3.42）模板（3.47）合成DNA（3.17）的過程。3.39修改的IVD試劑盒modifiedIVDlabeledassays修改的IVD診斷產(chǎn)品modifiedIVDlabeledtests由制造商設計和開發(fā)并經(jīng)監(jiān)管機構(gòu)批準的，或滿足用于診斷目的適用相關要求的體外診斷產(chǎn)品，但在實驗室使用時這些體外診斷產(chǎn)品已發(fā)生更改。3.40實時熒光PCRrealtimePCR在同一反應容器中結(jié)合PCR（3.34）和熒光探針檢測擴增產(chǎn)物的方法。3.41參考物質(zhì)referencematerial，RM一種或多種指定特性足夠均勻和穩(wěn)定，在測量過程中已被證明適合其預期用途的物質(zhì)。注3：用途可以包括測量系統(tǒng)的校準（3.7）、測量程序的評估、為其他GB/T39367—20XX/ISO17822:2020），3.42核糖核酸RNA，ribonucleicacid以雙鏈或單鏈的形式存在的核糖核苷酸聚合物。3.43穩(wěn)健性robustness盡管條件略有變化，但分析仍能以最佳方式進行的能力。注：通常指盡管PCR（3.34）反應3.44取自某個總體或某個批次的小部分或少量，理想情況下是整體的代表性選擇。3.45序列數(shù)據(jù)庫sequencedatabase<生物信息學>由核酸（3.32）序列、蛋白質(zhì)序列或其他聚合物序列及相關注釋組成的生物數(shù)據(jù)庫。注1：注釋可能與有機體、物種、功能、與特定疾病相關的突變、功能或結(jié)注2：已發(fā)表的基因組序列可以公開獲得，因為每個科學期刊都要求任何已發(fā)表3.46目標序列targetsequence目標核酸序列nucleicacidtargetsequence靶向檢測的特定DNA（3.17）序列，例如通過PCR（3.34）。3.47GB/T39367—20XX/ISO17822:2020指定新合成的DNA（3.17）或RNA（3.42）鏈的堿基序列的DNA或RNA鏈，這兩條鏈互補。3.48單向工作流unidirectionalworkflow正向工作流程forwardworkflow<檢驗醫(yī)學>物料/樣品處理的原則，用于確保原始樣品（3.44）、處理過的樣品(包括擴增后的DNA（3.17）)在整個檢驗程序中保持物理隔離。3.49確認validation通過提供客觀證據(jù)對特定的預期用途或應用要求已得到滿足的認定。3.50驗證verification通過提供客觀證據(jù)對規(guī)定要求已得到滿足的認定。——變換方法進行計算；——進行測試和演示；——文件發(fā)布前進行評審。4微生物病原體實驗室通用要求4.1實驗室風險管理和生物安全通用要求GB/T39367—20XX/ISO17822:2020醫(yī)學實驗室應確保實驗室員工和服務人員的安全和防護。ISO15190的要求適用。由于許多微生物具有致病性，應采用適當?shù)纳锇踩珮藴?。醫(yī)學實驗室應對基于核酸的檢驗過程進行評估，以識別故障模式、操作錯誤、危險和危險狀況等相關風險。應在檢驗項目開發(fā)前和開發(fā)過程中對患者和實驗室工作人員的相關風險進行識別。應在檢驗活動實施前和實施過程中，以及在其運行的生命周期內(nèi)經(jīng)常性的評估、監(jiān)控和降低相關風險。4.2病原體檢測的通用實驗室設置核酸擴增檢測實驗室設置應遵循最佳實踐的通用要求，通常包括擴增前和擴增后的物理分區(qū)，以及各實驗流程的區(qū)域化。在進行適當?shù)娘L險評估時，應充分考慮病原體的因素。值得注意的是，樣品處理的風險水平高于提取的核酸。因此，較高風險類別的病原體樣本通常需要處理為較低風險類別的核酸,然后進行核酸擴增檢測。但是，不能由此認為提取程序可保證樣品無傳染性，仍然需要進行相關安全風險評估。為提高生物安全性，病原體滅活宜盡早進行。但是，需要對滅活方法的有效性進行確認，適當?shù)娘L險和安全程序仍然是必要的。管理和減少污染的通用實驗室設置。污染源可分為五類，實驗室的設置宜盡量減少每個潛在來源的污染風險。來源于實驗室外。病原體檢測通常不存在問題，雖然密切相關的環(huán)境物種可能導致污染風險，該情況下宜使用正壓實驗室。有關單向工作流和氣壓條件的詳細信息，參見7.2.2。主要污染源是由實驗室大量核酸制備造成的。當使用核酸擴增檢測時，這是一個典型的問題，因為其可產(chǎn)生大量靶標（擴增產(chǎn)物這是所有核酸擴增檢測污染的主要來源。實驗室污染來源也可以來自使用包含目標序列的載體。在病原體檢測中，它也可能來源于目標病原體的微生物培養(yǎng)物。通過將樣品制備和檢測系統(tǒng)與可能產(chǎn)生大量核酸的其他實驗室活動分隔開來，可降低污染風險。宜通過使用專用實驗設備和工作服來減少進一步的污染風險。事實上許多核酸擴增檢測試劑來源于重組表達，因此可能存在低水平的細菌DNA。當靶向直系同源基因，如16S核糖體RNA基因時，將引起較大的問題。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020由于分析人員通常不攜帶病原體，所以一般不是病原體特異性核酸擴增檢測的主要污染源。但是某些病原體（或密切相關的物種）可引起無癥狀感染，因此也是潛在的污染風險。標準實驗室程序（如使用防護服、手套、濾芯吸頭等）可降低污染風險。通常是未被識別的潛在主要污染源。當高濃度病原體樣品在低濃度或陰性樣品旁制備時，可能發(fā)生交叉污染。標準實驗室程序（如使用濾芯吸頭）可降低污染風險。以降低污染風險。這可能包括限制人員走向和遵守從擴增產(chǎn)物陰性區(qū)域到擴增產(chǎn)物陽性區(qū)域的正向工作流，和/或使用一次性實驗服或其他防護服。該做法可能不適用于核酸提取、擴增和檢測自動化的單一工作流程封閉系統(tǒng)。最終應以適當?shù)姆绞奖O(jiān)測污染，以確定其對檢測結(jié)果的影響。實驗室人員、保潔和所有其他進入實驗室的人員應接受培訓，并將培訓形成記錄。更多信息參見第5章4.3商用設備（含軟件程序）對于核酸擴增檢測的設備，包括分析所需的軟件程序，應按照制造商的使用說明和實驗室程序文件進行安裝、驗證、校準和維護。在適用的情況下，應對實驗室儀器與現(xiàn)有IT基礎設施的整合情況進行驗證。如果同一核酸檢測項目可能使用多臺儀器，則應進行儀器間比較，以確保結(jié)果的可比性。實驗室應驗證實驗室開發(fā)的儀器組件之間的接口，還應驗證制造商開發(fā)的儀器組件之間的接口。4.4實驗室人員指定進行核酸擴增檢測的人員應具備資格并接受培訓，達到特定核酸擴增檢測和病原體操作所需的能力水平，包括接受繼續(xù)教育以維持能力。人員的資格和培訓應形成記錄。5病原體核酸擴增檢測試劑盒的設計和建立一般情況下，設計的相關準則應列入設計計劃中。設計和建立的計劃應包括：a)用戶需求和利益相關者要求的定義；b)預期醫(yī)療用途的定義；c)性能要求和規(guī)范以及基于預期用途的其他設計要求和規(guī)范；d)產(chǎn)品風險評估；GB/T39367—20XX/ISO17822:2020e)試劑盒設計和試劑盒組分供應商資格，宜包括但不限于：標本采集與處理、核酸提取、核酸擴增、目標微生物病原體核酸的檢測與鑒定、實驗室設計、工作流程和實驗室實踐；f)可行性階段的實施；g)驗證和確認方案；h)性能指標的驗證；i)實驗室規(guī)?