(高清版)GB∕T 38480-2020 微生物源抗生素類(lèi)次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性測(cè)定 菌絲生長(zhǎng)速率法

ICS07.080微生物源抗生素類(lèi)次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速率法國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T38480—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。1GB/T38480—2020微生物源抗生素類(lèi)次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速率法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定微生物源抗生素類(lèi)次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物源抗生素類(lèi)次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1抑制中濃度medianinhibitoryconcentrationIC50對(duì)真菌生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到50%時(shí)的濃度。3.2抗真菌活性antifungalactivity抗制真菌生長(zhǎng)繁殖的能力。4原理將供試次生代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基混合，以培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)速度來(lái)衡量次生代謝產(chǎn)物抑絲狀真菌的能力，通過(guò)計(jì)算IC?o來(lái)判定活性。5試劑或材料5.2馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。稱(chēng)取馬鈴薯浸粉3.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂20.0g,然后將上述各成分加入1000mL蒸餾水中，煮沸溶解，pH自然，分裝至250mL錐形瓶中，121℃滅菌20min,備用。也可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基。5.3指示菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)ATCC76145。根據(jù)微生物源抗生素類(lèi)次生代謝產(chǎn)物應(yīng)用領(lǐng)域不同，也可以采用其他菌株作為供試菌。2GB/T38480—20206儀器設(shè)備6.1恒溫培養(yǎng)箱：溫度偏差在±1℃以?xún)?nèi)。6.2超凈工作臺(tái)。6.3無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。6.6無(wú)菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器。7操作步驟7.1指示菌培養(yǎng)傾注融化并經(jīng)121℃滅菌冷卻至55℃左右的PDA固體培養(yǎng)基15mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固后制成PDA平板，將立枯絲核菌凍存菌株用無(wú)菌接種針挑取少量菌絲接種到PDA平板中間，28℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至菌絲覆蓋整個(gè)平板，備用。上述操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。7.2供試樣品制備極性樣品直接用水充分溶解(非極性樣品加一定濃度的表面活性劑充分溶解),配制成一定濃度的濾膜過(guò)濾，然后用無(wú)菌水(或相應(yīng)的表面活性劑)按2倍或5倍濃度逐級(jí)稀釋?zhuān)苽涑芍辽?個(gè)不同濃度的待測(cè)溶液，逐級(jí)稀釋時(shí)應(yīng)確保既有抑制率大于50%分布的濃度點(diǎn)，也有抑制率小于50%分布的濃度點(diǎn)，現(xiàn)配現(xiàn)用。7.3檢測(cè)平板制備將7.2中制備的供試樣品分別用冷卻至55℃±1℃的PDA培養(yǎng)基按1:9的比例稀釋?zhuān)浞只靹蚝笥脽o(wú)菌吸管各取10mL移至無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿使其均勻鋪平，待其凝固后制成檢測(cè)平板，用對(duì)應(yīng)的溶劑和PDA混合制備的平板作為空白對(duì)照平板，備用。7.4抑菌活性測(cè)定用無(wú)菌打孔器(內(nèi)徑5mm±0.1mm)在活化的指示菌平板中相同的半徑邊緣打孔，用無(wú)菌鑷子取菌餅正置于7.3制備的檢測(cè)平板中間。每個(gè)處理重復(fù)5次。將平板正置于28℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h,取出，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，兩次測(cè)量所得的平均值即為菌落直徑。8結(jié)果計(jì)算抑制率按式(1)計(jì)算：式中：………D?——空白對(duì)照平板中形成的菌落直徑，單位為毫米(mm);D?——供試次生代謝產(chǎn)物平板中形成的菌落直徑，單位為毫米(mm)