超臨界萃取的海星內(nèi)臟油成分分析及體外抗腫瘤活性研究

摘要研究超臨界萃取海星內(nèi)臟油的化學(xué)成分組成及其體外抗腫瘤活性，初步探討其發(fā)揮抗腫瘤藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。采用超高效液相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-QTOF-MS）及氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）建立超臨界萃取海星內(nèi)臟油的化學(xué)成分輪廓譜，將樣品分子離子或碎片離子分子質(zhì)量信息與相關(guān)文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行比對，鑒定化學(xué)成分；采用CCK-8法測定超臨界萃取海星內(nèi)臟油對人肝癌HepG2細(xì)胞和人結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞的增殖抑制作用。通過UPLC-QTOF-MS共指認(rèn)出11種非揮發(fā)性成分，全部為脂肪酸類成分；GC-MS共檢測出38種揮發(fā)性成分，其中酯類29種、醇類2種、酸類6種、烷類1種，大部分為脂肪酸類成分，實現(xiàn)了超臨界萃取海星內(nèi)臟油成分的全面表征。海星內(nèi)臟油對HepG2細(xì)胞抑制率的IC50值為0.84mg/mL，對SW620細(xì)胞抑制率的IC50值為0.99mg/mL，表明其具有抗肝癌及抗腸癌作用，其發(fā)揮藥效的成分可能為脂肪酸類成分。該研究為海星內(nèi)臟油作為天然抗腫瘤藥物的開發(fā)提供理論支撐。引言海星（Starfish,Asteriasamurensis）屬于棘皮動物門（Eehiondermata）海星綱（Asteroidea）海盤車屬（Asterias），是棘皮動物中傳統(tǒng)的藥用海洋生物。海星可分為內(nèi)臟和體壁兩部分。海星內(nèi)臟，俗稱海星黃，富含豐富的營養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、氨基酸不飽和脂肪酸脂溶性維生素、B族維生素、磷脂及必需微量元素等，在保健食品及醫(yī)藥研發(fā)等方面具有潛在的應(yīng)用價值。目前，國內(nèi)外對海星的研究主要集中在海星全體的化學(xué)成分及藥理活性方面，而海星內(nèi)臟作為其重要組成部分，針對其化學(xué)成分及抗腫瘤的研究報道較少。質(zhì)譜技術(shù)以其高靈敏度、高選擇性、高穩(wěn)定性及高通量的優(yōu)勢，成為復(fù)雜成分分析及定性研究強(qiáng)有力的工具。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)適用于分析熱不穩(wěn)定、不易衍生化、不易揮發(fā)和分子量大的極性化合物分析；氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)適用于低分子化合物和揮發(fā)性成分分析。兩種技術(shù)聯(lián)用有助于化學(xué)成分的全面解析。超臨界流體萃取具有低溫、快速、無溶劑殘留、適宜大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，在天然產(chǎn)物的提取中有獨(dú)特優(yōu)勢。故本文采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取海星內(nèi)臟油，采用UPLC-QTOF-MS及GC-MS兩種質(zhì)譜技術(shù)，對海星內(nèi)臟油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，并對其抗腫瘤活性進(jìn)行研究，以期為海星內(nèi)臟開發(fā)成新型功能性食品或新型抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

正文部分1

實驗部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實驗方法1.2.1

海星內(nèi)臟油的制備海星內(nèi)臟干燥品，粉碎，過篩（粒度20~40目），稱取100g粉末，放置于超臨界CO2萃取釜中萃取。萃取條件為萃取壓力30MPa、萃取溫度45

oC、泵流量9L/h、分離壓力5

MPa、分離溫度50

oC、萃取時間160

min。1.2.2

超高效液相色譜-質(zhì)譜條件供試品溶液的制備：精密吸取100μL海星內(nèi)臟油，加900μL甲醇，混勻，0.22μm微孔濾膜過濾，即得，用于液譜成分解析。1.2.3

氣相色譜-質(zhì)譜條件1.2.4

體外抗腫瘤活性檢測2

結(jié)果與討論2.1

基于UPLC-Q-TOF-MS的超臨界萃取海星內(nèi)臟油成分解析將海星內(nèi)臟油供試品溶液按1.2.2檢測條件進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析，得負(fù)離子模式下的基峰圖（BPC），見圖1。2.2

基于GC-MS的超臨界萃取海星內(nèi)臟油成分解析將海星內(nèi)臟油按1.2.3檢測條件進(jìn)行GC-MS分析，得到海星內(nèi)臟油中揮發(fā)性成分的總離子流圖（圖2）。2.3

超臨界萃取海星內(nèi)臟油體外抗腫瘤活性研究結(jié)果超臨界萃取海星內(nèi)臟油化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，其含有大量的脂肪酸類成分，且ω-3多不飽和脂肪酸含量豐富。研究表明，ω-3多不飽和脂肪酸多種抗腫瘤活性，包含抗結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等，因此推測超臨界萃取海星內(nèi)臟油具有抗腫瘤作用。本實驗選取兩種腫瘤細(xì)胞為研究對象，開展其體外抗腫瘤活性研究，結(jié)果如圖3所示。3

結(jié)論結(jié)論采用超臨界CO2萃取裝置對海星內(nèi)臟油進(jìn)行萃取，得到淡黃色海腥味油性液體。采用UPLC-Q-TOF-MS和GC-MS兩種質(zhì)譜技術(shù)，對超臨界萃取得到的海星內(nèi)臟油的化學(xué)成分組成進(jìn)行分析，UPLC-Q-TOF-MS共檢測出11種成分，GC-MS檢測出38種成分，大多數(shù)成分均為脂肪油類成分。本文創(chuàng)新性的開展了海星內(nèi)臟油的體外抗肝癌及抗結(jié)直腸癌活性研究，結(jié)果表明其具有明顯體外抗肝癌及結(jié)直腸癌作用，且呈現(xiàn)良好劑量-效應(yīng)關(guān)系，其抗腫瘤作用可能與海星內(nèi)臟油中EPA、DHA等多不飽和脂肪酸有關(guān)