安捷倫高效液相色譜基本原理-理論

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液相色譜基本原理—理論安捷倫科技致力于為教育領(lǐng)域做出貢獻(xiàn)，并愿意提供這里所包含的為公司所擁有之資料的訪問(wèn)權(quán)限。本幻燈片集由安捷倫科技制作?；脽羝氖褂脙H限于教學(xué)目的。其中所包含的資料和信息被“原樣”接受，安捷倫對(duì)于資料不作任何形式的陳述或擔(dān)保，并且對(duì)于您對(duì)資料的使用或復(fù)制不承擔(dān)責(zé)任。由于您使用、復(fù)制或傳播這些資料所引起或相關(guān)之損失，安捷倫不承擔(dān)責(zé)任。您同意賠償并使安捷倫免于遭受由于您使用或復(fù)制這些資料所招致的任何索賠。前言高效液相色譜（HPLC，曾稱(chēng)為高壓液相色譜）是分析化學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)技術(shù)，可用于分離混合物中的多種組分、對(duì)每種組分進(jìn)行鑒定，以及對(duì)組分進(jìn)行定量分析。HPLC利用泵使含有樣品混合物的加壓液體溶劑通過(guò)填充有固體吸附材料的色譜柱。樣品中的每種組分與吸附材料的相互作用都略有不同，這使不同組分具有不同流速，從而當(dāng)它們流出色譜柱時(shí)即可實(shí)現(xiàn)分離。目錄(ToC)前言色譜柱內(nèi)部的作用原理關(guān)鍵參數(shù)保留時(shí)間與峰寬分離度—基線分離分離度—基本公式柱效或理論塔板數(shù)保留因子選擇性或分離因子影響選擇性的因素選擇性—

示例1選擇性—

示例2選擇性—

示例3塔板數(shù)VanDeemter方程渦流擴(kuò)散縱向擴(kuò)散傳質(zhì)阻力有關(guān)VanDeemter方程的更多內(nèi)容峰容量梯度分析定義峰容量計(jì)算峰寬示例前言

色譜柱內(nèi)部的作用原理時(shí)間t分離tr2-tr1峰寬Wb1,2ToC前言

色譜柱內(nèi)部的作用原理tr2-tr1較好分離較差分離較好分離較差分離Wb1Wb2Wb1Wb2對(duì)比對(duì)比tr2-tr1ToC時(shí)間t分離tr2-tr1峰寬Wb1,2前言

色譜柱內(nèi)部的作用原理分離度是對(duì)色譜柱分離目標(biāo)峰能力的描述。分離度大小能表示是否實(shí)現(xiàn)了基線分離。ToC關(guān)鍵參數(shù)

保留時(shí)間與峰寬tr1tr2Wb1Wb2W1/2httri 化合物i的保留時(shí)間W1/2 半峰高處的峰寬Wbi 基線峰寬ToC關(guān)鍵參數(shù)

分離度—基線分離分離度是對(duì)色譜柱分離目標(biāo)峰能力的描述。分離度將受到柱效(N)、選擇性(a)和保留(k)的影響?？梢赃M(jìn)行充分定量分析的可測(cè)分離的最小分離度為1?？杀鎰e出兩個(gè)等高峰之間峰谷的最低分離度為0.6。穩(wěn)定的分析方法通常需要分離度達(dá)到1.7或更高。1.6被認(rèn)為是達(dá)到基線分離，并且可確保獲得最準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)分離度。htRs=1.5ToC關(guān)鍵參數(shù)

分離度—(U)HPLC的基本方程式選擇性柱效保留我們可以通過(guò)優(yōu)化下述任何一個(gè)參數(shù)來(lái)改善分離度：選擇性對(duì)分離度影響最大。選擇性的微小變化

即可導(dǎo)致分離度的極大改變。保留只在k值小的時(shí)候有顯著影響。柱效描述了色譜柱的分離能力。ToC關(guān)鍵參數(shù)

分離度—(U)HPLC的基本方程式該圖闡明了分離度是選擇性、柱效和保留的函數(shù)。ToC選擇性對(duì)分離度的影響最大改變固定相改變流動(dòng)相塔板數(shù)最容易增加關(guān)鍵參數(shù)

