氣相色譜-嗅辨儀質(zhì)譜聯(lián)用法對龍井茶中差異標(biāo)志物的高通量篩查

摘要龍井茶為中國十大名茶之首，其特征成分決定了其品質(zhì)差異。因此，研究龍井茶成分群并尋找差異標(biāo)志物對其質(zhì)控起著重要的作用。利用氣相色譜-嗅辯儀(GC-O)

和氣相色譜-質(zhì)譜

(GC-MS)

結(jié)合移動窗口偏最小二乘判別分析

(MWPLSDA)

方法，確定了可以區(qū)分不同產(chǎn)地和等級龍井茶的5種差異標(biāo)志物。通過比較不同色譜變量范圍獲得的偏最小二乘模式識別（PLSDA）結(jié)果，各差異標(biāo)志物的代表性排序為戊醛>(Z)-3-己烯-1-醇和3-烯烴>苯甲醇>2-乙基-1-己醇。此外，當(dāng)選擇戊醛對應(yīng)色譜變量區(qū)間時，可實現(xiàn)對六種龍井的100%區(qū)分。

前言綠茶具有多種功效，如抗氧化、抗衰老、抗癌]等。在中國眾多的綠茶品種中，龍井茶是其中最為著名的品種之一，含有獨(dú)特的風(fēng)味成分，如醇、醛、酮、酯、酸、酚和萜類等化合物。例如，茶多酚中的兒茶素是決定茶葉色、香、味的重要成分；茶氨酸是形成茶葉香氣和鮮爽度的重要成分，與龍井茶香氣形成的關(guān)系極為密切；曾報道過芳樟醇、（Z）-3-己烯基己酸酯和香葉醇為龍井茶中三大主要揮發(fā)性成分。茶葉的種類、產(chǎn)地和加工方法會對風(fēng)味成分產(chǎn)生重大影響，從而影響茶葉的品質(zhì)。因此，研究不同龍井茶的風(fēng)味成分并尋找相應(yīng)的特征識別標(biāo)志物對其品質(zhì)判斷具有非常重要的意義。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)

和氣相色譜-嗅辯儀(GC-O)是兩種最常用的分析技術(shù)，由于它們具有同時準(zhǔn)確測定未知多組分的顯著優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于鑒定多種食品的香氣成分。通過GC-MS手段結(jié)合有目標(biāo)檢測和無目標(biāo)檢測模型成功區(qū)分了不同種類的蜂蜜樣品。研究中，開發(fā)了一種簡化的樣品前處理方法，并將其應(yīng)用于氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜

(GC-MS/MS)分析中，能夠同時檢測綠茶、人參、銀杏葉、棕櫚、留蘭香和黑胡椒中227種農(nóng)殘樣品。另一方面，GC-O/GC-MS聯(lián)用方法可同時將感官品評全面、便捷的特點(diǎn)與質(zhì)譜準(zhǔn)確定量的優(yōu)勢相結(jié)合，更加快速、準(zhǔn)確的實現(xiàn)不同樣品間的真實性差異檢測。但是，使用GC-O和GC-MS確定分析物中的特征識別標(biāo)志物時，傳統(tǒng)分析方法需要對所有揮發(fā)性物質(zhì)的色譜信息進(jìn)行分析歸納，既費(fèi)時又復(fù)雜。因此，建立一種模式識別模型來實現(xiàn)對GC-O/GC-MS色譜有效信息簡單、快速、有效的提取，從而優(yōu)化該類色譜分析過程具有重要意義。作為經(jīng)典的化學(xué)模式識別方法，移動窗口偏最小二乘判別分析

(MWPLSDA)[15]模型被廣泛應(yīng)用于分析領(lǐng)域，例如熒光光譜分析，近紅外光譜分析等。該方法可以通過建立模式識別模型，有效地篩選數(shù)據(jù)變量，并只保留有用的特征信息變量參與分析，從而提供更好的識別結(jié)果。最重要的是，通過關(guān)注所選特征部分的變量，該模型可以更快速，更有效地提取和分析所有有用信息，大大簡化GC-MS等色譜方法數(shù)據(jù)分析過程，進(jìn)而提高其分析效率，節(jié)約分析成本。本研究借助GC-O/GC-MS結(jié)合MWPLSDA模型，建立了一種龍井茶模式識別模型及差異標(biāo)志物高通量篩查新方法。首先采用GC-O的芳香提取物稀釋分析

