酵母菌液體發(fā)酵生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的研究正文

引言β-半乳糖苷酶(EC3β-galactosidase)，又稱乳糖酶(Lactose)，廣泛存在于各種動物、植物及微生物中，是一種白色粉末，無味，溶解后是一種淺棕色液體。乳糖酶位于小腸空腸段黏膜上皮細胞的刷狀緣，催化β-半乳糖苷類化合物中β-半乳糖苷鍵，使其發(fā)生水解斷裂，乳汁中的乳糖只有經(jīng)乳糖酶的催化水解為葡萄糖和半乳糖后，才能被小腸吸收。除能使乳糖分解生成半乳糖和葡萄糖外，還具有轉半乳糖苷的作用。大量研究表明哺乳動物的乳糖酶活性隨年齡的增長，具有典型的生理性降低，成人乳糖酶下降的不可逆受基因控制。全世界乳糖酶缺乏的發(fā)生率在50%以上，而我國有90%左右成人缺乏乳糖酶。若乳糖酶缺乏者一次攝入較多乳糖，乳糖未能及時被消化吸收，引起醫(yī)學上的乳糖不耐受癥(lactoseintolerance)，其解決途徑之一是采用外源性乳糖酶替補療法[1，2]。我國人口屬乳糖酶缺乏的高發(fā)群體，由于乳糖酶的缺乏，對利用乳品作為廉價的動物蛋白及鈣的來源以改善人群的營養(yǎng)狀況造成困難。為彌補腸道乳糖酶的不足，可采用微生物來源的乳糖酶預處理乳品生產(chǎn)低乳糖食品[3-5]。利用乳糖酶水解乳糖的性質降低乳制品的乳糖含量，開發(fā)更易于被人體吸收、被更多的消費群體所適用的低乳糖系列奶制品已成為乳品行業(yè)的新亮點。但是眾多因素諸如制備酶的過程中酶活力的損失、生產(chǎn)工藝復雜、產(chǎn)量低等制約了乳糖酶在生產(chǎn)中的應用，其中很重要一點是成本太高。因而很多學者在構建高效生產(chǎn)乳糖酶的菌株，篩選酶學性質更為優(yōu)良的乳糖酶，培養(yǎng)基的優(yōu)化等方面做了大量研究。隨著科學技術的發(fā)展，乳糖酶的作用被研究得更加透徹，現(xiàn)已在許多方面被應用：(1)在乳品工業(yè)中的應用。乳糖酶除了可以減輕乳糖不耐癥癥狀外，還可以改善乳制品的外觀和口感，避免乳糖在煉乳中結晶，并能增加煉乳的甜度；還可以催化乳糖水解過程中產(chǎn)生的半乳糖基轉移至乳糖等受體上，形成低聚半乳糖。低聚半乳糖甜度低，對酸、熱穩(wěn)定，具有抗淀粉回生等理化特性，低聚半乳糖還具有非致齲齒性、非消化性（具有膳食纖維的生理功能）、產(chǎn)熱能低、促進雙歧桿菌增殖等優(yōu)異的生理學特性。因此，低聚半乳糖作為一種新型的功能性食品配料應用前景廣闊[6]。此外用乳糖酶水解乳糖因條件溫和，不會引起蛋白質變性、褐變反應和其他副反應，常用來制造乳糖水解乳、乳清糖漿和半乳糖葡萄糖漿。乳糖水解乳中乳糖含量降低70%～80%，可以很好的解決乳糖不耐受問題；用于制造酸乳可以縮短凝固時間、延長酸乳貨架壽命；用于加工干酪，不僅縮短乳酪凝固時間，而且乳酷凝固堅實，減少乳酪澄清造成的損失；生產(chǎn)濃縮乳時添加25%～30%乳糖水解乳，可以防止結晶現(xiàn)象，增加產(chǎn)品甜度，減少蔗糖用量；乳清糖漿可代替卵蛋白和蔗糖，用于食品加工，使產(chǎn)品風味和外觀大大改善。半乳糖葡萄糖漿主要代替蔗糖作甜味劑；(2)在果蔬加工方面的應用。研究發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶具有合成或修飾其它碳水化合物以及促進果蔬軟化和成熟的功能。乳糖酶普遍存在于各種植物中，了解它在果蔬各個生長時期的含量對于果蔬的成熟、風味、顏色及采收后加工都有重要意義。一般在植物成熟期β-半乳糖苷酶含量增加，它降解含半乳糖苷的胞壁多糖，釋放游離的半乳糖。可溶性的半乳糖能促進胡椒成熟，對番茄能促發(fā)乙烯加快成熟。β-半乳糖苷酶已用于梨、蘋果、土豆和中國水粟的軟化和番茄、胡椒、甜瓜、櫻桃、核果和牛油果的成熟；(3)在分析檢測方面的應用。食品中乳糖含量的分析，將精制的β-半乳糖苷酶和其它酶(如過氧化物酶、葡萄糖氧化酶)聯(lián)合使用可以分析冰淇淋、干酪和含牛乳的干制品中的乳糖含量。該法簡便快捷，費用低廉，又可以在樣品不除去蛋白的情況下使用，適合于在食品工業(yè)上進行應用。免疫學方面，將β-半乳糖苷酶與人體胞外淀粉狀蛋白前體融合形成融合蛋白，可作為Alzheimer病的免疫源，并進一步制備其單克隆抗體。還有報道將β-半乳糖苷酶作為一種輔蛋白，用來穩(wěn)定和增加UR5-UR1融合蛋白的溶解性，以此作為貓白血病毒gp70的疫苗。