GB∕T 16550-2020 新城疫診斷技術(shù)

B41中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T16550—20082020-12-14發(fā)布2020-12-14實(shí)施國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)Ⅰ本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T16550—2008《新城疫診斷技術(shù)》，與GB/T16550—2008相比，主要技術(shù)變化如下：—?jiǎng)h除了毒力評(píng)價(jià)指標(biāo)中MDT和IVPI（見2008年版的4.3和4.4);—增加了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法（見第9章）。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。Ⅱ新城疫(是由新城疫病毒(強(qiáng)毒株感染禽類引起的一種急性、烈性傳染病，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將新城疫列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為一類動(dòng)物疫病。新城疫病毒可感染240多種禽類，其中家雞和珠雞最易感，感染禽（野鳥）及帶毒禽（野鳥）系主要的傳染源。新城疫病毒主要經(jīng)消化道和呼吸道傳播，被污染的水、飼料、蛋托（箱）、種蛋、雞胚和帶毒的野生飛禽、昆蟲及有關(guān)人員等均可成為傳播媒介。新城疫病毒屬于副黏病毒科(正禽腮腺炎病毒屬(目前新城疫病毒只有一種血清型，但可分為多種基因型。OIE規(guī)定，新城疫是由新城疫病毒強(qiáng)毒株引起的禽類感染，因此，對(duì)于新城疫的診斷，除了鑒定新城疫病毒之外，還需要對(duì)其致病性進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于致病性評(píng)估的方法，可通過1日齡SPF雞ICPI進(jìn)行測(cè)定，也可通過分子生物學(xué)技術(shù)，如RT-PCR結(jié)合序列測(cè)定等。根據(jù)新城疫病毒F基因部分序列(47nt~差異，可將新城疫病毒分為和兩在國內(nèi)均系弱毒株，因此，針對(duì)的檢測(cè)方法不具有診斷意義，本標(biāo)準(zhǔn)所涉及的診斷方法均針對(duì)新城疫強(qiáng)毒株。1本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了新城疫的臨床診斷、病毒分離與鑒定、血凝和血凝抑制試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和實(shí)時(shí)熒光的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于新城疫的診斷、檢疫、檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范NY/T1948獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則3縮略語下列縮略語適用于本文件。值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)(焦碳酸二乙酯(血凝抑制(腦內(nèi)接種致病指數(shù)(新城疫(新城疫病毒(磷酸鹽緩沖液(雞紅細(xì)胞懸液(核糖核酸(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(tion)無特定病原體(4臨床診斷4.1.2傳染源主要為感染禽（野鳥）及帶毒禽（野鳥主要經(jīng)消化道和呼吸道傳播，被污染的水、飼料、蛋托（箱）、種蛋、雞胚和帶毒的野生飛禽、昆蟲及有關(guān)人員等均可成為主要的傳播媒介。24.1.3該病無明顯季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，春秋季多發(fā)。根據(jù)臨床表現(xiàn)不同，臨床致病型分為：a)嗜內(nèi)臟速發(fā)型：以消化道出血性病變?yōu)橹饕卣?，死亡率高；b)嗜神經(jīng)速發(fā)型：以呼吸道和神經(jīng)癥狀為主要特征，死亡率高；c)中發(fā)型：以呼吸道和神經(jīng)癥狀為主要特征，死亡率低；d)緩發(fā)型：以輕度或亞臨床性呼吸道感染為主要特征；e)無癥狀腸道型：以亞臨床性腸道感染為主要特征。