(AEDA)方法對高香氣貢獻(xiàn)度化合物對應(yīng)色譜變量區(qū)間進(jìn)行初步篩選，并根據(jù)保留時間重新組合所有有效色譜變量信息來進(jìn)行進(jìn)一步分析。其次，使用基于MWPLSDA殘差值建立的龍井茶模式識別模型，對所有色譜變量中化合物對應(yīng)有效色譜變量參數(shù)進(jìn)行分段考察，來比較所獲得6種不同龍井茶樣品的分類結(jié)果，最終篩選得到了共5種龍井茶差異標(biāo)志物，并對其進(jìn)行了代表性排序和定量分析。與傳統(tǒng)的GC-MS綠茶分類判別方法相比，本方法更加方便、快捷和有效，為基于差異標(biāo)志物分析的食品分類和快速鑒別提供了潛在的理論依據(jù)。

目錄1

實驗部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實驗方法1.2.1

龍井茶前處理稱取7.00g不同的龍井茶，并將其準(zhǔn)確地加入錐形瓶中，用100mL沸水沖泡后，立即置于80℃的水浴中震蕩10

min，然后在冰浴中放置5min，補(bǔ)重后過濾得到茶湯。1.2.2

氣相色譜-質(zhì)譜和氣相色譜-人工辨別分析氣相色譜的程序升溫模式：40℃保持6min，再以3℃/min的速度升到100℃，然后以5℃/min的速度從100℃升到230℃。實驗主要采用不分流進(jìn)樣模式：以20mL/min的線性流速的氦氣作為載氣，到質(zhì)譜系統(tǒng)和吸氣口的流量分配比為1:1。1.2.3

香精提取物稀釋分析將提取的香氣成分稀釋比設(shè)為1:4、1:16和1:64。記錄香氣特征和保留時間，直到評估員評估氣味結(jié)束時停止稀釋。每種香精化合物的最高稀釋倍數(shù)即為其風(fēng)味稀釋倍數(shù)

(FD)

。1.2.4

香氣成分鑒別通過與NIST05和Wiley質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及已發(fā)表論文的保留指數(shù)

(RI)

進(jìn)行比較來鑒定香氣成分，并參考先前對茶香氣成分的研究來評估香氣質(zhì)量。1.2.5

化學(xué)計量學(xué)方法所有色譜數(shù)據(jù)均由移動窗口偏最小二乘判別分析

(MWPLSDA)

程序處理，該程序使用Matlab2010a軟件編寫和執(zhí)行。2

結(jié)果與討論2.1

通過GC–O分析龍井茶香氣成分首先使用香氣提取物稀釋分析

(AEDA)

法對不同龍井茶中的香氣活性化合物進(jìn)行初步分析。當(dāng)FD為1時，通過GC-O分析（見表2）選擇23種香氣活性化合物，樣品1～6號（表2中f1～f6）依次包含13、12、13、8、8、10種香氣活性化合物。2.2

MWPLSDA模式識別分析對6種龍井茶的定性及其中差異標(biāo)志物的定量研究首先根據(jù)FD≥1時香氣能被感知的保留時間范圍篩選所有化合物對應(yīng)的色譜數(shù)據(jù)變量區(qū)間，將其重新組合為新的變量數(shù)陣（見圖1a）。然后，利用MWPLSDA模型有效地將虛擬代碼與初步篩選得到的龍井茶色譜變量數(shù)陣相關(guān)聯(lián)，建立模式識別分析模型。3

結(jié)論結(jié)論本文通過采用GC-O和GC-MS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)變量篩選模式識別模型的方法，成功實現(xiàn)了對6種不同龍井茶樣品的快速品控分析及其差異標(biāo)志物的篩查。首先，通過基于GC-O的化合物對應(yīng)色譜變量區(qū)間初步篩選，所有FD≥1時有效香氣成分對應(yīng)的保留時間范圍包含的色譜變量均被單獨(dú)截取出來，并按保留時間順序重新組合。其次，利用MWPLSDA模型對新的色譜變量數(shù)陣進(jìn)行分析處理，根據(jù)相應(yīng)的殘差值特征建立氣相色譜模式識別模型。之后，通過比較使用不同色譜變量區(qū)間對應(yīng)得到的龍井茶樣品分類識別率，成功確定了5種差異標(biāo)志物

(戊醛、(Z)-3-己烯-1-