在疾病診斷方面，將抗菌性HIV病毒基因與β-半乳糖苷酶基因LacZ重組后作為誘導基因在COS細胞中產(chǎn)HIV-LacZ缺陷型病毒，最后在CD4+靶細胞中表達β-半乳糖苷酶。用這一系統(tǒng)抑制HIV的早期翻譯，并預測化合物抗HIV的活性[7,8]。在環(huán)境檢測方面，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶活性檢測可快速分析浴場和漁場地區(qū)海水水體受排泄物污染程度[9]；(4)在醫(yī)藥方面的應用。β-半乳糖苷酶是酶類藥物，適用于嬰兒各種消化不良癥，如先天性乳糖酶缺乏癥、由胃障礙及缺鐵所致的幼兒慢性腹瀉、幼兒及新生兒腹瀉，由感冒及消化不良等引起的繼發(fā)性腹瀉；治療哺乳仔豬腹瀉，哺乳仔豬發(fā)育障礙和體能消耗的主要原因是腹瀉。許多報道認為仔豬腹瀉是由微生物感染引起的，也有報道認為是由消化不良所致。當存在于小腸粘膜絨毛的β-半乳糖苷酶發(fā)生先天基因缺陷時或后天障礙，則發(fā)生乳糖消化不良性腹瀉，其特征是糞便中水分、乳糖量和乳酸量增加、pH值降低等[10]。由于β-半乳糖苷酶的作用越來越重要，為了將其實現(xiàn)工業(yè)化，人們做了大量的研究。β-半乳糖苷酶廣泛存在于各種動物、植物及微生物中，但由于微生物的快速生長和高效代謝的生物學特性，使其成為工業(yè)化酶制劑的主要來源。利用微生物發(fā)酵法制取β-半乳糖苷酶、酶源豐富、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、周期短，而且不受季節(jié)、地理位置等因素的影響。微生物生產(chǎn)β-半乳糖苷酶包括：(1)細菌β-半乳糖苷酶，尤其是嗜熱細菌產(chǎn)生的酶正得到廣泛的研究。到目前為止，大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶研究得最徹底、最深入，并已大量用于生化分析中。細菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶是胞內(nèi)酶，在培養(yǎng)過程中不能分泌到培養(yǎng)基中，它的耐熱性較高，這一點有利于固定化酶的制造。但因產(chǎn)量低及可能的毒性問題，迄今未用于工業(yè)化生產(chǎn)；(2)霉菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶是胞外酶，可以用固態(tài)培養(yǎng)，也可以采用液態(tài)深層培養(yǎng)來生產(chǎn)。在培養(yǎng)過程中，酶分泌到培養(yǎng)基中，提取較為方便。霉菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶較耐熱、耐酸，不需要活化劑和穩(wěn)定劑，穩(wěn)定性較高。目前應用較多的霉菌β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌主要是米曲霉(Aspergillus)和黑曲霉(Aspergillusniger)，但其生長周期比酵母菌較長；(3)酵母菌是一類在食品醫(yī)藥工業(yè)中應用已久的微生物種群，酵母菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶通常是胞內(nèi)酶，制備純品必須破碎細胞。該酶對酸、熱較不穩(wěn)定，當某些離子存在時，才有最大活性，因此不適于在工業(yè)上進行應用。但是，酵母菌容易培養(yǎng)，在深層培養(yǎng)條件下可以大量生成β-半乳糖苷酶，這些優(yōu)點掩蓋了它的不足，故酵母菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶才得以成功地進行開發(fā)[11-13]。酵母菌中有乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)和脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfragilis)。隨著酶學研究的不斷深入和酶工程的發(fā)展，工業(yè)化生產(chǎn)的酶越來越多，酶的應用越來越廣泛。但在酶的使用過程中，人們也注意到酶的一些不足之處。