當(dāng)病雞出現(xiàn)下列之或全部臨床癥狀時(shí)，可作為初步診斷的依據(jù)之：c)糞便稀薄，呈黃綠色或黃白色；d)發(fā)病后期出現(xiàn)扭頸、翅膀麻痹、癱瘓等神經(jīng)癥狀；e)免疫禽群出現(xiàn)產(chǎn)蛋下降，蛋殼質(zhì)量變差，產(chǎn)畸形蛋或異色蛋。當(dāng)病雞出現(xiàn)下列之一或全部剖檢變化時(shí)，可作為初步診斷的依據(jù)之一：a)全身黏膜和漿膜出血，以呼吸道和消化道最為嚴(yán)重，氣管環(huán)狀出血；b)腺胃黏膜水腫，乳頭和乳頭間有出血點(diǎn)；d)十二指腸和直腸黏膜出血，泄殖腔黏膜出血，有的可見纖維素性壞死病變；e)腦膜充血和出血；f)鼻竇、喉頭、氣管黏膜充血，偶有出血，肺可見淤血和水腫。家禽感染高致病性禽流感病毒后，臨床表現(xiàn)和死亡率與新城疫(ND)類似。與ND相比，高致病性禽流感以全身器官出血為特征，包括：腫頭，眼瞼周圍浮腫，雞冠和肉垂腫脹、發(fā)紫、出血和壞死，腿及爪鱗片出血等。在臨床實(shí)踐中，很難依據(jù)臨床癥狀和剖檢變化進(jìn)行區(qū)分，應(yīng)依靠實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)行鑒別。當(dāng)禽類符合4.1,且符合4.2、4.3之一的，可判定為疑似新城疫。5樣品采集與處理樣品采集宜在發(fā)病初期、選擇具有典型臨床癥狀的家禽，可采集腦、肺臟、脾臟、腎、腸（包括內(nèi)容物）、肝和心臟等組織臟器，也可采集未見明顯臨床癥狀禽類的泄殖腔和口咽拭子樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。采樣過程中不得交叉污染，在田間采樣應(yīng)勤換一次性手套，每采集一個(gè)樣品宜更換或消毒一次滅菌采樣3器具，盡量做到無菌采集。樣品采集、處理、保存和運(yùn)輸應(yīng)符合GB19489和NY/T541的要求。5.2組織樣品采集袋或其他滅菌容器并編號(hào)，在-20℃冷凍保存。5.3拭子樣品采集采集活禽樣品時(shí)可采集口咽和泄殖腔拭子。取口咽拭子時(shí)應(yīng)將拭子深入喉頭及上腭裂來回旋轉(zhuǎn)2次~3次，要求可見明顯黏液。采集泄殖腔拭子時(shí)應(yīng)將拭子深入泄殖腔旋轉(zhuǎn)一圈并沾取少量糞便。對(duì)于鴿、珍禽等體型較小的禽鳥，采樣時(shí)需用適合的拭子，避免因拭子取樣給禽類造成損傷。將采集后的拭子放入盛有含青霉素鏈霉素甘油）的采樣管中，編號(hào)。用于病毒分離的拭子樣品于-20℃冷凍保存，盡量避免反復(fù)凍融。5.4血清樣品采集無菌采集禽類的血液，每只2.0mL,用于新城疫抗體檢測(cè)。無菌分離血清，裝入2.0mL離心管中，加蓋密封后冷藏或冷凍保存。5.5樣品運(yùn)輸樣品采集后置保溫箱中，加入預(yù)冷的冰袋，密封，宜24h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室。5.6樣品處理樣品處理的生物安全措施按照GB19489和NY/T1948進(jìn)行。5.6.2組織樣品處理用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品，置組織勻漿器充分研磨，置于含抗生素的PBS(0.01moL/L、制成濃度為的懸浮液凍融次室溫(靜置2h,3000r/min離心5min,取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5mL離心管中，編號(hào)備用。5.6.3拭子樣品處理將采集的拭子樣品在振蕩器上充分混合后，將拭子中的液體充分?jǐn)D壓后棄去拭子，室溫靜置作用離心取上清液轉(zhuǎn)入無菌的離心管中處理好的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h。若需長期保存，應(yīng)放置于-70℃冰箱中，反復(fù)凍融不超過3次。6病毒分離與鑒定不同溫度4微量可調(diào)移液器注射器滅菌6.1.6Ⅱ級(jí)生物安全柜。見附錄6.2.21%雞紅細(xì)胞懸液（RBC見附錄B。用1.0mL注射器吸取上清液，按0.2mL／枚的劑量經(jīng)尿囊腔接種9日齡~11日齡的SPF雞胚，每個(gè)樣品至少接種5枚。接種后，37℃~38℃繼續(xù)孵育。18h后每12h照胚，觀察雞胚死亡情況。收集18h以后的死胚及96h仍存活雞胚，置2℃~8℃、4h或過夜，無菌收取雞胚尿囊液。6.3.3.1血凝（HA）試驗(yàn)：收獲感染雞胚尿囊液，測(cè)定其血凝活性。如果沒有血凝活性或血凝效價(jià)≤3log2，則用初代分離的尿囊液于SPF雞胚繼續(xù)盲傳兩代，若仍為陰性，則認(rèn)為新城疫病毒分離陰性。試驗(yàn)方法按7.3執(zhí)行。