；a(chǎn)流程的設計j)預期用途確認k)試劑研發(fā)過程中和建立后的設計變更應進行記錄。病原體特定的考慮項宜包括但不限于：病原體的基因、包括物種內(nèi)和跨物種的序列異質(zhì)性、“種下——使用多重Panel（如呼吸道多重P）；——如使用的多重Panel不用于病原體的鑒別，考慮項可包括潛伏期、攜帶、參考區(qū)間等。5.1質(zhì)控品5.1.1質(zhì)控品的檢查為了獲得可靠的數(shù)據(jù)和檢測結(jié)果，選擇和使用合適的質(zhì)量控制和質(zhì)控品至關重要。實驗室在進行性能驗證或者性能確認之前，應先明確質(zhì)控品的要求和規(guī)范。質(zhì)控品的使用頻率可根據(jù)性能驗證或者性能確認結(jié)果的檢測性能特征來確定。在適當?shù)那闆r下，實驗室應使用質(zhì)控品（例如，能夠評估核酸提取過程有效性的質(zhì)控品）進行檢測，減少由于整體或部分檢測程序的性能不足而產(chǎn)生錯誤結(jié)果的可能性。特別是質(zhì)量保證程序的設計應盡量減少假陽性和假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。核酸擴增檢測方法的內(nèi)參/抑制物對照可以是外源性的同源內(nèi)參/對照、外源性的非同源內(nèi)參/對照、內(nèi)源性的非同源內(nèi)參/對照。如果在標本制備前加入，內(nèi)參也可以作為全過程的對照。核酸擴增檢測的兩個主要階段需要進行質(zhì)量控制，以避免可能的檢測失敗1）從樣品采集到提取核酸的整個前處理流程（2）核酸擴增和檢測在內(nèi)的過程。核酸擴增檢測應包含正確的質(zhì)控措施，以確保所生成數(shù)據(jù)的整體質(zhì)量和可靠性。對質(zhì)控品和質(zhì)控程序選擇的理由應進行記錄。陰性質(zhì)控的目的是在沒有預期靶標的情況下進行檢測，以評價由方法的非特異性或污染導致的假陽性結(jié)果。最簡單的陰性質(zhì)控可以通過無模板反應實現(xiàn)，然而更復雜的陰性質(zhì)控通常包括樣品中可能也存在的核酸，例如人DNA，以評估檢測的特異性。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020陰性質(zhì)控可用于評價整個過程，以提供假陽性來源的進一步信息（例如，樣品處理過程中的交叉污染）。在這種情況下，可以使用適當?shù)纳飿悠坊蚝铣商娲铮ㄈ缪?、貯存液但在用于評估假陽性之前，應證明其不含病原體靶核酸。陽性質(zhì)控的目的是用于評價假陰性結(jié)果和檢測的質(zhì)量，適用于對整個實驗過程或單個樣品的評價。陽性質(zhì)控品可以是純化的核酸、純化的擴增產(chǎn)物、含有靶核酸序列的載體（例如質(zhì)粒）和合成核酸（見表1）。如使用載體或擴增產(chǎn)物，應在其加入PCR反應體系之前（見圖1將其稀釋至適當濃度(≤107copies/μL以減少高濃度核酸造成污染的可能。在已經(jīng)驗證的合理稀釋度下，含有目標病原體的貯存液可用作陽性質(zhì)控（如病毒檢測）。應選擇適合的質(zhì)控品濃度，以驗證檢測方法在分析決定水平和臨床決定水平的性能。對于定性程序，陽性質(zhì)控品（擴增或提?。┑臐舛纫私咏栃詷颖局休^低的臨床病原體載量水平。對于定量程序，除非標準曲線已經(jīng)涵蓋，否則宜使用接近報告范圍上限的強陽性質(zhì)控和接近檢測下限的弱陽性質(zhì)控。標準曲線可以是系列稀釋的病原體基因組核酸或等同物（例如，含有靶向核酸序列的質(zhì)粒）。但是，這不適用于評價動態(tài)范圍或校準整個過程。因此，在可能的情況下，建議使用適當基質(zhì)中連續(xù)稀釋的完整病原體，以覆蓋提取過程的線性動態(tài)范圍。由于潛在的引物二聚體污染，不宜將擴增產(chǎn)物用于建立標準曲線。如果質(zhì)控品由實驗室設計和制備（加入靶標的混合樣本、內(nèi)參等宜制備和保存足夠的單管樣品以避免反復凍融。對于實驗室自制的質(zhì)控品，需要對其穩(wěn)定性進行確認。自制的質(zhì)控品不應在明確的保質(zhì)期外使用。在適當?shù)那闆r下，宜實施全過程對照（例如，能夠同時評價分析前/分析中程序（如提?。┯行缘膶φ掌罚?。更多信息見表1。提取對照可以是一批含有目標核酸的患者標本，或添加目標病原體的無病原體基質(zhì)。基質(zhì)宜與待測樣品相同或相似。內(nèi)參和抑制物對照（即能夠檢測到抑制的對照品）應盡可能模擬靶核酸，但不能被靶向病原的試劑檢出。抑制物對照通常是可評價分子生物學檢測步驟（例如，PCR和逆轉(zhuǎn)錄）的核酸物質(zhì)。建議在適當?shù)那闆r下使用整個病原體作為內(nèi)參，而不僅是使用核酸。內(nèi)參宜以已知濃度加到所有待測標本中。內(nèi)參宜在產(chǎn)量、完整性和純度方面具有與提取靶序列相似的特征，且不與靶核酸競爭。其表1陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控的示例聚體，這可能與使用dsDNA結(jié)GB/T39367—20XX/ISO17822:2020測檢測）的假陽性結(jié)果）酸酸類型和加入內(nèi)參的反應階段5.1.2確定目標序列核酸擴增方法確認和驗證的核心在于對核酸序列的選擇，一方面包括擴增所用的引物，另一方面也包括了靶標序列。通常情況下，檢測的靈敏度主要取決于引物與基因靶序列結(jié)合的效率。同時檢測的特異性在很大程度上取決于待擴增的基因區(qū)域的選擇?；虬邢騾^(qū)域的選擇應根據(jù)文件中規(guī)定的檢測預期用途來確定。對于多重檢測試劑盒，每個靶序列之間不宜呈現(xiàn)任何同源性以盡可能減少交叉反應。如果選擇了靶區(qū)域，應使用適當?shù)暮怂嵝蛄袛?shù)據(jù)庫評估該序列與其他生物體的同源程度，宜使用多個數(shù)據(jù)庫對序列進行驗證。在選擇引物時，除非使用多態(tài)性來鑒別病原體，否則宜使用已知目標序列，并避免多態(tài)性區(qū)域。引物的設計宜根據(jù)所用的分析方法，如PCR、等溫擴增技術(shù)或其他方法。宜參考相關指南進行設計，例如，“出版物中實時熒光定量PCR[35]或數(shù)字PCR[4]方法應提供信息的最低要求”。GB/T39367—20XX/ISO17822:20205.2性能驗證和性能確認一般來說，檢測可以劃分為四大類:b)因未滿足患者具體需求，實驗室進行了修改的IVD試劑盒/診斷產(chǎn)品；c)實驗室自建的試劑盒/檢測（LDT）；d)市場上可購買，僅限研究用（RUO）的檢測。表2描述了對應每一類型檢測方法，進行性能確認或性能驗證的可能決定。表2性能驗證或性能確認的可能決定是否是是是是是是6檢測系統(tǒng)的驗證或確認附錄B給出了進一步的信息。6.1性能驗證或確認的方法有兩種方式可用來評價方法的檢測性能。第一種方式為進行方法比較的研究，即采用已開發(fā)的方法和一個有效的參比方法對標本/樣品進行平行檢測。方法比較適用于有效的參比方法已在實驗室使用或者可在其它臨床實驗室使用，并最好使用實驗室所在地的患者標本/樣品。第二種方式，如果無法獲得患者標本/樣品來評價性能特征，尤其是準確度時，可在預期基質(zhì)中加入已知量值的分析物，測試新試劑盒能否檢出?？赡苡幸恍┭芯勘仨毷褂谜鎸嵉幕颊邩吮?樣品，具體視風險分析情況而定。