例如：（1）酶的穩(wěn)定性差，在溫度、pH值和無機離子等外界因素的影響下，容易變性失活；（2）酶一般都是在水溶液中與底物反應，這樣酶在反應系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反映結束后，即使酶仍有較高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使成本較高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)；（3）酶反應后成為雜質與產(chǎn)物和混合在一起，無疑給進一步的分離純化帶來一定的困難。為此，人們針對酶的不足之處尋求其改善方法。其方法之一就是固定化酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增加酶穩(wěn)定性、可重復使用、易與反應物分離等特點[14]。固定化乳糖酶對于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)來說，雖然游離的乳糖酶水解乳糖工藝簡單，但是因為添加乳糖酶會使牛奶摻入外來蛋白質，另外乳糖不耐受癥患者又不喜歡乳糖酶分解乳糖后導致甜味增加，而固定化酶則可以避免以上問題。固定化酶是指在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進行催化反應的酶。固定化方法很多，主要有吸附法、包埋法、結合法、交聯(lián)法和熱處理等方法[11]。雖然對于固定化乳糖酶水解體系已有很多研究，但只有很少一部分應用被放大，更少達到工業(yè)化或半工業(yè)化水平。鑒于這種狀況，還需解決以下問題，以使固定化乳糖酶體系用于實際生產(chǎn)。(1)篩選和培育活力高、耐熱性較高的乳糖酶及微生物；(2)開發(fā)無毒性、機械強度高的載體；(3)酶活高、半衰期長的固定化方法的開發(fā)；(4)反應器的清洗和殺菌方法的開發(fā)；(5)擴大酶的應用領域，尋求新的調制方法，如東北農(nóng)業(yè)大學應用透性化乳糖酶固定于中空纖維膜反應器上，活力回收率達到99.9%，半衰期為859.2h，具有工業(yè)化的應用價值。隨著我國經(jīng)濟的快速增長，牛奶及其它乳制品被越來越多的人作為主流早餐。乳糖酶缺乏和乳糖不耐受影響著世界不同地區(qū)、不同種族的人們對乳制品的攝人，發(fā)生率為30%～100%。在西方國家，乳制品攝入量較高，乳糖消化吸收和營養(yǎng)作用受到高度重視，乳糖酶缺乏和不耐受的宣傳非常廣泛；在我國，隨著生活水平的提高和乳制品攝入量的提高，這一問題剛剛引起人們的重視。雖然人們已經(jīng)認識到牛奶是最完美的天然飲食，但是卻有很多人因為體內(nèi)缺乏乳糖酶而不能充分利用它，乳糖酶的出現(xiàn)使這一問題迎刃而解，乳糖酶在乳品工業(yè)中愈來愈多的使用也正說明了這一點[15]。迄今為止，我國乳制品工業(yè)使用的乳糖酶全部依賴進口，且價格昂貴，為了使我國乳品工業(yè)能蓬勃發(fā)展，使更多的人享受到奶制品的天然營養(yǎng)；開發(fā)高質量的乳糖酶已經(jīng)成為刻不容緩的事實。隨著人們對乳制品營養(yǎng)作用以及乳糖酶研究的加深，相信在不久的將來，乳糖不耐受將不再成為困擾，牛奶也會更廣泛的為人所用。生物技術的發(fā)展使生產(chǎn)的β-半乳糖苷酶純度更高、活性更強，更利于生產(chǎn)上實際操作。對其反應機制，動力學行為的深層研究，使此酶的應用不再僅僅限于乳糖水解，廣泛應用在食品、醫(yī)藥、免疫、環(huán)境檢測等各個領域。也由于近20年來基因工程、酶工程、蛋白工程的迅猛發(fā)展，對編碼此酶的基因及其表達調控在分子水平上做了大量深入研究，如重組基因、融合蛋白等，反過來也促進了生物技術諸多領域的發(fā)展。本文旨在通過搖瓶培養(yǎng)法，確定乳酸克魯維酵母(K.lactis)液體發(fā)酵生產(chǎn)β-半乳糖苷酶適宜的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。1材料與方法1.1材料1.1.1供試菌種乳酸克魯維酵母（K.lactis）購于中國工業(yè)菌種保藏中心。