DB21∕T 2451-2015 玉米品種真實(shí)性鑒定 SSR分子檢測(cè)方法

ICS65.020.20DB21DB21/T2451—2015玉米品種真實(shí)性鑒定SSR分子檢測(cè)方法MaizevarietygenuinenessverificationwithSSRmarkers遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2451—2015前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語、定義和縮略語 14方法原理 25儀器設(shè)備、試劑和溶液配制 26檢測(cè)步驟 37結(jié)果分析和表示 68結(jié)果判定 6附錄A（規(guī)范性附錄）核心引物名稱和序列 7附錄B（規(guī)范性附錄）溶液配制 9DB21/T2451—2015本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省農(nóng)村經(jīng)濟(jì)委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省種子管理局。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：朱志成、李波、高振環(huán)、鄒暢、肖國峰、王汝寶、李洪建、趙前程、王見中、溫浩、李鵬、史鴻儒、安輝、徐策、孫麗紅、王東坡。1DB21/T2451—2015本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了玉米品種真實(shí)性鑒定的原理、儀器設(shè)備、檢測(cè)步驟及結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米品種真實(shí)性SSR分子鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語、定義和縮略語3.1術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1.1品種真實(shí)性供檢樣品與該品種的對(duì)照樣品是否相符。3.1.2對(duì)照樣品省級(jí)以上種子管理部門收集并保存的與品種名稱相符的種子樣品。3.1.3參照品種已知等位變異SSR位點(diǎn)的品種。3.1.4SSR分子檢測(cè)通過SSR分子標(biāo)記檢測(cè)玉米品種基因組DNA的差異，鑒定玉米品種真實(shí)性的檢測(cè)方法。3.2縮略語2DB21/T2451—2015CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨。DNA：deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸。dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脫氧核苷三磷酸。PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠電泳。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基苯磺酸鈉。SSR：simplesequencerepeat，簡單重復(fù)序列。Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐熱DNA聚合酶。4方法原理由于不同玉米品種遺傳組成不同，基因組DNA中簡單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)存在差異，這種差異可通過PCR擴(kuò)增及電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，從而能夠鑒定玉米品種真實(shí)性。5儀器設(shè)備、試劑和溶液配制5.1儀器設(shè)備5.1.1PAGE檢測(cè)平臺(tái)高速冷凍離心機(jī)、水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、PCR擴(kuò)增儀、微量移液器、電子天平、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器、微波爐、冰箱、高壓電泳儀、垂直電泳槽及制膠附件、水平搖床、膠片觀察燈、凝膠成像系統(tǒng)或數(shù)碼相機(jī)。5.1.2毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)高速冷凍離心機(jī)、水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、PCR擴(kuò)增儀、微量移液器、電子天平、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器、微波爐、冰箱、DNA分析儀。5.2試劑5.2.1PAGE電泳CTAB、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?2H2O）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、37%的鹽酸、氫氧化鈉（NaOH）、氯化鈉（NaCl）、dNTPs、Taq酶、10×Buffer緩沖液、礦物油、去離子甲酰胺（Formamide）、溴酚藍(lán)（BrphBlue）、二甲苯青FF、甲叉雙丙烯酰胺疏水硅烷（RepelSilane）、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、無水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）、冰醋酸、乙酸銨、硝酸銀、甲醛。5.2.2毛細(xì)管電泳CTAB、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?2H2O）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、37%的鹽酸、氫氧化鈉（NaOH）、氯化鈉（NaCl）、dNTPs、Taq酶、10×Buffer緩沖液、礦物油、DNA分析儀專用丙烯酰胺膠、DNA分析儀專用分子量內(nèi)標(biāo)、DNA分析儀專用電泳緩沖液。5.3溶液配制3DB21/T2451—2015DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳以及銀染溶液按照附錄B（規(guī)范性附錄）規(guī)定的要求進(jìn)行配制，所用試劑均為分析純。試劑配制所用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水的要求，其中銀染溶液的配制只需達(dá)到三級(jí)水的要6檢測(cè)步驟6.1送驗(yàn)樣品及DNA提取6.1.1送驗(yàn)樣品送驗(yàn)樣品為種子，重量不低于200g或不少于500粒。送驗(yàn)樣品為果穗，應(yīng)不低于5個(gè)果穗(總粒數(shù)不低于500粒)；送驗(yàn)樣品為幼苗、葉片或苞葉的，應(yīng)至少含有40個(gè)個(gè)體。對(duì)于玉米自交系或單交種，可采用混合樣或單個(gè)個(gè)體獨(dú)立檢測(cè)。混合樣的試樣應(yīng)至少含有20個(gè)個(gè)體，單個(gè)個(gè)體獨(dú)立檢測(cè)的試樣應(yīng)至少含有5個(gè)個(gè)體。