《抗體制藥》課件

第四章抗體制藥

第一節(jié)概述一.抗體工程與抗體藥物1890年Behring〔培林〕和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開創(chuàng)了抗體制藥。1937年Tiselius〔提賽留斯〕用電泳法將血清蛋白別離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。

抗體是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。

抗體的產(chǎn)生：機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白〔immunoglobulin，Ig〕。所以Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的概念，而抗體是生物學(xué)功能的概念?？贵w與細(xì)菌、病毒或毒素等抗原結(jié)合，通過以下3種或其中一種方式綜合和除去有害物質(zhì)：1.直接使抗原失去活性2.使免疫效應(yīng)細(xì)胞將其吞噬并加以破壞3.使抗原外表弱化從而易于受補(bǔ)體破壞

多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體。早期采用的抗體藥物主要為多克隆抗體，雖然其在治療多種急性中毒中仍發(fā)揮重要的作用，但是多克隆抗體存在非均一性、異質(zhì)性、不穩(wěn)定性等缺點(diǎn)。

單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用與疾病的診斷和治療。單克隆抗體檢測與某些疾病有關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。單克隆抗體用于臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對(duì)器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對(duì)腫瘤進(jìn)行定向治療〔抗體“導(dǎo)彈〞即為靶向制劑〕。二、抗體藥物的特異性單克隆抗體針對(duì)特定的單一抗原表位，具有高度的特異性，這是抗體藥物發(fā)揮治療作用的重要根底。對(duì)于抗腫瘤抗體藥物的研究說明，其特異性主要表現(xiàn)在：1.與相關(guān)抗原的特異性結(jié)合2.對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的選擇性殺傷3.在動(dòng)物體內(nèi)呈靶向性分布4.對(duì)相關(guān)的腫瘤顯示更強(qiáng)的療效三、抗體藥物的主要研究方向第二節(jié)單克隆抗體及其制備

單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。

一、抗原與動(dòng)物免疫制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。

為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，免疫動(dòng)物和骨髓瘤細(xì)胞供體應(yīng)為同一品系動(dòng)物進(jìn)行免疫。

目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c品系小鼠和LOU品系大鼠，因此免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)的品系。免疫的方法采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法。

體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原〔如細(xì)菌細(xì)胞抗原〕的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。7

可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與弗氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細(xì)胞分裂。注：1、弗氏完全佐劑是一種油包水的乳濁液，能夠非常有效的誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體。弗氏完全佐劑含結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁成分，可以加強(qiáng)對(duì)抗原的抗體反響。佐劑活性來自于油滴中免疫原的持續(xù)釋放，并刺激局部免疫反響。簡單的說，這個(gè)注射入哺乳動(dòng)物皮下之后，會(huì)產(chǎn)生炎癥和疼痛。2、弗氏完全佐劑一般由石蠟油、羊毛脂和滅活的分枝桿菌〔卡介苗〕組成的。

脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將0.1～0.2ml抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。

一般細(xì)胞抗原需105個(gè)，可溶性抗原需10μg。

體外免疫法用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如：制備人源性單克隆抗體；抗原免疫源性極弱，易引起免疫抑制。

優(yōu)點(diǎn)：需抗原量少，免疫期短，干擾因素少。體外免疫法：用4～8周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單細(xì)胞懸液，再參加適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5～5μg/ml,在5%CO37C下培養(yǎng)4～5天,再別離脾細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞融合。o2o二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)

1.骨髓瘤細(xì)胞的選擇應(yīng)盡可能選擇自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤細(xì)胞作為親本細(xì)胞。細(xì)胞必須處于良好的生長狀態(tài)，對(duì)數(shù)生長期最好。

2.免疫脾細(xì)胞懸液的制備取經(jīng)免疫的小鼠，摘除眼球放血，將小鼠處死，無菌摘取脾臟，研磨制取脾淋巴細(xì)胞懸液，洗滌調(diào)整細(xì)胞濃度。3.細(xì)胞融合的方法：脾細(xì)胞〔1×108〕與骨髓瘤細(xì)胞〔2×107〕混合，聚乙二醇〔PEG〕誘導(dǎo)下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。PEG相對(duì)分子量4000，濃度為50%，DMSO〔二甲基亞砜〕增加融合率，時(shí)間不宜過長。

細(xì)胞融合后可產(chǎn)生多種融合：脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細(xì)胞；

還有為融合的脾細(xì)胞和為融合的瘤細(xì)胞。選擇性培養(yǎng):

培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)、氨甲喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)配制而成。