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020添加的標本/樣品需要具有明確特征，可能包括標準、質(zhì)控物、能力驗證材料或具有已知或公認值的患者樣品。7LDT的設計和建立7.1概述LDT建立的規(guī)劃階段應包括設計階段和可行性測試階段。在可行性測試階段，應收集初步性能數(shù)據(jù)，并通過故障排除和優(yōu)化流程來確定性能特征，并制定有效的性能確認程序。在技術(shù)層面，實驗室宜對方法研發(fā)所需的必要設備、試劑、成本以及質(zhì)控品和參考物質(zhì)等進行調(diào)研，并在試劑設計和性能確認過程中，考慮檢測過程所需的時間和開展檢測的可行性。方法建立過程應包括初始評估（需求、預期用途、試驗要求）、設計和開發(fā)規(guī)劃、方法研發(fā)、性能7.1.1確定客戶/患者和利益相關者對分析預期用途的需求實驗室應了解當?shù)胤ㄒ?guī)和倫理原則，以維護客戶、患者和公眾信任關系[30]。利益相關者的需求和要求（如監(jiān)管機構(gòu)或法律規(guī)定）應予以識別和記錄。客戶/患者的需求應予以識別和記錄。規(guī)定標本收集和處理程序以及接收/拒收標準。檢測的預期用途，包括臨床效果，應予以驗證。宜通過考慮以下因素來確定預期用途，包括但不限于：a)檢測的目的、益處和用途（如篩查、診斷、預測、監(jiān)測、確認）；c)檢測結(jié)果在患者管理中的應用；e)收集和處理程序；f)標本接收/拒收標準；應決定是否繼續(xù)進行設計和研發(fā)規(guī)劃。7.1.2性能驗證的一般標準實驗室應驗證IVD制造商說明書中描述的IVD診斷產(chǎn)品的關鍵性能指標，以證明其在本實驗室環(huán)境下的性能。對于定性檢測，應將陽性和陰性結(jié)果與參比方法進行比較。對于定量檢測，應比較覆蓋全部GB/T39367—20XX/ISO17822:2020可報告范圍的定量結(jié)果（準確度并進行精密度研究。此外，宜對制造商宣稱的檢出限/可報告范圍和測量不確定度等（如適用）進行驗證，如涉及參考區(qū)間實驗室宜進行驗證。更多信息參見附錄B。如果實驗室正在開發(fā)自建檢測（LDT）或修改IVD診斷產(chǎn)品，實驗室應進行驗證，確定并證明其宣稱的如準確性、精密度、分析敏感性、分析特異性（干擾物質(zhì)的影響）、可報告范圍，以及臨床適用的參考區(qū)間等方面。有關干擾物質(zhì)的數(shù)據(jù)可從文獻或在其他實驗室進行的研究中獲得，若條件允許，宜進行驗證。性能驗證宜在即將開展臨床檢測的實驗室內(nèi)完成；如果經(jīng)過驗證的檢測方法轉(zhuǎn)移到另外一個實驗室開展，新實驗室宜確定性能特征未受遷移或任何環(huán)境條件變化（溫度、濕度等）的影響。在實驗室使用IVD診斷產(chǎn)品進行檢測時，應進行性能驗證。根據(jù)方法建立的流程，作為實驗室質(zhì)量管理體系的一部分，應對驗證程序（如驗證計劃、驗證執(zhí)行）、數(shù)據(jù)、結(jié)果以及結(jié)果不一致的可能解釋進行記錄。宜關注準確性、精密度和可報告范圍，如果符合要求，宜先由實驗室主任或指定人員批準該方法可作為診斷試驗，再用于患者檢測。7.1.3檢測方法預設性能指標的驗證應分析實驗流程中各步驟對結(jié)果有效性和可靠性造成的潛在影響和風險。一般情況下，對可能影響檢查結(jié)果的診斷工作流程的所有步驟，例如標本采集、運輸、保存、預處理、提取、提取后可能需要的保存、以及檢測過程如擴增、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告等，都要進行規(guī)定和驗證。風險分析應明確整個實驗流程任何步驟中不可控因素的影響。應采取措施降低不可接受的風險。在驗證過程中，宜檢查實驗室內(nèi)的數(shù)據(jù)報告；如果數(shù)據(jù)從實驗室信息系統(tǒng)進一步傳輸?shù)结t(yī)院信息系統(tǒng)，宜驗證原始樣本檢測和報告后數(shù)據(jù)傳輸?shù)谋Ｕ嫘?。檢測方法應包括可發(fā)現(xiàn)實驗流程步驟中錯誤的適當對照（見5.1）。性能驗證宜采用與實際檢測相同的替代基質(zhì)和臨床樣本?？墒褂眠m當?shù)臒o靶標基質(zhì)（如混合血清樣本或糞便懸液）稀釋含有明確量值病原體的臨床樣本，樣本中可加入內(nèi)參。替代基質(zhì)宜加入完整病原體和內(nèi)參。宜避免污染或引入干擾物質(zhì)。對潛在污染和/或干擾物質(zhì)的持續(xù)控制宜整合到檢測系統(tǒng)中。對于多重檢測，該檢測宜在預期用途中的多重感染情況下進行驗證，例如幾種病原體和/或病原體與對照。GB/T39367—20XX/ISO17822:20207.1.4預期用途的確認根據(jù)性能確認計劃，實驗室應描述并記錄與疾病或其他臨床背景相關檢測的性能特征。實驗室應確定與檢測的臨床相關性和臨床有用性密切相關的性能特征。這些特征應記錄為臨床性能特征。為了衡量實驗室檢測是否以臨床相關方式定性和/或定量分析物，在適用時，宜計算陰性預測值和陽性預測值。注：典型的臨床性能特征包括臨床（診斷）特異性、臨床（診斷）敏感性、測量范圍和參考區(qū)間。實驗室應對檢測方法的預期用途進行確認，并與現(xiàn)有的參比方法（如有）進行比較。如果沒有可用的參比方法，實驗室應通過適當設計的研究確認預期用途。實驗室應在性能確認報告中明確記錄確認結(jié)論。更多信息參見7.4.1.1和附錄B。7.2核酸擴增檢測程序的流程分析檢測結(jié)果的可信度在體外診斷領域至關重要，因為其可能對患者產(chǎn)生社會心理、法醫(yī)及治療方面的影響。因此，在本標準中，檢測方法的選擇或初始試驗都應以檢測目標微生物是否存在為目的。典型的核酸擴增檢測宜包含以下步驟：——樣本采集、運輸和保存；——核酸提取及純化；——擴增（變性、退火、延伸——檢測目標直系同源基因；——數(shù)據(jù)分析和解讀。避免擴增產(chǎn)物的殘留污染是在核酸擴增檢測的所有步驟中的關鍵挑戰(zhàn)。7.2.1分析前工作流程要求標本采集、運輸和保存的要求應在使用說明書中規(guī)定，可參考ISO15189的要求。應特別注意樣本采集、運輸和保存對用于核酸提取的標本存在的可能影響。示例：標本類型、標本容器、標本可接受性標準、減少核酸降加劑要求、運輸條件、保存條件、穩(wěn)定性因素醫(yī)學實驗室應依據(jù)樣本采集手冊中相應部分的說明，納入標本采集、運輸和保存要求。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020核酸擴增檢測的標本接收區(qū)和錄入?yún)^(qū)宜獨立于檢測區(qū)域?；颊邩颖疽思皶r處理并妥善保存以盡可能減少核酸的降解。實驗室宜只接受指定的樣品保存容器。更多信息參見附件A。多次凍融可破壞樣本完整性及降低核酸產(chǎn)量，因此，若未另行規(guī)定和驗證，宜避免反復凍融。定量檢測和低濃度水平檢測可能更易受影響[29]。對于核酸提取及提取后核酸穩(wěn)定的條件，實驗室應進行規(guī)定、驗證，并在使用說明書中明確。即使即使在同一條件下，不同樣本類型，其穩(wěn)定性可能不同。因此，每種樣本類型的穩(wěn)定性都需要通過檢測來明確。新病原體和不常見的癥狀通常需要額外的研究來確定最佳樣本類型和樣本量。更多信息參見附樣本中提取的核酸純度、完整性和產(chǎn)量應滿足預期用途。