柱效或理論塔板數(shù)(N)柱效用于比較不同色譜柱的性能。由理論塔板數(shù)N表示。具有高塔板數(shù)的色譜柱柱效更高。與具有較低塔板數(shù)的色譜柱相比，具有高塔板數(shù)的色譜柱在給定保留時(shí)間處可以獲得更窄的色譜峰。影響柱效的參數(shù)：柱長(zhǎng)（增加柱長(zhǎng)可以提高柱效）填料粒徑（減小填料粒徑可以提高柱效）ToC關(guān)鍵參數(shù)

保留因子(k)保留因子測(cè)定了樣品組分在固定相與流動(dòng)相中的保留時(shí)間之比。它是用保留時(shí)間除以不保留峰的出峰時(shí)間(t0)計(jì)算得出的。影響保留因子的參數(shù)：固定相流動(dòng)相梯度斜率*系統(tǒng)駐留體積**僅指梯度洗脫ToC該方程式顯示出流速(F)、梯度時(shí)間(tG)、梯度范圍(ΔΦ)和柱體積(Vm)是如何影響保留因子的。請(qǐng)記?。簽槭贡Ａ粢蜃颖３趾愣?，分母的改變需要由分子相應(yīng)按比例改變來(lái)抵消，反之亦然。關(guān)鍵參數(shù)

保留因子(k)—梯度洗脫ToC關(guān)鍵參數(shù)

選擇性或分離因子(α)選擇性是兩個(gè)峰頂點(diǎn)間時(shí)間或距離的量度。如果α

=1，則兩個(gè)峰具有相同的保留時(shí)間，并且會(huì)被共洗脫。它被定義為容量因子之比。影響保留因子的參數(shù)：固定相流動(dòng)相柱溫ToCa 選擇性k1 第一個(gè)峰的保留因子k2i

第二個(gè)峰的保留因子關(guān)鍵參數(shù)

N、α及k對(duì)分離度的影響ToC影響分離的因素同一種樣品采用不同固定相，但始終采用相同柱溫、流動(dòng)相和梯度進(jìn)行分析。ToC影響分離的因素同一種樣品采用相同固定相和柱溫，但采用不同流動(dòng)相進(jìn)行分析（相同梯度）。ToC同一種樣品采用相同固定相、流動(dòng)相及相同梯度，但采用不同柱溫進(jìn)行分析。影響分離的因素ToC影響分離的因素

HPLC中“塔板”的含義

理論塔板是一種假設(shè)的分離階段，其中一種物質(zhì)的兩相（液相和氣相）達(dá)到平衡。ToCLC 柱長(zhǎng)dp 填料粒徑h 折合理論塔板高度影響分離的因素高塔板數(shù)(N)可提供：尖銳的窄峰更出色的檢測(cè)能力分離復(fù)雜樣品的峰容量但分離度只隨塔板數(shù)平方根的增大而提高。RS~

N塔板數(shù)的增大受實(shí)驗(yàn)條件的限制分析時(shí)間、柱壓ToC影響分離的因素

將峰寬和折合理論塔板高度結(jié)合起來(lái)h：折合理論塔板高度ToCVanDeemter方程

渦流擴(kuò)散weddy~λdpλ：色譜柱填料的品質(zhì)擴(kuò)散路徑的不同是由于：不同的路徑色譜柱填充不佳較寬的粒徑分布ToCVanDeemter方程

軸向或縱向擴(kuò)散由于分析物的自身擴(kuò)散導(dǎo)致峰寬增大低流速時(shí)，分析物會(huì)在流動(dòng)相中保留很長(zhǎng)時(shí)間峰寬的顯著增大理論塔板高度的增大流速ToCVanDeemter方程