1.1.2培養(yǎng)基主要有以下幾種:母種培養(yǎng)基[4]（乳糖2.0%，酵母抽提物0.35%，瓊脂2.0%，pH7.5）；液體種培養(yǎng)基[4]（乳糖2.0%，酵母抽提物0.35%，蛋白胨0.35%，pH7.5）；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基[4]（乳糖8.0%，酵母抽提物0.35%，蛋白胨0.35%，NaCl0.01%，MnCl20.01%，pH7.5）1.1.3溶液的制備主要有以下幾種：3,5-二硝基水楊酸溶液(DNS)的制備稱取3,5-二硝基水楊酸0.63g于50mL燒杯中，用少量蒸餾水溶解后加入2mol/LNaOH溶液26.2mL，再加入到50mL含有18.5g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加0.5g結晶酚和0.5gNa2SO3攪拌溶解，冷卻后移入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，在超聲波洗脫儀震蕩20min，貯于棕色瓶中備用；0.1mol/L、pH7.0磷酸鹽緩沖液的制備稱取KH2PO43.4g，溶于少量水中，和145.5mL0.1mol/L的NaOH溶液一起加入到500mL的容量瓶中，然后用蒸餾水定容到500mL；250mg/mL的乳糖溶液的制備稱取25g乳糖用0.1mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液溶解并定容到100mL，即得。1.1.4主要儀器超聲波細胞粉碎機（JY98-Ⅲ型，上海新芝生物技術研究所）；722N可見分光光度計（7070511012型，上海精密科學儀器有限公司）；低溫超高速離心機（3K3D型，SIGMA）；雙層小容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司）等。1.2方法1.2.1酶的制備液體種的制備將菌種接種到母種培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)20h。再將其接種到液體種培養(yǎng)基中，30℃、160液體發(fā)酵制備基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，100mL的三角瓶裝液量40mL，于121.3℃滅菌30min，冷卻后按2.5%的接種量接種，搖床轉速酶液的制備取10mL菌液于50mL離心管中，4℃，4000r/min離心10min，棄去上清液，菌沉淀用0.1mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，最后加入10mL緩沖液重懸。該菌懸液用超聲波處理（超聲破碎儀的功率為500W，間歇式工作，工作6S，間歇3S，破碎次數(shù)20次）后，細胞破碎液4℃，8000r/min離心10min，收集上清液[16,171.2.2酶活力測定葡萄糖標準溶液的制備將葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，稱取0.1080g葡萄糖標準曲線繪制取16支具塞試管，依次編號為0，1，2，3，4，5，6，7，并作平行實驗，見表1.1。表1.1葡萄糖標準曲線繪制方法Table1.1Glucosestandardcurvemethodofdrawing管號01234567葡萄糖量(ml)00.511.522.533.5蒸餾水(ml)76.565.554.543.5DNS(ml)22222222將上述溶液加入試管搖勻后置于沸水浴中加熱5min后，冷卻定容至25mL。搖勻后以0號管為對照于520nm處測定OD值，以葡萄糖含量μmol為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1.1。圖1.1葡萄糖標準曲線Fig.1.1Glucosestandardcurve酶活性的測定取2mL質量濃度為250mg/mL的乳糖溶液加入試管中，將試管浸入（40±1）℃恒溫水浴中預熱5min后，加入1mL酶液于60℃反應30min，立即取出，置于沸水浴中滅活10min，冷卻至室溫，用3mLDNS試劑顯色，測OD值(520nm)[18]酶活力計算從標準曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)；酶活力(u/mL)=葡萄糖量/（30*Ew）其中：30為保溫時間(酶與底物作用時間，min)；Ew為酶液的體積(mL)；u是指在特定條件下，每分鐘催化乳糖水解成1μmol葡萄糖的酶量。