采用混合樣而檢測(cè)結(jié)果在某個(gè)引物位點(diǎn)出現(xiàn)異質(zhì)性并影響到結(jié)果判定的，應(yīng)采用單個(gè)個(gè)體獨(dú)立檢測(cè)，試樣應(yīng)至少含有20個(gè)個(gè)體。6.1.2DNA提取DNA提取方法可任選6.1.2.1至6.1.2.4所列的一種方法。DNA質(zhì)量應(yīng)符合PCR擴(kuò)增的要求。6.1.2.1CTAB法取試樣的幼苗或葉片200mg～300mg置于2.0mL離心管，加液氮充分研磨，或取種子充分磨碎后，移入2.0mL離心管。每管加入700μL經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取液，充分混勻，65℃水浴60min充分混勻。每管加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24：1）混合液，充分混合后靜置10min，在12000rpm條件下離心15min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，-20℃放置30min后在4℃、12000rpm條件下離心10min，棄上清液，加入70%乙醇溶液，旋轉(zhuǎn)2次后棄去乙醇溶液，并倒立于墊有濾紙的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，室溫放置10min以上。加入100μL超純水或TE緩沖液1，充分溶解后備此方法為DAN提取的仲裁方法。6.1.2.2SDS法剪取試樣的幼苗或葉片或剝?nèi)「煞N子的胚，置于1.5mL離心管，加入100μL氯仿后研磨，再加入300μLSDS提取液，混勻后在10000rpm條件下離心2min。吸取上清液，轉(zhuǎn)移至預(yù)先裝有300μL異丙醇TE緩沖液1，充分溶解后備用。6.1.2.3堿煮法剝?nèi)≡嚇痈煞N子的胚，或?qū)⒎N子培養(yǎng)至幼苗長度達(dá)到3cm左右時(shí)剪取每株幼苗1.5cm，放入96孔深孔板中。每孔加入150μL氫氧化鈉溶液，煮沸5min，然后加入150μLTE緩沖液2，充分溶解后備用。6.1.2.4試劑盒法選用適宜SSR標(biāo)記法的商業(yè)試劑盒，并經(jīng)驗(yàn)證合格后使用。提取方法，按照提供的使用說明進(jìn)行。4DB21/T2451—20156.2PCR擴(kuò)增6.2.1反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積可以依據(jù)具體情況確定。20μL反應(yīng)體系應(yīng)符合表1的要求。本標(biāo)準(zhǔn)推薦了40對(duì)核心引物，引物名稱和序列見附錄A。選用PAGE電泳，應(yīng)合成普通引物，采用單引物電泳。選用毛細(xì)管電泳，合成引物時(shí)需在上游引物的5’端標(biāo)記熒光染料，可采用單引物電泳或多引物組合電泳。對(duì)于近似品種，采用本標(biāo)準(zhǔn)推薦40對(duì)核心引物無明顯差異的，可以采用能夠區(qū)分的特異引物作為進(jìn)行SSR檢測(cè)。當(dāng)使用特異引物時(shí)，應(yīng)在檢驗(yàn)報(bào)告中說明該特異引物的序列信息。表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系原濃度終濃度ddH2O-12.3510×Buffer10×2MgCl225mmol/L2.5mmol/L2dNTP2.5mmol/Leach0.15mmol/Leach1.2Taq酶5U/μL0.220μmol/L0.25μmol/Leach0.25DNA25ng/μL2.5ng/μL26.2.2反應(yīng)程序反應(yīng)采用下列程序：94℃預(yù)變性5min，1次循環(huán)；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，進(jìn)行35次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)；72℃延伸10min。反應(yīng)程序的反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)PCR擴(kuò)增儀型號(hào)、酶、引物等不同而進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。形成的擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。6.3擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)6.3.1PAGE電泳6.3.1.1制膠制膠執(zhí)行下列程序：a)蘸洗滌靈用清水將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，再用雙蒸水、95%乙醇溶液分別擦洗兩遍。玻璃板干燥后，將0.5mL親和硅烷工作液，均勻涂在無凹槽的玻璃板上；將0.5mL疏水硅烷工作液，均勻涂在帶凹槽的玻璃板上。操作過程中兩塊玻璃板分別處理，防止相互污染；b)玻璃板徹底干燥后，將塑料隔條整齊放在無凹槽玻璃板兩側(cè)，蓋上凹槽玻璃板，夾子固定后，用水平儀檢測(cè)玻璃膠室是否水平；c)取100mL4.5%PAGE膠，加入TEMED、25%過硫酸銨各100μL，迅速混勻，將膠灌入玻璃膠室，灌膠過程應(yīng)防止氣泡的出現(xiàn)。待膠室灌滿后，在凹槽處將鯊魚齒朝外輕輕插入樣品梳，在室溫下聚合1h以上。6.3.1.2變性5DB21/T2451—2015取20μl擴(kuò)增產(chǎn)物（見6.2.2加入4μL6×加樣緩沖液，混勻。在PCR擴(kuò)增儀上運(yùn)行94℃變性5min，4℃冷卻10min后備用。6.3.1.3電泳電泳執(zhí)行下列程序：a)正極槽（下槽）加入1×TBE緩沖液600mL，負(fù)極槽（上槽）加入經(jīng)65℃預(yù)熱的1×TBE緩沖液600mL，拔出樣品梳，在90W恒功率下預(yù)電泳10min～20min；b)用移液器清除加樣槽孔氣泡和雜質(zhì)，插入樣品梳（鯊魚齒朝下），每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入5μL樣品（6.3.1.2），在80W恒功率下電泳；c)電泳時(shí)間因擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段大小不同而有所不同，一般來說，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期片段，泳動(dòng)到膠板中部位置，效果較好，可采用上部的二甲苯青指示帶進(jìn)行確定；d)達(dá)到電泳時(shí)間后關(guān)閉電源，結(jié)束電泳，取下玻璃板并輕輕撬開，通常凝膠附著在無凹槽的玻璃板上。6.3.1.4染色染色執(zhí)行下列程序：a)將附著凝膠的玻璃板浸入固定液中，輕輕晃動(dòng)3min后取出，在雙蒸水中快速漂洗，時(shí)間不超過b)將膠板放入染色液中，輕輕晃動(dòng)5min后取出，在雙蒸水中快速漂洗，時(shí)間不超過10s；c)將膠板放入顯影液中，輕輕晃動(dòng)待條帶清晰后取出，再迅速放入固定液中定影5min取出，在雙蒸水中漂洗1min；d)取出膠板，晾干，放在膠片觀察燈上觀察，記錄結(jié)果，拍照保存。