6.3.3.2血凝抑制（HI）試驗(yàn)：對(duì)于HA效價(jià)高于或等于4log2的尿囊液，應(yīng)采用新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)以確認(rèn)是否含有新城疫病毒。試驗(yàn)方法按7.4執(zhí)行。經(jīng)確定僅為新城疫病毒的情況下，應(yīng)根據(jù)1日齡SPF雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）測(cè)定病毒毒力。6.3.4.2.1HA效價(jià)高于或等于4log2的新鮮感染尿囊液（不超過24h~48h，細(xì)菌檢驗(yàn)為陰性用無菌等滲鹽水作10倍稀釋。腦內(nèi)接種出殼后之間的雛雞共接種每只接種每觀察一次共觀察6.3.4.2.4每天觀察應(yīng)給雞打分，正常雞記作0，病雞記作1，死雞記作2（每只死雞在其死后的每日觀察6.3.4.2.5ICPI是每只雞8d內(nèi)所有觀察數(shù)值的平均數(shù)，計(jì)算方法見公式（1）。式中：Σs—累計(jì)發(fā)病數(shù)；累計(jì)死亡數(shù)；累計(jì)觀察雞的總數(shù)。56.3.4.3.1ICPI值越大，NDV致病性越強(qiáng)，最強(qiáng)毒力病毒的ICPI接近2.0,而弱毒株的ICPI值為0?？膳袨殛栃浴?血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)微量可調(diào)移液器(7.2.21%雞紅細(xì)胞懸液(RBC)：見附錄B。7.2.3新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原，新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清。在孔孔孔均加入在第1孔中加入25μL抗原或病毒懸液，吹打3次~5次，充分混勻。將抗原或病毒懸液在反應(yīng)板上進(jìn)行系列倍比稀釋，即從第1孔中吸取25μL懸液至第2孔，混勻后再吸取25μL懸液至第3孔，依次進(jìn)行倍比稀釋到第11孔，最后從第11孔吸取25μL棄去，第12孔不加抗原或病毒懸液，作為PBS對(duì)照。每孔加入每孔加入25μL體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液（將雞紅細(xì)胞懸液充分搖勻后加入）。將微量反應(yīng)板在微型振蕩器振蕩混勻或輕扣反應(yīng)板混勻反應(yīng)物，室溫靜置20min~30min或2℃~8℃靜置60min,當(dāng)對(duì)照孔（第12孔）紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。7.3.6結(jié)果判定：將反應(yīng)板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無淚珠狀流淌。以完全凝集（不流淌）的最高稀釋倍數(shù)為抗原或病毒懸液的血凝效價(jià)。完全凝集的病毒的最高稀釋倍數(shù)為1個(gè)血凝單位(HAU)。7.4血凝抑制試驗(yàn)7.4.1根據(jù)測(cè)得抗原或病毒懸液血凝效價(jià)配制4單位抗原(4HAU)。4HAU的配制方法如下：假設(shè)抗原的血凝效價(jià)為8log2(1∶256),則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1∶64(256除以4),稀釋時(shí)，將1mL抗原加入63mLPBS中即為4HAU抗原。7.4.24HAU檢測(cè)：4單位抗原應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，在使用前進(jìn)行標(biāo)定。將配制的4HAU進(jìn)行系列稀釋，使液為4HAU,則1∶4稀釋度將給出凝集終點(diǎn)；如果4HAU高于4個(gè)單位，可能應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果將抗原稀釋度做適當(dāng)調(diào)整，使工作液確為4HAU。取96孔V型微量血凝板，用移液器在第1孔～第11孔各加入25μLPBS,第12孔加入在第1孔加入25μL血清，充分混勻后移出25μL至第2孔，依次類推，倍比稀釋至第10孔，并從第10孔棄除25μL。6在第1孔～第11孔各加入25μL4HAU抗原，振蕩15s,使液體混合均勻，室溫靜置至少或至少在第1孔～第12孔每孔加入25μL1%的雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻，室溫靜置20min~40min或2℃~8℃靜置40min~60min,對(duì)照孔紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。