定量分析流程與經(jīng)驗(yàn)

第一步：Q1SCAN——確定母離子的質(zhì)荷比根據(jù)待測化合物性質(zhì)，選擇分析的極性(＋/－)、離子化方式(ESI/APCI)，根據(jù)分子量選擇掃描范圍和時(shí)間確定母離子的質(zhì)荷比，準(zhǔn)確到小數(shù)點(diǎn)后一位。參數(shù)設(shè)置：掃描方式：Q1Scan質(zhì)量范圍：ParameterRange，100～MW+30，t=1～2secCenterWidth，MW±5Da，t=0.5sec通過手動(dòng)調(diào)節(jié)DP、GS1，使噴霧平穩(wěn)、有效第二步:ProductIonScan--確定子離子的質(zhì)荷比●得到高質(zhì)量的MS2圖，母離子的強(qiáng)度為圖譜中基峰強(qiáng)度的1/3到1/4為宜●平滑后選擇子離子質(zhì)荷比，確定到小數(shù)點(diǎn)后一位參數(shù)設(shè)置掃描方式：ProductIonScan質(zhì)量范圍：ParameterRange，50～MW+10，t=1～2sec通過手動(dòng)調(diào)節(jié)CE第三步：優(yōu)化化合物參數(shù)●根據(jù)前面選出的母、子離子，組建MRM離子對●選擇多個(gè)離子對時(shí)，應(yīng)合理分配每一對的分析時(shí)間●用“Ramp”，優(yōu)化Compound項(xiàng)下各參數(shù)，以及Source項(xiàng)下CAD參數(shù)。各離子對應(yīng)分別設(shè)定?！癯醪浇RM方法●一般優(yōu)化兩次，以得到比較確切的結(jié)果第四步：方法轉(zhuǎn)化：將連續(xù)進(jìn)樣方法→LC-MS方法●關(guān)掉所有質(zhì)譜分析界面，將現(xiàn)有質(zhì)譜體系滅活，激活液相色譜、質(zhì)譜設(shè)備。●單擊Acquire中BuildAcquireMethod，打開上面保存過的MRM方法，添加設(shè)備：色譜泵、自動(dòng)進(jìn)樣器等?！裨O(shè)置色譜同步。●設(shè)置色譜參數(shù)，分析時(shí)間一般為0.6～1min，流動(dòng)相組成和流量與實(shí)際樣品分析時(shí)相同；修改質(zhì)譜分析時(shí)間，與色譜參數(shù)一致；設(shè)置GS1、GS2、TEM初始值為40、40、400左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。第五步：FIA-優(yōu)化Source參數(shù)●將前面用過的樣品溶液稀釋100～1000倍。●在Tune項(xiàng)下，雙擊QuantitativeOptimization，選擇FIA分析根據(jù)向?qū)нM(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化。不接色譜柱進(jìn)行FIA定量優(yōu)化●注意：需要優(yōu)化的各可選值之間用“;”分隔。●當(dāng)對源參數(shù)含義及設(shè)置比較清楚后，可以省略此步。第六步：色譜條件優(yōu)化●接好并平衡色譜柱，用適當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品考察分離情況●根據(jù)色譜分離情況，設(shè)定梯度洗脫●MRM方式可以不必所有峰都基線分離，但要注意避開基質(zhì)離子抑制的干擾●調(diào)整色譜流動(dòng)相組成和流速，并相應(yīng)調(diào)整源參數(shù)第七步：標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備●空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成不同濃度●根據(jù)LC流動(dòng)相組成，選擇稀釋液，配制實(shí)際樣品●編輯批處理文件，排列進(jìn)樣順序●平衡MS離子源和色譜柱●LC-MS/MS采集數(shù)據(jù)第八步：數(shù)據(jù)處理●標(biāo)準(zhǔn)曲線的制做●正確積分色譜圖●有內(nèi)標(biāo)和無內(nèi)標(biāo)的計(jì)算方法●最后結(jié)果的打印、存貯、復(fù)制準(zhǔn)備工作●查閱文獻(xiàn)●做好樣品前處理，萃取濃縮分離純化●有條件的可先在HPLC上摸好LC