如果樣本中的核酸量不足，應對同一樣本重新提取，或再次采集樣本以進行提取。更多信息參見附錄A，關于核酸制備和穩(wěn)定性的更多信息參見ISO21571[13]。評估核酸提取效率的方實驗室應按照使用說明書制備和保存提取的核酸，以確保純度、完整性和穩(wěn)定性滿足檢測要求。7.2.2分析中工作流程要求為了降低污染風險，實驗室程序至少應包含以下注意事項（如適用）。對于使用獨立設備和耗材的實驗室工作流程要求，不適用于使用自動化儀器（樣本制備、擴增和檢測一體）的實驗室。a)應按照生物安全水平使用個人防護裝備（PPE見EP23-A[23]、EP18-A2[22]、ISO35001[19]宜在特定區(qū)域內(nèi)使用專用實驗服（如顏色標記）。實驗服宜專人專用，且宜在出入每個區(qū)域時更換、定期更換、并考慮特定的清潔要求。實驗室也可以使用一次性的實驗服。宜對不宜疊放的實驗服配備單獨的衣架；實驗室人員如從一個實驗區(qū)到另一個實驗區(qū)，需更換手套以避免交叉污染。宜使用長袖手套，為防止過敏可使用無粉手套；操作人員應佩戴護目鏡、口罩或防護罩，或當?shù)厣锇踩ㄒ?guī)所要求的其他個人防護裝備；若有需要，宜考慮在不同的房間使用套鞋或可洗的實驗室用鞋。b)試劑準備、標本制備及擴增后分析的各區(qū)域，應使用專用設備（包括機器人）和適當?shù)暮牟?，如帶濾芯吸頭。c)為了減少樣本間的交叉污染，如果檢測流程需要打開PCR反應管，建議在開蓋之前對所有樣本的PCR管先進行瞬時離心。d)宜在非樣本組分（如PCR反應預混液、dNTPs、引物、緩沖液和酶）配制完成后，在專用區(qū)域?qū)颖净蚝怂崽崛∥锛尤敕磻?。（見圖1）e)除了擴增后需進行PCR產(chǎn)物分析（如凝膠電泳或DNA測序）之外，實驗室應保持反應管加蓋密封，并應盡可能少的打開管蓋。只有當需要的情況下進行開蓋，且開蓋前對PCR反應管進行瞬時離心。f)宜避免在不同工作區(qū)域之間移動設備（包含IT設備）。易攜類物品，如移液器、手套、筆、實驗記錄本和計時器，是造成污染的來源，應在每一個工作區(qū)域內(nèi)專用，各工作區(qū)域的物品不GB/T39367—20XX/ISO17822:2020準許混用。此外，這同樣適用于標準操作程序及其他打印和書寫材料，如工作表。建議盡量避免各區(qū)域間任何樣品和檢測相關物品的移動，如需要，宜按照單向工作流進行（從低污染區(qū)到高污染區(qū)）。（見圖1）至少應使用2個單獨的房間（若進行巢式PCR可擴展到3個）進行前PCR、后PCR和巢式PCR（如需要）。各工作步驟（用虛線標注）應在專用區(qū)域，最好在特定的房間內(nèi)進行。試劑和樣本制備間/區(qū)域不宜共用冰箱和冰柜，以避免將樣品和核酸提取物與試劑在同一位置存放。如需共用，宜進行明確的歸類管理（如在二級容器中分離見CLSIMM19A。擴增前及擴增后核酸（如樣品和PCR產(chǎn)物）應存放在置于不同區(qū)域的單獨冰箱或冰柜中，最好存放在各自的房間/區(qū)域。圖1使用獨立房間或工作區(qū)的單向工作流示例7.2.3分析后工作流程要求工作流程最后的步驟是檢測結(jié)果的報告和解釋。實驗室的結(jié)果報告可由LIS系統(tǒng)支持，宜采用預設的可編輯的報告模板。檢測報告的要求宜符合法律規(guī)范并整合到實驗室質(zhì)量管理系統(tǒng)中，報告的要求應在SOP或?qū)嶒炇沂謨灾杏枰哉f明。GB/T39367—20XX/ISO17822:20207.3驗證和確認的性能特征7.3.1檢測范圍實驗室應僅報告在驗證或確認過程中已建立的檢測范圍內(nèi)的定量結(jié)果。驗證研究中線性范圍的確定通常不適用于定性核酸檢測方法。然而，線性范圍的概念適用于定性報告的半定量檢測。線性范圍的下限應與臨床應用相關，并且在臨床應用中可接受。若適用，線性范圍的上限宜與臨床應用相關。若結(jié)果高于線性范圍的上限，則標本/樣品可用適當?shù)木彌_液或基質(zhì)稀釋。實驗室應考慮精密度較差時對線性的影響，并將精密度研究作為線性研究的一部分。為充分確定定量下限，可以在接近定量下限的低濃度增加額外的重復檢測。更多信息參見附錄B。為建立LDTs的線性范圍，建議實驗室在預期測量范圍內(nèi)對5到10個濃度水平進行研究。為確定盡可能寬的線性范圍，可在同一批中增加預期測量范圍以外濃度水平的樣品。當預期值和測量值呈現(xiàn)明顯的線性關系時，實驗室可使用線性回歸進行數(shù)據(jù)分析，但應首選基于對數(shù)轉(zhuǎn)換的PCR數(shù)據(jù)實驗室應僅定量報告在線性范圍內(nèi)的結(jié)果。NAAT線性范圍相關的指南見GB/T42077—2022標準[7]。注2：進行多項式回歸分析，以找到充分擬合數(shù)據(jù)點的多項式函數(shù)，差異。一階、二階和三階多項式回歸分析均7.3.2準確度診斷準確度的不同衡量標準與診斷程序的不同方面有關：一些衡量標準用于評估鑒別的正確性，而另一些衡量標準用于評估其預測能力。診斷準確度的衡量標準不是固定不變的，有些取決于疾病的流行率，而另一些取決于疾病的范圍和定義。此外，診斷準確度的衡量與研究的設計極為相關。不嚴格依照方法學標準的研究通常會高估或低估檢測的性能指標，從而影響研究結(jié)果的適用性[37]。檢測程序的準確度表示測量值與理論值或可接受參考值之間的一致性程度。檢測結(jié)果的一致性程度是由系統(tǒng)誤差（偏倚，表示為正確度）和隨機誤差（表示為測量精密度）造成的。7.3.2.1正確度研究GB/T39367—20XX/ISO17822:2020實驗室宜在一段時間內(nèi)檢測，以反映典型實驗室條件下的檢測性能。正確度研究宜按照研究設計、統(tǒng)計學推薦和ISO15189標準進行。對于多重檢測，如果日常使用的分析方法均未涵蓋多重檢測的所有分析物，宜使用多個比較研究。宜為每個分析物以及多重檢測選擇適當?shù)臄?shù)據(jù)分析方法以確定正確度。實驗室宜選擇并檢測適當數(shù)量的標本。理想情況下，準確度部分的驗證宜采用臨床樣品，應選擇具有足夠數(shù)量且有代表性的臨床樣品類型（如血液、血漿、糞便、體液）。如果在整個分析或報告范圍內(nèi)無法獲得這些樣品，則可使用適當?shù)臒o目標分析物基質(zhì)（如混合血清樣品或糞便懸浮液）稀釋含有已知量值病原體的臨床樣品或人造樣品，并可以在檢測前于樣品中添加內(nèi)參。為明確檢測的正確度，實驗室應以圖形和統(tǒng)計方式解釋獲得的數(shù)據(jù)。對方法學比較的數(shù)據(jù)，實驗室宜使用線性回歸分析的散點圖和95%一致性界限的差值圖來展示。7.3.2.2精密度研究在適當?shù)那闆r下，應使用已知分析物濃度的樣品進行精密度的研究。應在盡可能接近適當臨床標本的基質(zhì)中選擇或制備樣品。用于完成研究的測試材料可以包括標準品、質(zhì)控品、能力驗證樣品或足夠數(shù)量的患者標本。精密度研究應測試重復性、中間精密度和再現(xiàn)性（如適用）。重復性是采用相同方法、相同設備和相同操作人員，在相同實驗室短時間內(nèi)對同一物質(zhì)進行多次重中間精密度是采用相同方法、相同設備和相同操作人員，在相同實驗室較長時間內(nèi)對同一物質(zhì)進行多次重復測量。再現(xiàn)性是采用相同方法，不同操作人員和（或）不同設備，在不同實驗室對同一物質(zhì)進行多次重復實驗室應根據(jù)檢測的預期用途，確定適當?shù)难芯繒r長和標本數(shù)量進行精密度研究。