注：固定液、染色液、雙蒸水和顯影液的用量，可依據(jù)膠板數(shù)量和大小調(diào)整，以浸過膠面為準(zhǔn)。6.3.1.5數(shù)據(jù)記錄供檢樣品與對(duì)照樣品在同一電泳板上并排電泳時(shí)，每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行逐對(duì)比較，并記錄比較結(jié)果。供檢樣品與對(duì)照樣品DNA指紋庫中的指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時(shí)，執(zhí)行下列程序：a)將供檢樣品與參照品種在同一電泳板上并排電泳，逐個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行逐對(duì)比較，并記錄比較結(jié)果。b)將該樣品的純合位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)記錄為X/X，雜合位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點(diǎn)上兩個(gè)等位變異，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后，缺失位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)記錄為0/0；c)與數(shù)據(jù)庫中對(duì)照樣品指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，記錄比較結(jié)果。6.3.2熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)6.3.2.1變性分別取等體積的擴(kuò)增產(chǎn)物和不同熒光標(biāo)記的產(chǎn)物，混勻后從混合液中吸取1μL，加入到DNA分析儀專用96孔板孔中，各孔再分別加入0.1μL分子量內(nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺。在PCR儀上95℃變性5min，取出立即置于碎冰上，冷卻10min以上。離心10s后備用。6.3.2.2電泳打開DNA分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)，更換緩沖液、灌膠。將裝有樣品的微孔板放置于樣品架基座上，打開數(shù)據(jù)收集軟件。按照DNA分析儀使用手冊(cè)進(jìn)行操作，DNA分析儀將自動(dòng)運(yùn)行，并保存電泳數(shù)據(jù)文6DB21/T2451—20157結(jié)果分析和表示位點(diǎn)差異記錄分為下列三種情形：——位點(diǎn)存在差異的或完全相同的，記錄為有差異或無差異；——位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失的，記錄為缺失；——位點(diǎn)顯示無法判定的，記錄為無法判定。檢驗(yàn)結(jié)果用比較供檢樣品和對(duì)照樣品的位點(diǎn)差異數(shù)目表示。統(tǒng)計(jì)位點(diǎn)差異記錄的結(jié)果，計(jì)算比較位點(diǎn)數(shù)、差異位點(diǎn)數(shù)及差異位點(diǎn)。8結(jié)果判定供檢樣品和對(duì)照樣品的差異位點(diǎn)數(shù)目≥3，，判定為與對(duì)照樣品不相符。供檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的差異位點(diǎn)數(shù)目＜3，判定為與對(duì)照樣品相符。屬于下列情形之一的，需要在檢驗(yàn)報(bào)告中注明：——采用的對(duì)照樣品數(shù)據(jù)來自對(duì)照樣品DNA指紋數(shù)據(jù)庫的；——使用特異引物進(jìn)行檢測(cè)的，應(yīng)提供該特異引物的序列信息。7DB21/T2451—2015（規(guī)范性附錄）核心引物名稱和序列編號(hào)引物名稱染色體位置分組引物序列熒光染料P01bnlg439w1I上游：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC下游：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTCNEDP02umc1335y5I上游：CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG下游：GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATGPETP03umc2007y42.04I上游：TTACACAACGCAACACGAGGC下游：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACACFAMP04bnlg1940k72.08I上游：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC下游：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCCPETP05umc2105k33.00I上游：GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG下游：ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCGPETP06phi053k23.05I上游：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG下游：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGCNEDP07phi072k44.01I上游：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGG下游：CGTTGCCCATACATCATGCCTCVICP08bnlg2291k44.06I上游：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG下游：CATAACCTTGCCTCCCAAACCCVICP09umc1705w15.03I上游：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG下游：CACGTACGGCAATGCAGACAAGVICP10bnlg2305k45.07I上游：CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG下游：CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTGNEDP11bnlg161k86.00I上游：TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCG下游：GATGGATGGAGCATGAGCTTGCVICP12bnlg1702k16.05I上游：GATCCGCATTGTCAAATGACCAC下游：AGGACACGCCATCGTCATCAVICP13umc1545y27.00I上游：AATGCCGTTATCATGCGATGC下游：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGTNEDP14umc1125y37.04I上游：GGATGATGGCGAGGATGATGTC下游：CCACCAACCCATACCCATACCAGVICP15bnlg240k18.06I上游：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC下游：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATACPETP16phi080k158.08I上游：TGAACCACCCGATGCAACTTG下游：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTCPETP17phi065k99.03I上游：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC下游：GGACCCAGACCAGGTTCCACCNEDP18umc1492y139.04I下游：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGGPETP19umc1432y610.02I上游：GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC下游：GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGCPETP20umc1506k1210.05I上游：GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG下游：TTCAGTCGAGCGCCCAACACFAMP21umc1147y4II上游：AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC下游：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGCNEDP22bnlg1671y17II上游：CCCGACACCTGAGTTGACCTG下游：CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATGFAM8DB21/T2451—2015P23phi96100y12.00II上游：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG下游：CCATCTGCTGATCCGAATACCCFAMP24umc1536k92.07II上游：TGATAGGTAGTTAGCATATCCCTGGTATCGNEDP25bnlg1520K12.09II上游：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC下游：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTGFAMP26umc1489y33.07II上游：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC下游：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGTNEDP27bnlg490y44.04II上游：GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAG下游：TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTANEDP28umc1999y34.09II上游：GGCCACGTTATTGCTCATTTGC下游：GCAACAACAAATGGGATCTCCGFAMP29umc2115k35.02II上游：GCACTGGCAACTGTACCCATCG下游：GGGTTTCACCAACGGGGATAGGVICP30umc1429y75.03II上游：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC下游：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTGVICP31bnlg249k26.01II上游：GGCAACGGCAATAATCCACAAG下游：CATCGGCGTTGATTTCGTCAGVICP32phi299852y26.07II上游：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG下游：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGTVICP33umc2160k37.01II上游：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG下游：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATTVICP34umc1936k47.03II上游：GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG下游：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTCPETP35bnlg2235y58.02II上游：CGCACGGCACGATAGAGGTG下游：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCTVICP36phi233376y18.09II上游：CCGGCAGTCGATTACTCCACG下游：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTCPETP37umc2084w29.01II上游：ACTGATCGCGACGAGTTAATTCAAAC下游：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGCNEDP38umc1231k49.05II上游：ACAGAGGAACGACGGGACCAAT下游：GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTCFAMP39phi041y610.00II上游：CAGCGCCGCAAACTTGGTT下游：TGGACGCGAACCAGAAACAGACPETP40umc2163w310.04II上游：CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC下游：CTTCGTACCATCTTCCCTACTTCATTGCNED9DB21/T2451—2015（規(guī)范性附錄） 溶液配制B.1DNA提取B.1.10.5mol/LEDTA溶液186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中，用固體NaOH調(diào)pH值至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。B.1.21mol/LTris-HCl溶液60.55gTris堿溶于適量水中，加HCl調(diào)pH至8.0，定容至500mL，高壓滅菌。B.1.30.5mol/LHCl溶液25mL濃鹽酸(36-38%)，加水定容至500mL。B.1.4CTAB提取液81.7g氯化鈉和20gCTAB溶于適量水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/LEDTA40mL，定容至1000mL，4℃貯存。B.1.5SDS提取液1mol/LTris-HCl50mL，0.5mol/LEDTA50mL，5mo