條件，能夠基本分離更好●溶劑包括水的純度，最好色譜純以上,體系符合MS要求●新的色譜柱可能要先沖洗很長時(shí)間才能干凈,某些樣品非常容易吸附在進(jìn)樣閥和管路中，用溶劑清洗●質(zhì)譜儀須校準(zhǔn)，預(yù)熱時(shí)間要足夠長，氣流的穩(wěn)定也很重要,氣閥開度要注意，達(dá)到穩(wěn)定程度MS條件優(yōu)化——先定性后定量首先，確定離子化方式：ESIorAPCI，POSorNEG用10-100ppm的純樣，Q1SCAN察看存在哪些離子，要能夠看到待測的母離子，應(yīng)明顯比周圍的噪聲離子高，通過改變DP,觀察離子的增減,若為POS方式，看M+1，M+18，M+23等等,初步判斷分子離子,如看不到則可能是濃度太低或離子化方式不合適，或選擇的溶劑體系不合適母離子選M+H,或M-H最好,但有時(shí)只有M+NH4,M+Na等,這樣CAD能量可能需要高些,選擇[M+H]+，還是+NH4，+Na等，要由化合物決定。加合離子若穩(wěn)定，則可用，不穩(wěn)定則可能需換流動(dòng)相，但+H通常好些，所需碰撞能量低，靈敏度高SIM與MRM，單級Q只能SIM，MRM可看成2個(gè)SIM，選擇性更好●再根據(jù)上一步確定的母離子進(jìn)行PRODUCTSCAN，確保所有碎片離子都來自待測化合物，而不是溶液中的雜質(zhì)，找出較強(qiáng)的碎片離子信息。還可改變CE，從中選定MRM需要測定的一對或更多離子對,為最后LC-MS/MS聯(lián)用做準(zhǔn)備●做PRODUCTSCAN時(shí)，注意小數(shù)點(diǎn)后的位數(shù),MRM輸入要準(zhǔn),靈敏度才高●先多選幾個(gè)離子對，待出現(xiàn)基質(zhì)干擾時(shí)可換，最后根據(jù)法規(guī)要求確定離子對數(shù)目●MRM方式優(yōu)化儀器，通過優(yōu)化儀器參數(shù)，使得母、子離子都達(dá)到一定強(qiáng)度水平，使MRM靈敏度最高?？上茸寖x器自動(dòng)優(yōu)化參數(shù)，然后再手動(dòng)細(xì)致優(yōu)化，只檢測一對離子時(shí)根據(jù)TIC的強(qiáng)度來確定儀器參數(shù)，一次優(yōu)化多對離子時(shí)，要根據(jù)每對離子的XIC強(qiáng)度來分別確定儀器參數(shù)LC條件優(yōu)化：色譜柱長度可根據(jù)分離的要求而定，定性可長些,定量在能有效排除干擾情況下盡量短,提高效率流速高，峰形好不同牌號色譜柱，效果很可能不同PH的影響-正離子方式PH要低些，負(fù)離子方式PH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形，以至定量誤差流動(dòng)相加乙酸銨可適合大部分測定要求●用流動(dòng)相配的標(biāo)樣，初步優(yōu)化確定LC條件是否合適●標(biāo)準(zhǔn)品工作液現(xiàn)配現(xiàn)做，尤其是較低濃度，時(shí)間長了可能因吸附分解等降低●進(jìn)樣順序要先稀后濃●洗針液要常換，進(jìn)過濃樣后要進(jìn)一針空白，檢驗(yàn)是否有殘留污染●順序：純樣-添加樣-實(shí)際樣品●流動(dòng)相液優(yōu)化后，空白提取液配制標(biāo)準(zhǔn)再優(yōu)化，看干擾，空白添加再提取后看回收率●用空白提取液配制標(biāo)準(zhǔn)樣做曲線，準(zhǔn)確，有效排除干擾因素前處理方法的優(yōu)化●LC，MS都優(yōu)化還不行，改提取方法●離子抑制-改變前處理方法或LC條件●內(nèi)標(biāo)用法，藥代動(dòng)力學(xué)時(shí)多采用內(nèi)標(biāo)，選擇原則：內(nèi)標(biāo)物與被測物的化學(xué)性質(zhì)有區(qū)別時(shí)，要注意干擾基質(zhì)對他們的離子化影響的不同，盡量選同系物。還可利用同位素標(biāo)記●衍生化：有時(shí)有助于信號強(qiáng)，且穩(wěn)定，例如硝基呋喃類，衍生化后容易測量。數(shù)據(jù)處理●最低檢出限，信噪比～3:1，定量限～10:1●當(dāng)濃度低，信號弱，自動(dòng)積分不準(zhǔn)時(shí)可對峰面積手動(dòng)積分●平滑次數(shù)與峰寬因子、保留時(shí)間等設(shè)置都會影響積分值●線性范圍太寬，有時(shí)意義不大LC-MS/MS樣品分析一般步驟準(zhǔn)備工作