“傳質(zhì)阻力”wC~dp2不同的擴(kuò)散路徑多孔填料流動(dòng)相的固定層ToCVanDeemter方程VanDeemter方程通過(guò)綜合考慮分離過(guò)程中引起峰展寬的物理學(xué)、動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)因素，將分離柱單位長(zhǎng)度的總峰展寬與流動(dòng)相線性速率聯(lián)系起來(lái)（維基百科）。h=f(

weddy+wax+wC)h=A+B/u+Cu渦流擴(kuò)散擴(kuò)散系數(shù)傳質(zhì)阻力ToCVanDeemter方程折合理論塔板高度(h)流速加和曲線：VanDeemter+軸向擴(kuò)散渦流擴(kuò)散傳質(zhì)阻力h=A+B/u+CuToCVanDeemter方程

針對(duì)不同填料粒徑進(jìn)行測(cè)定5.0

m3.5

m

1.8

mToC使用小粒徑填料可以獲得較小的理論塔板高度，從而實(shí)現(xiàn)更高的分離效率對(duì)于更小粒徑的填料，流速提高時(shí)分離效率的損失更少化合物和儀器特異性最佳流速取決于具體化合物等度運(yùn)行：峰寬僅取決于擴(kuò)散過(guò)程。梯度運(yùn)行：峰寬取決于擴(kuò)散過(guò)程和柱頭梯度聚焦。峰容量

梯度分析ToC折合理論塔板高度是峰寬的函數(shù)峰容量是指在給定時(shí)間和分離度條件下可以分離的色譜峰數(shù)目(n)。峰容量取決于柱長(zhǎng)和填料粒徑等不同的因素。峰容量

定義峰容量：2.5min內(nèi)的32個(gè)峰ToC峰容量

峰容量的計(jì)算簡(jiǎn)化式：ToCwav 平均峰寬n

峰數(shù)tG 梯度運(yùn)行時(shí)間w 所選峰的峰寬峰容量

峰寬根據(jù)切線法得出的峰寬半峰寬5%峰高處的峰寬4.4%峰高處的峰寬(5σ)ToC峰容量

示例min20406080100mAU01020304050min1020304050mAU0204060色譜柱：2.1x150mm，1.8μm背壓：402bar峰容量：313色譜柱：2.1x300mm*，1.8μm背壓：598bar峰容量：406*兩根150mm色譜柱連接而成的300mm色譜柱ToC更多信息如需了解安捷倫產(chǎn)品的更多信息，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)或/chem/academia對(duì)此幻燈片演示有問(wèn)題或建議？請(qǐng)聯(lián)系academia.team@出版物標(biāo)題出版號(hào)基礎(chǔ)導(dǎo)論液相色譜手冊(cè)5990-7595CHCN應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)Theinfluenceofsilicaporesizeonefficiency,resolutionandloadinginReversed-PhaseHPLC（硅膠孔徑對(duì)反相HPLC柱效、分離度和載樣量的影響）5990-8298EN應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)Increasingresolutionusinglongercolumnswhilemaintaininganalysistime（在保持分析時(shí)間不變的條件下采用更長(zhǎng)色譜柱提高分離度）5991-0513EN海報(bào)Studyofphysicalpropertiesofsuperficiallyporoussilicaonitssuperiorchromatographicperformance（表面多孔硅膠物理性質(zhì)在其優(yōu)異色譜性能方面的研究）應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)MaximizingchromatographicpeakcapacitywiththeAgilent1290InfinityLCsystemusinggradientparameters（利用Agilent1290Infinity液相色譜系統(tǒng)的梯度參數(shù)達(dá)到色譜峰容量的最大化）5990-6933EN應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)MaximizingchromatographicpeakcapacitywiththeAgilent1290InfinityLC（采用Agilent1290Infinity液相色譜使色譜峰容量最大化）5990-6932EN應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)IncreasedpeakcapacityforpeptideanalysiswiththeAgilent1290InfinityLCsystem（采用Agilent1290Infinity液相色譜系統(tǒng)提高多肽分析的峰容量）5990-6313EN網(wǎng)頁(yè)CHROMacademy–freeaccessforstudentsanduniversitystafftoonlinecourses（CHROMacademy—學(xué)生和大學(xué)教職工可免費(fèi)訪問(wèn)在線課程）ToCToC謝謝5991-5411CHCN縮