1.2.3菌體濃度測定取培養(yǎng)液10mL，6000r/min離心15min，收集菌體，用無離子水洗滌，然后加3倍無離子水稀釋，以無離子水為空白，于590nm處測定吸光度(A)。2結果與分析2.1液體發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選試驗2.1.1不同碳源對β-半乳糖苷酶活性的影響在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉代替乳糖為碳源，進行實驗，每組重復6次，測定不同碳源對β-半乳糖苷酶活性的影響，結果見表2.1。表2.1不同碳源對β-半乳糖苷酶活性的影響Table2.1Effectofdifferentcarbonsourcesontheactivityofβ-galactosidasebyK.lactis碳源乳糖葡萄糖蔗糖麥芽糖可溶性淀粉β-半乳糖苷酶活性0.29750.28180.22190.25970.2649表2.1結果表明，以乳糖作碳源時得到的β-半乳糖苷酶活性最高，為0.2975u/ml，葡萄糖、麥芽糖和可溶性淀粉次之，蔗糖作碳源時得到的β-半乳糖苷酶活性最低。綜合不同碳源對β-半乳糖苷酶活性的影響，以乳糖為最適碳源。2.1.2不同氮源對β-半乳糖苷酶活性的影響在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以尿素、黃豆粉、水解乳蛋白代替蛋白胨為氮源，進行實驗，每組重復6次，測定不同氮源對β-半乳糖苷酶活性的影響，結果見表2.2。表2.2不同氮源對β-半乳糖苷酶活性的影響Table2.2Effectofdifferentnitrogensourcesontheactivityofβ-galactosidasebyK.lactis氮源蛋白胨尿素黃豆粉水解乳蛋白β-半乳糖苷酶活性0.29630.28260.25690.2050表2.2結果表明，以蛋白胨作氮源時得到的β-半乳糖苷酶活性最高，為0.2963u/ml，尿素和黃豆粉次之，而水解乳蛋白作氮源得到的β-半乳糖苷酶活性最低。綜合不同氮源對β-半乳糖苷酶活性的影響，以蛋白胨為最適氮源。2.1.3培養(yǎng)基成分的優(yōu)化試驗以乳糖為碳源，蛋白胨為氮源，添加NaCl，MnCl2和0.35％酵母抽提物進行L9(34)正交試驗，見表2.3。實驗結果見表2.4。表2.3正交試驗因子水平表Table2.3Thedifferentlevelandfactors因子乳糖(w/v,%)A蛋白胨(w/v,%）BNaCl(w/v,%)CMnCl2(w/v,%)D水平181.050.030.03水平240.700.020.02水平320.350.010.01表2.4L9(34)正交試驗方差分析Table2.4TheanalysisofresultwithorthogonaltestofL9(34)編號乳糖A蛋白胨BNaClCMnCl2D酶活性(u/ml)111110.2416212220.2592313330.2782421230.2303522310.2255623120.2142731320.2191832130.2094933210.1901K10.7790.6910.66520.6572K20.670.69410.67960.6925K30.61860.68250.72280.7179k10.25830.23030.22170.2191k20.22330.23140.22650.2308k30.20620.22750.24090.2393R0.05210.00390.01920.0202根據(jù)極差分析，比較得到的β-半乳糖苷酶活性，影響β-半乳糖苷酶活性的大小關系是A＞D＞C＞B，各因子最佳水平組合是A1D3C3B2，所以最佳培養(yǎng)基的配比是乳糖8%、蛋白胨0.7%、NaCl0.01%、MnCl20.01%、酵母抽提物0.35%。2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗2.2.1初始pH對β-半乳糖苷酶活性的影響將初始pH分別調為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0,30℃，160r/min振蕩培養(yǎng)20h，測定初始pH對β-半乳糖苷酶活性的影響，結果見表2.5。