7.4.7第11孔為抗原對(duì)照，第12孔為PBS對(duì)照，每次測(cè)定還應(yīng)設(shè)已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清作對(duì)照。7.4.8結(jié)果判定：將反應(yīng)板傾斜，從背側(cè)觀察加樣孔底部的紅細(xì)胞是否呈淚痕狀流淌。以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀釋倍數(shù)為該血清的HI抗體效價(jià)。只有當(dāng)陰性血清對(duì)照孔血清效價(jià)≤2log2,陽性血清對(duì)照孔血清效價(jià)與標(biāo)定效價(jià)相差≤1個(gè)滴度，紅細(xì)胞對(duì)照無自凝現(xiàn)象時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果有效。HI效價(jià)≤3log2,判為HI試驗(yàn)陰性；HI效價(jià)≥4log2判為HI試驗(yàn)陽性。8反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：最大離心力12000g以上。8.1.3Ⅱ級(jí)生物安全柜。等不同規(guī)格及其配套的無核酸酶處理的離心管與吸頭。8.2.1RNA提取試劑Trizol。也可用商品化RNA提取試劑盒，或其他等效RNA提取試劑和方法，如自動(dòng)化核酸提取儀和其他配套核酸抽提試劑進(jìn)行核酸提取。8.2.475%乙醇：用新開啟的無水乙醇（分析純）和DEPC處理水按3∶1配制而成，-20℃預(yù)冷。8.2.5RT-PCR相關(guān)試劑：可選擇商品化試劑盒。8.2.6陽性對(duì)照：滅活的新城疫強(qiáng)毒感染雞胚尿囊液。8.2.7陰性對(duì)照：SPF雞胚尿囊液。取處理后的拭子樣品、組織樣品或尿囊液3000r/min離心5min,取200μL離心后的上清提取RNA。8.3.2病毒RNA提取RNA提取應(yīng)保證無細(xì)菌及核酸污染，實(shí)驗(yàn)材料和容器應(yīng)經(jīng)過消毒處理并一次性使用。提取RNA時(shí)應(yīng)避免RNA酶污染。用Trizol提取核酸RNA的操作步驟如下：在無酶的離心管中加入檢測(cè)樣品然后加入振蕩室7溫靜置10min。加入三氯甲烷氯仿顛倒混勻室溫靜置離心c)管內(nèi)液體分為三層，取500μL上清液于離心管中，加入500μL預(yù)冷(-20℃)的異丙醇，顛倒混勻，靜置10min。12000r/min離心15min沉淀RNA,棄去所有液體（離心管在吸水紙上加入預(yù)冷乙醇洗滌顛倒混勻次離心10min。e)調(diào)水浴至60℃。離心管在室溫下干燥至沒有水滴。加入40μLDEPC處理水，60℃水浴中作用10min,充分溶解RNA,-70℃保存或立即使用。8.3.3配置RT-PCR反應(yīng)體系引物針對(duì)新城疫病毒F基因設(shè)計(jì)，上游引物的序列為下游引物的序列為8.3.3.2RT-PCR反應(yīng)體系配置RT-PCR反應(yīng)體系配置見表1。體系配好后蓋緊PCR反應(yīng)管蓋，并做好標(biāo)記。表1RT-PCR反應(yīng)體系配置表組分體積無RNA酶滅菌超純水610×反應(yīng)緩沖液25dNTPs2抑制劑(0507酶(07上游引物05下游引物05模板RNA3合計(jì)8.3.4RT-PCR反應(yīng)按8.3.3.2的加樣順序全部加完后，充分混勻，瞬時(shí)離心，使液體都沉降到PCR管底。同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。按照下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：42℃反轉(zhuǎn)錄30min;95℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,退火延伸共進(jìn)行次循環(huán)最后再延伸最終的產(chǎn)物置4℃保存。8.3.5擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)8.3.5.11.5%瓊脂糖凝膠板的制備：稱取1.5g瓊脂糖，加入100mL1×TAE緩沖液中。加熱融化后8數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣孔放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒膠面。產(chǎn)物與加樣緩沖液混勻后加入瓊脂糖凝膠板的一個(gè)加樣孔中。每次電泳同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)DNA陰性對(duì)照、陽性對(duì)照。