A阻斷DNA合成。脾細(xì)胞在一般情況下不能連續(xù)培養(yǎng)。骨髓瘤細(xì)胞都是HGPRT〔次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶〕缺乏株，不能利用H和T合成DNA,而脾細(xì)胞中有這種酶，所以只有脾—瘤才能在HAT選擇培養(yǎng)基上生長。ELISA原理ELISA的根底是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體外表的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原

或抗體既保存其免疫學(xué)活性，又保存酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本〔測定其中的抗體或抗原〕與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用

洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再參加酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反響而結(jié)合在固相載體上

。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。參加酶反響的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物

質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反響的結(jié)果，使測定方法到達(dá)很

高的敏感度。ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選克隆化是指單個(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程。這種群體細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能完全相同。常用方法：有限稀釋法和軟瓊脂培養(yǎng)法四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定1.雜交瘤細(xì)胞鑒定：

染色體分析、抗體穩(wěn)定性分析、外原因子檢查。

2.單抗進(jìn)行Ig類和亞類鑒定：用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進(jìn)行免疫擴(kuò)散或ELISA鑒定。

3.親和力常用方法：相對(duì)親和力測定4.純度含量測定純度一般用層析法測定5.活性測定測效價(jià)6.識(shí)別抗原位點(diǎn)測定7.特異性、交叉反響性測定五、單克隆抗體的大量制備目前制備的方法主要有兩種：動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法1.體內(nèi)誘生法：可獲的5～20mg/ml抗體，用BALB/c小鼠。降植烷接種雜交瘤細(xì)胞取腹水離心上清。六、單克隆抗體的純化依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法：1、離心，取上清，超濾，鹽析。2、別離：⑴凝膠過濾用于IgGIgM單抗純化。⑵陰離子交換層析IgG單抗純化。⑶親和層析IgG單抗純化。第三節(jié)抗體診斷試劑一、血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑⒈鑒定病原菌的抗體試劑⑴常用診斷血清的品種和用途①沙門氏菌屬診斷血清②志賀氏菌屬診斷血清③病原性大腸埃希氏菌診斷血清⑵診斷血清的制備步驟①制備細(xì)菌抗原②免疫動(dòng)物和制備抗體血清⑶診斷血清診斷方法⒉乙型肝炎病毒外表抗原的反向被動(dòng)血凝診斷試劑⒊妊娠診斷試劑⒋抗ABO血型系統(tǒng)血清假設(shè)將血型不相容的兩個(gè)人的血滴放在玻片上混合，其中的紅細(xì)胞即聚集成簇，這種相容稱為凝集〔agglutination〕。紅細(xì)胞的凝集有時(shí)還伴有溶血。當(dāng)血型不相容的血液輸入循環(huán)血液中時(shí)，在血管內(nèi)可發(fā)生同樣的情況，此凝集成簇的紅細(xì)胞可以堵塞毛細(xì)血管，溶血將損害腎小管，同時(shí)常伴發(fā)過敏反響，其結(jié)果可危及生命。紅細(xì)胞膜上的一些特異糖蛋白，在凝集反響中糖蛋白起著抗原的作用，因而稱它們?yōu)槟瞐gglutinogen〕。能與紅細(xì)胞膜上的凝集原起反響的特異抗體那么稱為凝集素〔agglutinin〕。ABO血型是根據(jù)紅細(xì)胞膜上存在的凝集原A與凝集原B的情況而將血液分為4型。凡紅細(xì)胞只含A凝集原的，即稱A型；如存在B凝集原的，稱為B型；假設(shè)A與B兩種凝集原都有的稱為AB型；這兩種凝集原都沒有的，那么稱為O型。不同血型的人的血清中各含有不同的凝集素，即不含有對(duì)抗他自身紅細(xì)胞凝集原的凝集素。在A型人的血清中，只含有抗B凝集素；B型人的血清中，只含有抗A凝集素；AB型人的血清中沒有抗A和抗B凝集素；而O型人的血清中那么含有抗A和抗B凝集素二、免疫標(biāo)記用的抗體試劑熒光抗體診斷試劑⑴熒光抗體的制備⑵免疫熒光測定方法

直接法和間接法三、導(dǎo)向診斷藥物③小分子抗體易到達(dá)腫瘤部位，可顯著提高N/NT值。④抗體在腫瘤部位可保存6～9日⑤能觀擦抗體在血中的半衰期和可能出現(xiàn)的不良反響。以抗體為載體的導(dǎo)向治療藥物，還不成熟。一、放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物抗體作為放射性核素的導(dǎo)向載體，標(biāo)記操作簡便，用量小。放射性核素標(biāo)記的抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷較大。第