表2.5初始pH對β-半乳糖苷酶活性的影響Table2.5initialpHeffectontheactivityofβ-galactosidasebyK.lactispH5.56.06.57.07.58.0β-半乳糖苷酶活性0.20340.22070.23550.24960.27900.2392表2.5結果表明，不同初始pH對發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性有明顯的影響。初始pH從5.5到7.5，發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的活性依次增大，超過7.5后活性下降。因此，確定乳酸克魯維酵母(K.lactis)液體發(fā)酵生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最適pH范圍是7.0～7.5。2.2.2培養(yǎng)溫度對β-半乳糖苷酶活性的影響選擇24℃，26℃，28℃，30℃，32℃發(fā)酵溫度，初始pH為7.5，160r/min振蕩培養(yǎng)20h，測定培養(yǎng)溫度對β-半乳糖苷酶活性的影響，結果見表2.6。表2.6培養(yǎng)溫度對β-半乳糖苷酶活性的影響Table2.6Thetemperatureoffermentationeffectontheactivityofβ-galactosidasebyK.lactis溫度（℃）2426283032β-半乳糖苷酶活性0.17640.19450.21750.22710.2247表2.6結果表明，不同培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性有明顯的影響。溫度從24℃到30℃，發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的活性依次增大，超過30℃后活性下降。培養(yǎng)溫度為30℃時，發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的活性最高，為0.2271u/mL。因此，乳酸克魯維酵母(K.lactis)液體發(fā)酵生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最適溫度為30℃。2.2.3振蕩速度對β-半乳糖苷酶活性的影響選擇160，180，200，220的振蕩速度，初始pH為7.5，30℃，振蕩培養(yǎng)20h，測定振蕩速度對β-半乳糖苷酶活性的影響，結果見表2.7。表2.7振蕩速度對β-半乳糖苷酶活性的影響Table2.7Thestirredspeedeffectontheactivityofβ-galactosidasebyK.lactis轉速（r/min）160180200220β-半乳糖苷酶活性0.22150.25440.26090.2327表2.7結果表明，不同振蕩速度對發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性有明顯的影響。隨著振蕩速度的升高，發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性增加明顯，在180～200r/min時，發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性維持在一個相對較高的水平，但轉速達220r/min時，發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性開始降低。但根據(jù)酵母菌的生長規(guī)律，在轉速達220r/min時，搖瓶中的溶氧量增加，發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性應高于在轉速為200r/min時的，可能的原因是轉速為220r/min時，菌體生長速度高于在其它轉速下的，在培養(yǎng)20h后，菌體已生長緩慢，進入衰亡期。因此，乳酸克魯維酵母(K.lactis)液體發(fā)酵生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最適振蕩速度范圍是180～200r/min。2.2.4培養(yǎng)時間對β-半乳糖苷酶活性的影響選擇16，18，20，22，24，26h的培養(yǎng)時間，初始pH為7.5，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)，測定培養(yǎng)時間對β-半乳糖苷酶活性的影響，結果見表2.8。