精密度研究宜按照研究設計、統(tǒng)計學推薦和ISO15189進行。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020實驗室宜在精密度研究設計中考慮并納入可能的重要變異來源，如不同的操作人員、多試劑批次、多臺儀器。定性檢測中，精密度研究應提供分析物濃度在接近檢出限時的不精密度。精密度研究設計宜納入整個動態(tài)范圍內(nèi)適當?shù)臐舛葮悠罚悍謩e設定為檢出限濃度、高于檢出限濃度20%，以及低于檢出限濃度20%。三個樣品重復檢測40次。定量檢測中，精密度研究應至少納入高濃度水平樣品、低濃度水平樣品和盡可能接近醫(yī)學決定水平濃度（通常為檢出限）樣品。通常較高的變異出現(xiàn)在測量范圍兩端的低濃度和高濃度水平。若三個濃度水平的精密度估計值存在較大差異，則應檢測其它濃度，以充分反映檢測方法的精密度。建議精密度研究設計可計算批間和批內(nèi)變異，二者相結(jié)合以計算檢測方法的總變異。測結(jié)果的標準差、為算術(shù)平均數(shù)）的估計值。實驗室進行數(shù)據(jù)分析時，應根據(jù)文件化的可接受標準對精密度研究結(jié)果進行評價。不精密度通常表示為目標值±2SD/3SD或目標值±某個百分比（如目標值的10%）。一般來說CV不宜超過15%；最低定量限的精密度不宜超過20%。在確定可接受的精密度性能時，建議構(gòu)建精密度特征圖，其中標出SD或CV作為分析物濃度的函數(shù)。7.4分析敏感性/檢出限實驗室應確定定量和定性測試的LOD，即在可接受的精密度水平檢測到樣品中分析物的最低實際濃度。在確定分析特異性時，實驗室應進行交叉反應性和干擾物質(zhì)研究。交叉反應生物體包括與靶標具有序列同源性的生物體、可同時存在于標本中的正常菌群以及引起類似疾病狀態(tài)或臨床共感染的生物體。實驗室應對檢測方法進行干擾物質(zhì)研究（干擾篩查可添加潛在干擾物質(zhì)到含有目標核酸的標本中，通過分析干擾物質(zhì)的影響來進行。應使用適合標本基質(zhì)的潛在干擾物質(zhì)，確定其在檢測系統(tǒng)中對每種標本類型的干擾/交叉反應性。用于確定分析特異性的數(shù)據(jù)分析應遵循常用的統(tǒng)計方法，如配對t檢驗、重復測量檢驗或配對差異檢驗。具體的分析可基于檢測和對照樣品的均值之間的差異，以及該檢測具有臨床意義的允許誤差來進行。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020實驗室應通過對已知目標物質(zhì)濃度樣品進行覆蓋預期LOD水平的系列稀釋，經(jīng)驗性地確定LOD。應確定將在臨床實驗室常規(guī)檢測的每種類型標本基質(zhì)的分析敏感性。實驗室應確認每種基因型的分析敏感性（如合理）。為確定檢出限，實驗室應檢測統(tǒng)計學上適當數(shù)量的樣品。對于數(shù)據(jù)分析，實驗室宜使用probit分析法，確定可穩(wěn)定檢出的最低濃度水平。Probit回歸分析可產(chǎn)生probit（概率單位）值，并將其轉(zhuǎn)換為C95值（95%樣品中可檢測到的濃度表明檢出限為一定數(shù)量的拷貝數(shù)/ml，且含有該濃度的樣品將在95%的受試樣品中檢測到。對于多重檢測，應使用多重檢測方法確定每種分析物的LOD。7.4.1分析確認7.4.1.1研究報告的確認收集所有必要的性能確認數(shù)據(jù)后，實驗室應撰寫性能確認報告。該報告應包括主要要求、所用方法的完整描述、性能確認研究的清晰描述以及獲得的所有詳細分析結(jié)果。本文件應記錄經(jīng)性能確認的實驗流程中各個步驟（例如，檢驗前步驟）、使用的試劑和條件以及參與研究的操作人員。本文件將包括接受/拒絕標準、樣品重復/再分析的詳細信息以及檢測結(jié)果的臨床解讀信息。應提供文獻參考，補充實驗室性能確認研究結(jié)果，并填補可能缺乏直接證據(jù)的潛在空白。報告完成后，應按照實驗室質(zhì)量管理體系進行評估。最后，實驗室主任應簽署報告并注明日期，聲明檢測方法已（或未）準備好用于常規(guī)臨床實施。只要方法開發(fā)的條件沒有改變，性能確認是一次性的過程。如果現(xiàn)有方法以任何方式進行修改，實驗室應重新確認。7.4.1.2部分確認當對已驗證的方法進行了不會改變檢測方法原理的微小變更（取決于改變）時，可以進行部分性能確認。例如，如果更換了同一種樣本類型的采集裝置或容器，但預期不會對樣本本身產(chǎn)生影響，在這種情況下，僅需對有限數(shù)量的樣品（如5~10個）進行準確性和精密度測試，以進行最小限度的性能確認。GB/T39367—20XX/ISO17822:20208實驗室實施和使用一旦完成性能驗證/性能確認，檢測項目需要整合到實驗室的工作流程和質(zhì)量管理體系中。宜編寫一份完整的標準操作程序用于指導日常操作。對于廠家已完成性能確認的核酸檢測體外診斷試劑，醫(yī)學檢驗實驗室在未對其進行修改的情況下，投入臨床應用前必須進行性能驗證。對已完成性能確認的體外診斷試劑，醫(yī)學實驗室對其所進行的任何后續(xù)修改都需要在再次進行性能確認，且需遵循ISO15189的要求。在開展項目之前，實驗室宜制定一套日常質(zhì)量控制和質(zhì)量保證體系（參見表1和表2）。在開展新項目之前，實驗室應對人員進行培訓和能力評估，以滿足質(zhì)量需求。實驗室宜為臨床醫(yī)生和其他用戶提供該新項目臨床應用的咨詢服務。9結(jié)果的報告和解釋實驗室應制定適當?shù)腟OP以確保檢驗結(jié)果報告的及時性。定量檢測項目的結(jié)果通常宜報告為目標核酸分子在特定體積的體液、特定數(shù)量的細胞或特定量的組織中的分子數(shù)量（如，拷貝數(shù)、基因組當量、國際單位IU）。通常情況下，宜使用Log10轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)報告定量檢測結(jié)果。宜報告程序的檢測范圍，明確標識所使用的單位（例如，每毫升血漿中的拷貝數(shù)）。定性檢測項目不宜報告為“陽性”或“陰性”，其可能會引起解釋上的歧義，而宜使用“檢出”或“未檢出”，“存在”或“不存在”。實驗室應制定一套結(jié)果報告SOP，以確保所有結(jié)果在發(fā)布前均經(jīng)過授權(quán)人員的審核和確認。實驗室應編寫一套數(shù)據(jù)分析工具及其參數(shù)使用的SOP。對于不確定的檢測結(jié)果，實驗室應制定復檢程序，可對同一樣品采用相同或不同方法進行重復檢測和/或重新采樣復檢。陽性判斷值（cut-off值）應作為報告的解釋性注釋。對于定量檢測和沒有明確cut-off值的檢測項目，實驗室應在報告中注明該檢測項目經(jīng)過確認的檢出限、定量限（如涉及）。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020實驗室應明確可對臨床患者管理決策產(chǎn)生重大影響的檢測結(jié)果，并應制定相應的SOP以確保結(jié)果發(fā)布后及時通知相關臨床醫(yī)生。結(jié)果報告中應注明任何已知的且具有臨床意義的局限性。注：局限性可包括交叉反應、不同基因型和干擾物質(zhì)等對檢測結(jié)果質(zhì)量的影響。IVD或LDT產(chǎn)品必須附帶操作程序。