1.核對樣品,名稱,編號.

2.通過詢問送樣人,查閱文獻(xiàn)等,了解樣品其他知識,例如熔點(diǎn),沸點(diǎn),溶解性等理化性質(zhì),樣品來源,光譜,波譜數(shù)據(jù)等,LC條件,可能的雜質(zhì),樣品含量,色譜柱類型,規(guī)格,流動(dòng)相,流速等等.原來溶劑,若不合適,N2吹干,再用甲醇或乙睛定量溶解.保存狀況,對溫度,光敏感否,送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求.

3.濃度非常低的樣品不能保存太長時(shí)間,容器吸附、分解等原因使樣品濃度降低,標(biāo)準(zhǔn)品工作液現(xiàn)配現(xiàn)做.先定性后定量

首先,察看存在哪些離子,通過改變DP,觀察離子的增減,M+1,18,23等等,初步判斷分子量,再進(jìn)行PRODUCTSCAN,找出碎片信息,從中選定MRM需要測定的一對或更多離子對,為最后LC-MS/MS聯(lián)用做準(zhǔn)備.特征離子的質(zhì)量色譜在復(fù)雜混合物分析及痕量分析時(shí)是LC／MS測定中最有用的譜圖，當(dāng)樣品濃度很低時(shí)LC的TIC上往往看不到峰,此時(shí),根據(jù)上一步得到的分子量信息,輸入M+1或M+23等數(shù)值,觀察提取離子的質(zhì)量色譜圖,檢驗(yàn)直接進(jìn)樣得到的信息是否在LC-MS上都能反映出來,確定LC條件是否合適,然后進(jìn)行MRM測定.正離子方式常出現(xiàn)如下離子:

-Na22Da.higherthanM+H

-K38Da.higherthanM+H

-Li6Da.higherthanM+H

-NH417Da.higherthanM+H

-ACN40Da.higherthanM+H

2M+H,2M+Na等負(fù)離子方式常出現(xiàn)如下離子:

-TFA114Da.higherthenM-H(113and227background)

-Acetate60Da.higherthenM-H

-Formic46Da.higherthenM-H

-Cl36Da.higherthanM-H根據(jù)樣品性質(zhì)確定離子化方式:高極性化合物,大分子,蛋白質(zhì)、肽類、低聚核苷酸等生物分子；胺類、季銨鹽等；含雜原子化合物如氨基甲酸酯等,適合ESI(IS)。弱極性/中等極性的小分子，如脂肪酸，鄰苯二甲酸等；含雜原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，適合APCI（HN）。ESI不行的：極端非極性化合物如苯等;APCI不行的：非揮發(fā)性樣品;熱穩(wěn)定性差的樣品。堿性化合物宜用正離子方式，酸性化合物宜用負(fù)離子方式，如未知,可能正負(fù)都要做,有些化合物正負(fù)都出峰,選擇靈敏度高的方式,不明確的優(yōu)先用正離子方式試。影響分子量測定的因素

1）PH的影響-正離子方式PH要低些,負(fù)離子方式PH要高些,除對離子化有影響外,還影響LC的峰形,以至定量誤差。

2）氣流和溫度,當(dāng)水含量高及流量大時(shí)要相應(yīng)增加.

3）溶劑和緩沖液流量,流速適當(dāng)高可以提高出峰靈敏度.4）溶劑和緩沖液的類型,正離子甲醇好,負(fù)離子乙腈好些,不揮發(fā)性鹽的影響-大量累積使儀器靈敏度下降.

5）根據(jù)樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì),選擇合適的液相色譜類型.

6）合適的電壓-樣品在源內(nèi)分解或碎裂,溫度,DP電壓要適當(dāng).

7)雜質(zhì)的影響,溶劑的純度,水-純凈水,當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多時(shí),競爭使被測物離子化不好,同時(shí)使LC分離不好.

8）樣品濃度不夠-濃縮.樣品的預(yù)處理常用方法有:

a）超濾

b）溶劑萃?。}

c）固相萃取

d）灌注（Perfusion）凈化／去鹽

e）色譜分離

反相色譜分離

親和技術(shù)分離母離子選M+H,或M-H最好,但有時(shí)只有M+NH4,M+Na等,這樣CAD能量可能需要高些,子離子當(dāng)然選相對豐度高的,可以不只一個(gè),通過優(yōu)化儀器參數(shù),使得母子離子都達(dá)到一定強(qiáng)度平衡,使MRM靈敏度最高.色譜柱的選擇原則:定性可長些,定量盡量短,提高效率,細(xì)徑柱如2mm的,1mm的,IS可不分流,

如4.6mm柱用1ml流量時(shí)靈敏度

還不是最佳,不如流量低時(shí)更好.優(yōu)化儀器,先用注射泵優(yōu)化COMPOUND項(xiàng)下面的參數(shù),如DP,CE及CAD等,再接通LC用FIA優(yōu)化其他參數(shù)及源位置,或接一個(gè)三通,樣品仍由注射泵進(jìn)入離子源,同時(shí)LC保持需要的流量.內(nèi)標(biāo)物與被測物的化學(xué)性質(zhì)有區(qū)別時(shí),要注意干擾基質(zhì)對他們的離子化影響的不同，盡量選同系物。色譜柱和管路的清洗

新的色譜柱可能要先沖洗很長時(shí)間才能干凈,某些樣品非常容易吸附在進(jìn)樣閥和管路中,進(jìn)樣順序要先稀后濃.