表2.8培養(yǎng)時間對β-半乳糖苷酶活性的影響Table2.8Thetimeoffermentationeffectontheactivityofβ-galactosidasebyK.lactis發(fā)酵時間161820222426β-半乳糖苷酶活性0.22870.24520.26250.24160.21790.2050表2.8結果表明，不同培養(yǎng)時間對發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性有明顯的影響。培養(yǎng)時間從0到20h，發(fā)酵產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的活性依次增大，當發(fā)酵時間達到20h時，發(fā)酵生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的活性最高，為0.2625u/mL。以后隨著時間的增加，發(fā)酵生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的活性開始緩慢下降。因此，乳酸克魯維酵母(K.lactis)液體發(fā)酵生產(chǎn)β-半乳糖苷酶的最佳培養(yǎng)時間是20h。2.3菌體生長與產(chǎn)酶曲線采用搖瓶培養(yǎng)法，在最佳培養(yǎng)基的配比是乳糖8%、蛋白胨0.7%、NaCl0.01%、MnCl20.01%、酵母抽提物0.35%，培養(yǎng)條件為初始pH值為7.5，培養(yǎng)溫度30℃，振蕩速度為200r/min，進行乳酸克魯維酵母(K.lactis)液體發(fā)酵生產(chǎn)β-半乳糖苷酶實驗，測定菌體生長及產(chǎn)酶曲線，分析乳酸克魯維酵母的菌體生長規(guī)律和產(chǎn)酶規(guī)律，結果見圖2.1。圖2.1菌體生長及產(chǎn)酶曲線Fig.2.1GrowthandenzymeproductioncurveforKluyveromyceslactis結果表明，0～16h為對數(shù)生長期，菌體濃度迅速增大，16h后進入穩(wěn)定期；β-半乳糖苷酶從14h開始大量表達，在20h達到最大，以后隨時間延長呈下降趨勢。原因是細胞衰老并發(fā)生自溶，細胞數(shù)目減少，酶活降低。因此，在保持較高菌體濃度與產(chǎn)酶量的情況下，確定液體發(fā)酵時間為20h。3小結（1）乳酸克魯維酵母(K.lactis)對供試碳源都有不同程度的利用，但以乳糖的利用率最高。其對蛋白胨的利用率高于其它氮源，但在工業(yè)中，可以稍稍加大尿素的比例，就能替代蛋白胨，從而減少生產(chǎn)成本。正交實驗確定的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：乳糖8％，蛋白胨0.7%，酵母抽提物0.35％，NaCl0.01%，MnCl20.01%；（2）乳酸克魯維酵母(K.lactis)液體發(fā)酵β-半乳糖苷酶的最適pH7.0～7.5，最適振蕩速度180～200r/min，最適培養(yǎng)溫度30℃，最適培養(yǎng)時間20h。致謝本畢業(yè)設計的順利完成，感謝周建軍老師、劉開輝老師、馮自立老師和張濤老師的幫助,同時也感謝在實驗過程為我提供幫助的同學。參考文獻[1]王敏,檀建新,張偉,等.乳糖酶的應用及發(fā)展現(xiàn)狀[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,11(29):89－92.[2]張紅艷,劉成更,趙文娟,等.乳糖酶的酶學特性及其研究進展[J].食品研究與開發(fā),2004,6(25):34－36.[3]李玉強,王昌祿,顧小波,等.β-半乳糖苷酶的研究與應用[J].中國食品添加劑,2001(2):30－33.[4]王逢,袁勤生,徐康森.產(chǎn)乳糖酶酵母Kluyveromycesmarxianus發(fā)酵條件的研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2004,10(35):587－589.[5]周震,邱蔚然,閆蓬勃.產(chǎn)核酸和乳糖酶的熱帶假絲酵母QZN0209培養(yǎng)條件研究[J].工業(yè)微生物,2002,32(3):28－32.[6]