任何有意或無意偏離說明書/操作程序的情況（如離心時離心力不正確或由于冰箱故障導致的反復凍融）均應進行記錄，并制定是否接受相關檢測結(jié)果的程序。10質(zhì)量保證程序醫(yī)學實驗室應實施適當?shù)馁|(zhì)量保證程序，以確保核酸檢測結(jié)果的質(zhì)量?？蓞⒖糏SO15189。應特別設計質(zhì)量保證程序以盡量減少假陽性和假陰性結(jié)果。檢測方法一旦經(jīng)過性能確認，實驗室在使用過程中應對檢測性能進行定期監(jiān)測，宜包括使用各種質(zhì)控品監(jiān)測試劑性能、儀器設備運行狀態(tài)以及人員操作等。持續(xù)監(jiān)測過程中的數(shù)據(jù)應進行記錄。10.1性能監(jiān)測和分析優(yōu)化為進行檢測性能的內(nèi)部監(jiān)測，實驗室應在臨床檢測前的性能確認和日常檢測工作中，以適當?shù)念l率使用合適的內(nèi)參和外部質(zhì)控品。實驗室應定期對外部質(zhì)控品進行評估，以保證其結(jié)果始終在預設范圍之內(nèi)。宜將內(nèi)參添加至樣本基質(zhì)中（如血清、血漿、培養(yǎng)基等并獨立于目標序列進行提取、擴增、分析和檢測。內(nèi)參應和目標序列在同一樣本管中進行處理。實驗室需要監(jiān)控基因組數(shù)據(jù)庫的升級和更新，特別需要關注對檢測的性能參數(shù)或結(jié)果解釋存在重大影響的新發(fā)現(xiàn)。推薦使用內(nèi)參，但應評估并盡量減少內(nèi)參競爭對目標序列檢測性能的影響。實驗室宜定期核查檢測的性能參數(shù)。持續(xù)監(jiān)測過程中的數(shù)據(jù)應予以解釋和記錄。10.2實驗室間比對計劃。如無適合的EQA計劃，實驗室宜定期組織內(nèi)部能力驗證計劃。詳見ISO15189。參加EQA計劃前，實驗室應仔細評估該計劃的適用范圍和預期目的，以及對被分析物定性和/或定量檢測所使用的方法。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020應至少每年參加一次內(nèi)部組織的或外部組織的能力驗證計劃。推薦至少每年參加兩次實驗室間比對。外部質(zhì)控品（Externalqualitycontrols）應和臨床標本在同一批次內(nèi)進行檢測，但不應在同一管或同一孔中進行檢測。外部質(zhì)控品的檢測數(shù)據(jù)應進行統(tǒng)計學分析，以監(jiān)測一段時間內(nèi)的檢測性能。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020樣品制備的分析前因素A.1血清和血漿A.1.1樣品采集對于血清樣品，應使用含有血清分離膠的真空采血管采集外周血。將采血管置于室溫下一小時，待樣品完全凝固后離心。在采血管中添加促凝劑可縮短血液凝固時間。對于血漿樣品，宜使用含有EDTA的真空采血管。不建議與細胞免疫學或染色體分析樣品共用血樣,因這些樣品常使用肝素抗凝管。當通過IVH導管抽血時，宜舍棄初始幾毫升血液，采集后續(xù)的血液作為樣品，以避免肝素的潛在影CPD）抗凝的血漿，與EDTA抗凝血漿都可用于核酸擴增檢測。采血后應立即將EDTA抗凝采血管反復顛倒混勻，以防止血液凝固形成纖維蛋白沉淀。由于肝素會抑制核酸擴增，因此不宜使用肝素抗凝的采血管。有沉淀、變色或因冷凍造成脫水現(xiàn)象的樣品，不應進行檢測。這可能由于存儲條件不適當，如長期暴露在高溫環(huán)境或反復凍融導致。若提取的核酸保存在適當條件下，則可用于復檢。宜盡量減少并記錄凍融次數(shù)。A.1.2樣品貯存和運輸病毒樣品在血清和血漿中相對穩(wěn)定。分離后，血清和血漿樣品可冷藏保存（2℃~8℃)。一些IVD制造商已經(jīng)證明血清和血漿樣品可以在2℃~8℃的條件下保存7天。如長期保存，建議將樣本進行冷凍。例如，對于HBV，用于DNA檢測的樣品宜在-20℃或更低溫度下保存，對于甲型肝炎病毒（HAV）、丙型肝炎病毒（HCV）和戊型肝炎病毒（HEV宜在-70℃或更低溫度下保存。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020宜避免將樣品轉(zhuǎn)移到另一個容器中。如果樣品在離心后不能立即進行檢測，宜將原始采血管中分離-20℃或以下）保存以備用。對于丙型肝炎病毒（HCV）和人類免疫缺陷病毒（HIV宜在采血后6小時內(nèi)分離血清或血漿，對于乙型肝炎病毒（HBV最好在24小時內(nèi)完成分離。A.1.3干擾物質(zhì)的控制所有人類樣品中都可能含有潛在的“干擾物質(zhì)”；這些物質(zhì)可能會干擾目標分析物的擴增和/或檢測。干擾物質(zhì)可以是內(nèi)源性的或外源性的。當濃度足夠高時，一些內(nèi)源性干擾物質(zhì)是肉眼可見的，如血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素。病理過程的大量產(chǎn)物可能是其他內(nèi)源性干擾物質(zhì)的來源，例如骨髓瘤患者的輕鏈或糖尿病患者的葡萄糖。這些干擾物質(zhì)通常是不可見的。內(nèi)源性干擾物質(zhì)還包括用于治療的物質(zhì)，如抗凝劑、藥物、血漿擴張劑和腸外營養(yǎng)。內(nèi)源性干擾物質(zhì)還包括患者攝入的物質(zhì)，包括酒精、娛樂性藥物、維生素和其他營養(yǎng)補充劑。干擾物質(zhì)也可以是“外源性”的；這些是在樣品采集過程中引入的污染物，可能包括手套粉末。為了最大限度地減少已知干擾物質(zhì)（例如肝素）的影響，宜將樣品收集在指定容器中。核酸提取有時可以去除或失活干擾物質(zhì)，但由于潛在的干擾物質(zhì)種類繁多，并且其中許多是不可見的，因此，證明每個樣品或從每個樣品提取的核酸都能夠?qū)崿F(xiàn)靶基因的擴增和檢測是非常重要的，可通過向每個樣品添加擴增對照（內(nèi)參）來完成。如果內(nèi)參的結(jié)果未處于預期范圍（或沒有擴增則可能存在抑制物。更多信息請參見參考文獻[38]和[20]。如果檢測試劑中包含內(nèi)參，則可以評估擴增反應的抑制效果，并減少假陰性結(jié)果的發(fā)生率。在沒有內(nèi)參的情況下，可以向已提取的DNA或cDNA溶液中加入已知量的質(zhì)粒DNA，并評估其擴增效果以確認抑制物的影響。A.2尿A.2.1樣品采集斷，例如淋病奈瑟菌、衣原體及其他病原體的檢測。尿液的病原體檢測宜采集最可能含有致病病原體基因組DNA和RNA的尿液樣品，建議首選早晨的初始排尿樣品。在一天的排尿過程中，病原體會被多次排尿沖洗掉，從而導致假陰性的結(jié)果；并且大量白細胞、紅細胞和脫落的上皮細胞的存在也可能會干擾檢測，進一步導致假陰性。在診斷胎兒或新生兒巨細胞病毒感染時，建議使用出生時的首次排尿樣品。A.2.2樣品保存和運輸GB/T39367—20XX/ISO17822:2020懷疑血尿或膽紅素尿的尿液樣品和含有大量沉淀物的尿液樣品不宜進行檢測。血尿是由尿道或膀胱的炎癥導致的，其原因可能是感染性或非感染性病因，如輻射。樣品被冷藏時，尿液也會形成沉淀。尿液樣品（男性）可用于沙眼衣原體和淋病奈瑟菌的核酸檢測。此時，尿液樣品宜冷藏保存（2℃~8℃),并在四天內(nèi)進行核酸提取。樣品通過標準方法正確提取后，DNA在冷藏條件下（2℃~8℃)可穩(wěn)定保存一周或更長時間，否則建議將樣品凍存。