電泳接通電源恒壓電泳電泳結(jié)束后，取出凝膠板置凝膠成像儀（或紫外線透射儀）上觀察并記錄結(jié)果。bp左右擴(kuò)增條帶（參見附錄C),同時(shí)陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶。bp左右的目的片段（與陽性對(duì)照大小相符判為新城疫病毒核酸陽性；檢測(cè)樣品未出現(xiàn)目的片段，判為新城疫病毒核酸陰性。8.5NDV強(qiáng)毒感染的確定對(duì)擴(kuò)增到的目的片段進(jìn)行序列測(cè)定，根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果，對(duì)毒株F基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析。如果毒株F2蛋白的C端有“多個(gè)堿性氨基酸殘基”，F(xiàn)1蛋白的N端即117位為苯丙氨酸，可確定為新城疫病毒強(qiáng)毒感染?！岸鄠€(gè)堿性氨基酸”是指毒株F2蛋白的C端在113位到116位殘基之間至少有三個(gè)精氨酸或賴氨酸。實(shí)時(shí)熒光其余器材同9.3引物和探針根據(jù)我國流行的所有基因型（基因Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅻ型）新城疫強(qiáng)毒F基因序列設(shè)計(jì)引物、探針。其中正向引物序列為反向引物序列為′探針序列為′探針淬滅基團(tuán)，R、Y為簡(jiǎn)并堿基(R:A/G;Y:C/T)。9.4.2病毒RNA的提取99.4.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)9.4.3.1按照表2配置實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系，蓋緊蓋子并做好標(biāo)記。表2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系配置表組分體積DEPC處理水62×反應(yīng)混合液正向引物05反向引物05探針0505模板RNA2合計(jì)9.4.3.2按9.4.3.1的加樣順序全部加完后，充分混勻，瞬時(shí)離心，使液體都沉降到PCR管底。同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。將PCR管放在熒光定量PCR儀器上進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄預(yù)變性然后變性退火共進(jìn)行次循環(huán)每次循環(huán)在59℃1min時(shí)搜集信號(hào)。9.4.4.1陽性對(duì)照擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的S形曲線，且Ct值≤30（參見附錄D)。9.4.4.2陰性對(duì)照無Ct值，且無擴(kuò)增曲線。9.5.1樣品無Ct值或Ct值＞38且無標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線，判為陰性。9.5.2樣品Ct值≤35,且出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S形擴(kuò)增曲線，判為陽性。9.5.3樣品35<Ct值≤38且擴(kuò)增曲線均呈標(biāo)準(zhǔn)的S形曲線，判為可疑，需重新檢測(cè)。如重復(fù)后仍然為上述結(jié)果，判為陽性，否則判為陰性。10綜合判定10.1臨床判定為疑似的易感禽類，按第6章分離出新城疫病毒，且鑒定其ICPI≥0.7,或經(jīng)第8章RT-PCR檢測(cè)呈陽性且經(jīng)序列分析證明F蛋白裂解位點(diǎn)具有強(qiáng)毒特征，或經(jīng)第9章實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)呈陽性的，可判定為新城疫。10.2臨床無明顯特異癥狀的非免疫動(dòng)物經(jīng)第7章血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)出新城疫病毒抗體的，可判定新城疫病毒感染。10.3被檢禽雖然沒有明顯的臨床癥狀和病理變化，但病原檢測(cè)符合10.1的病原檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)，可判定為新城疫病毒強(qiáng)毒感染。附錄A（規(guī)范性附錄）磷酸鹽緩沖液配制磷酸鹽緩沖液(的配制方法如下：氯化鈉(氯化鉀(磷酸氫二納(磷酸二氫鉀(e)加蒸餾水至800