由于細菌生長而出現(xiàn)渾濁外觀的尿液樣品不宜用于檢測。菌尿樣品產(chǎn)生的可能原因包括未在適當?shù)臈l件下保存樣品，例如在不恰當?shù)谋４鏈囟认聦悠烽L時間放置在收集容器中。如需長期保存，最好將樣品進行冷凍。A.2.3樣品制備疑似為血尿或膽紅素尿，以及含有大量沉淀物的尿液樣品不宜進行檢測。檢測病毒時，可將樣品離心取上清液進行分析。檢測細菌時，因不當離心可能會沉淀細菌，宜謹慎使用上清液，宜反復顛倒樣品采集管使樣品充分混勻。因樣品冷藏易致沉淀物的形成，因此，在移液和后續(xù)分析之前，應將冷藏樣品在37℃下孵育30分鐘，使沉淀物盡可能溶解。為了盡可能降低雜質(zhì)的影響，宜選擇包含離心柱、微孔濾膜或磁珠顆粒的核酸提取試劑。為了監(jiān)測雜質(zhì)對核酸擴增反應的實際抑制作用，宜使用檢測試劑盒中自帶的內(nèi)參。如果以上標準品無法獲得，需要采用拷貝數(shù)接近檢出限的質(zhì)粒DNA單獨進行添加-回收實驗。確認雜質(zhì)的干擾后，可通過稀釋核酸樣品以消除抑制作用。但是，值得注意的是，該過程存在一定的風險，即目標核酸可能被稀釋到低于檢出限的水平，從而導致假陰性結(jié)果。A.3痰A.3.1樣品采集痰標本主要用于感染性疾病的診斷和監(jiān)測，例如肺炎或由結(jié)核桿菌、非結(jié)核分枝桿菌等引起的疾病。對于結(jié)核分枝桿菌的檢測，痰標本的質(zhì)量保證至關重要。通過肉眼觀察評估痰標本質(zhì)量，確認是膿性痰而不是唾液。如果受檢者自己咳痰有困難，宜考慮使用吸痰管吸痰或用胃液作為替代標本。此外，宜考慮收集替代標本，包括混合痰、胃液、支氣管肺泡灌洗液（BAL）和支氣管刮取物。A.3.2樣品保存和運輸GB/T39367—20XX/ISO17822:2020對于核酸檢測，痰標本宜使用NALC-NaOH去污，并懸浮在磷酸鹽緩沖液中。懸浮液能冷藏保存一周（2℃~8℃),冷凍可保存更長時間。使用標準方法正確提取的DNA在冷藏（2℃~8℃)條件下可穩(wěn)定一周或更長時間。如需長期保存，最好將樣品進行冷凍。為避免標本反復凍融，凍存前宜將懸浮液等分裝。提取核酸的穩(wěn)定性與提取條件密切相關。粘度較差的痰標本，如在高溫、反復凍融等不恰當?shù)臈l件暴露較長時間，則不宜對其進行檢測?？捎萌庋塾^察來判斷標本為膿性痰而非唾液，并且宜使用非粘稠的（唾液樣或黏液樣，根據(jù)Miller-Jones分類）的標本。如標本為唾液，通常是由于患者咳痰不足或痰分泌有限引起的。當標本中痰太少時，目標病原體如抗酸桿菌和非結(jié)核分枝桿菌可能檢測不到，并可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。A.3.3樣品制備受感染的呼吸道（如支氣管）出血可能導致痰標本含有大量血液，這種標本不適合進行檢測。當痰中混入大量血液時，痰液離心沉淀物中血紅蛋白污染是不可避免的，需充分考慮對隨后PCR或轉(zhuǎn)錄介導議重新采集痰標本。這尤其適用于只采集到唾液的情況。必要時，將痰的剩余部分（含有粘液包圍的細胞成分和細菌）溶解在N-乙?；?L半胱氨酸4℃10分鐘，再用于核酸提取。如果試劑說明書中注明了標本的預處理程序，則按照制造商說明書進行操作。如果洗滌和離心后的沉淀物的顏色接近白色，則在接下來的步驟中可能不會發(fā)生血紅蛋白對反應的抑制。A.4全血和骨髓A.4.1樣品采集將規(guī)定體積的血液抽取到含有抗凝劑（EDTA和其他）的采血管后，宜立即顛倒采血管并輕輕混合。使用了含抗凝劑（EDTA和其他）的采血管時，無需添加穩(wěn)定劑。A.4.2樣品保存和運輸GB/T39367—20XX/ISO17822:2020若標本用于檢測引起菌血癥或敗血癥的病原體，室溫下長期保存標本可能會降低檢測靈敏度。因此，用于此類檢測的細胞長期存放時，宜將其存放在超低溫條件下（-70℃或更低）。對于骨髓標本（骨髓抽吸物宜將規(guī)定體積的標本在特殊的保存液（含F(xiàn)BS的細胞培養(yǎng)基）中冷藏（2℃~8℃)保存。A.4.3樣品制備在含有纖維蛋白凝塊的標本中，纖維蛋白可影響細菌的離心收集以及從液體中取樣，并可能導致定量測定的準確性降低。通過試管內(nèi)容物流動性不佳或移液操作，可判斷是否存在纖維蛋白凝塊。提取核酸前，應物理破碎標本中的纖維蛋白凝塊，直到其開始分解，進而纖維蛋白充分分散在整個標本中，然后進行檢測。在DNA提取過程中，可添加DTT（二硫蘇糖醇）和蛋白消化酶蛋白酶K促進纖維蛋白降解。注1：肝素的影響能夠通過使用核酸提取試劑盒來降低，因核酸A.5胸腔積液、腹水、心包液、胰液和支氣管肺泡灌洗液A.5.1樣品采集標本采集時，宜避免引入血細胞成分。宜使用含檸檬酸鈉或EDTA的容器收集胸腔積液，因為采集后的胸腔積液有時候會因纖維蛋白沉積而發(fā)生凝固。A.5.2樣品保存和運輸宜在采集標本當天提取核酸，否則宜冷藏（2℃~8℃)保存標本。若長期保存，每個標本收集后宜-70℃或以下）。為防止標本采集后細菌生長，宜嚴格遵守標本保存條件。膿性標本含有多種不同類型的細菌，使用堿性熱處理進行DNA提取可能導致假陰性結(jié)果。A.5.3樣品制備當溶血導致標本中含有大量細胞成分（包括血紅蛋白）時，需關注PCR抑制導致的敏感性降低。在含有纖維蛋白凝塊的標本中，細菌的離心收集以及準確取樣可能受到影響，并可能導致定量測定的準確性降低。通過試管內(nèi)容物流動性不佳或移液操作，可判斷是否存在纖維蛋白凝塊。提取核酸前，應物理破碎標本中的纖維蛋白凝塊，直到其開始分解，進而纖維蛋白充分分散在整個標本中，然后進行檢測。在提取DNA的過程中，加入酸解離步驟，使纖維蛋白充分分解至整個標本中。然后，將含有纖維GB/T39367—20XX/ISO17822:2020蛋白的整個標本用于分析。在DNA提取過程中，可加入DTT（二硫蘇糖醇）和蛋白酶K促進纖維蛋白降解。A.6淋巴結(jié)和實體組織（活檢或手術(shù)）A.6.1樣品采集在采集標本時，宜將受影響的病變區(qū)域與未受影響的區(qū)域分離并保存。組織標本的形態(tài)學檢查有助于區(qū)分靶細胞部分和其他部分，以便能夠?qū)⑵浞蛛x和取出進行檢測。對于大的或過大的標本，被影響的病變（靶細胞）占整個標本的比例較小。被影響的病變可被其他組織稀釋，這可能降低檢測靈敏度，最終導致假陰性結(jié)果。對于結(jié)核桿菌的檢測，可通過顯微鏡下的形態(tài)學檢查來確認病變。A.6.2樣品保存和運輸通過活檢或手術(shù)獲取的組織標本宜立即在超低溫（-70℃或更低）下冷凍，以防止組織自溶導致核酸降解。此時，最好從獲取的組織中僅取出受影響的病灶。對于結(jié)核桿菌的檢測，可以通過形態(tài)學檢查確認病變。對于FFPE，通過活檢或手術(shù)獲取的組織標本宜盡快浸泡在固定劑中。如果不能立即進行固定，最好將組織標本存放在冰箱（4℃)中，并在大約3小時內(nèi)固定?？稍?℃~8℃條件下進行組織標本運輸。A.6.3樣品制備受影響的病變可被其他組織稀釋，這可能會降低檢測靈敏度，最終導致假陰性結(jié)果。對于結(jié)核桿菌的檢測，可以通過顯微鏡下的形態(tài)學檢查確認病變。激光顯微切割可以從玻片上制備的冰凍組織切片中準確采集靶細胞。最簡單和最容易的方法是用刀片手動收集靶細胞部分，盡可能去除玻片上石蠟包埋組織切片中不必要的細胞部分。在使用胃活檢組織檢測幽門螺桿菌（H.pylori）和肝活檢組織檢測丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒時，紅細胞污染會導致PCR擴增不良，從而導致假陰性結(jié)果。紅細胞污染狀況可以通過肉眼觀察鐵銹色或測定血紅蛋白濃度確認。通過使用基于純化方法的核酸提取試劑盒，能夠降低PCR擴增受到污染雜質(zhì)的抑制作用，在純化過程中，核酸可吸附到過濾器、膜或磁性顆粒上，通過洗脫去除雜質(zhì)。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020A.7糞便標本患者采樣前的飲食情況可能會對檢測結(jié)果產(chǎn)生抑制作用。A.7.1樣品采集糞便已被用于分子方法檢測病原體的標本，主要用于診斷病毒性腹瀉。糞便標本也可用于出血性大腸埃希菌的鑒定或相對少見的Vero毒素基因檢測。因為標本是在腹瀉癥狀最嚴重時采集的，所以大多數(shù)都是水樣便。特別注意，在醫(yī)療機構(gòu)外采集糞便標本時，宜嚴格按照操作說明進行采集。A.7.2樣品保存和運輸在沒有能夠保存樣品的添加劑的情況下，糞便標本宜在采集后一天內(nèi)冷凍在-20℃或以下。否則它的質(zhì)量可能會下降。將標本長期置于室溫下，會導致多種非目標細菌的增殖，降低目標病原體的檢測靈敏度，增加非特異性擴增事件的發(fā)生頻率，最終導致假陰性結(jié)果。病毒核酸也可能被細菌產(chǎn)生的蛋白酶和核酸酶降解，從而導致檢測結(jié)果假陰性。A.7.3樣品制備在分析之前，從技術(shù)上很難檢測出標本狀態(tài)異常。由于標本狀態(tài)異常在檢測前不易識別，因此核酸擴增檢測目標病原菌的靈敏度降低的可能性始終存在。GB/T39367—20XX/ISO17822:2020（資料性）試驗的驗證和確認試驗在進行應用前應視預期用途進行適當?shù)男阅艽_認或驗證，以下為相關的驗證或確認流程。圖2試驗的驗證和確認流程GB/T39367—20XX/ISO17822:2020參考文獻[1]GB/T3358.2—2009，統(tǒng)計學詞匯及符號第2部分：應用統(tǒng)計[2]GB/T15000.7，標準樣品工作導則第7部分：標準樣品生產(chǎn)者能力的通用要求[3]GB/T19000—2016，質(zhì)量管理體系基礎和術(shù)語[4]GB/T21415—2008，體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質(zhì)賦值的計量學溯源性[5]GB/T29791.1—2013，體外診斷醫(yī)療器械制造商提供的信息（標示）第1部分：術(shù)語、定義和通用要求[6]GB/T33260.1—2016，檢出能力第1部分：術(shù)語和定義[7]GB/T42077—2022，生物技術(shù)核酸靶序列定量方法的性能評價要求qPCR法和dPCR法[8]GB/T42216.1—2022，分子體外診斷檢驗福爾馬林固定及石蠟包埋組織檢驗前過程的規(guī)范第1部分：分離RNA[9]GB/T43278—2023，醫(yī)學實驗室風險管理在醫(yī)學實驗室的應用[10]GB/T43279.1—2023，分子體外診斷檢驗靜脈全血檢驗前過程的規(guī)范第1部分：分離細胞RNA[11]ISOGuide30:2015,Referencematerials.Selectedtermsanddefinitions[12]ISO/IECGuide99:2007,Internationalvocabularyofmetrology—Basicandgeneralconceptsandassociatedterms（VIM;JCGM200;2012[32]）[13]ISO21571:2005+Amd1:2013,Foodstuffs—Methodsofanalysisforthedetectionofgeneticallymodifiedorganismsandderivedproducts-Nucleicacidextraction[14]ISO21572:2013,Foodstuffs—Molecularbiomarkeranalysis—Protein-basedmethods[15]ISO22174:2005,Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Polymerasechainreaction(PCR)forthedetectionoffood-bornepathogens—Generalrequirementsanddefinitions[16]ISO24276:2006,Foodstuffs—Methodsofanalysisforthedetectionofgeneticallymodifiedorganismsandderivedproducts—Generalrequirementsanddefinitions[17]ISO24276:2006/Amd2013,Foodstuffs-Methodsofanalysisforthedetectionofgeneticallymodifiedorganismsandderivedproducts-Generalrequirementsanddefinitions—Amendment1[18]ISO/IEC25062:2006,(INCITS354)PreviewSoftwareengineering—SoftwareproductQualityRequirementsandEvaluation(SQuaRE)—CommonIndustryFormat(CIF)forusabilitytestreports[19]ISO35001:2019,BioriskmanagementforlaboratoriesandotherrelatedorganisationsGB/T39367—20XX/ISO17822:2020[20]CLSIEP07;InterferencetestinginClinicalChemistry,3rdedition;Wayne;PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute;2018[21]CLSIEP17-A2;EvaluationofDetectionCapabilityforClinicalLaboratoryMeasurementProcedures,2ndEdition;ApprovedGuideline;Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute2012[22]CLSIEP18-A2;RiskManagementTechniquestoIdentifyandControlLaboratoryErrorSources;ApprovedGuideline-SecondEdition;Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute;2009[23]CLSIEP23-ATM:LaboratoryQualityControlBasedonRiskManagement;ApprovedGuideline;Wayne,PA:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute2011[24]CLSI,MM03;MolecularDiagnosticMethodsforinfectiousdisease.3