食品生物技術(shù)導(dǎo)論第3章

第三章細(xì)胞工程與食品產(chǎn)業(yè)第一節(jié)概述第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1第一節(jié)概述1.細(xì)胞工程也叫細(xì)胞技術(shù)，是生物技術(shù)的主要內(nèi)容之一。細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程232.基礎(chǔ)知識(shí)細(xì)胞是細(xì)胞工程操作的主要對(duì)象，細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。生物界有兩大類(lèi)細(xì)胞：原核細(xì)胞和真核細(xì)胞細(xì)菌、放線(xiàn)菌等屬于原核細(xì)胞，細(xì)胞小，DNA裸露于細(xì)胞質(zhì)中，不與蛋白質(zhì)結(jié)合，胞內(nèi)無(wú)膜系構(gòu)造的細(xì)胞器，胞外由肽聚糖組成細(xì)胞壁。它是細(xì)胞融合的主要障礙；不過(guò)原核細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，無(wú)蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA易于進(jìn)行遺傳操作，因此它們又是細(xì)胞改造的良好材料。4酵母、動(dòng)植物等屬于真核細(xì)胞，體積較大，內(nèi)有細(xì)胞核和眾多膜系構(gòu)造細(xì)胞器。植物細(xì)胞外還有數(shù)層以纖維素為主要成分的細(xì)胞壁。真核細(xì)胞一般都有明顯細(xì)胞周期，處于有絲分裂時(shí)期的染色體呈現(xiàn)高度螺旋緊縮狀態(tài)，既不利于基因外釣，也不利于外源基因的插入。因此采取一定的措施誘導(dǎo)真核細(xì)胞同步化生長(zhǎng)，對(duì)于成功的進(jìn)行細(xì)胞融合及細(xì)胞代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)具有十分重要的作用。5細(xì)胞分化和細(xì)胞全能性細(xì)胞分化：個(gè)體細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，后代細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生差異的過(guò)程。在對(duì)多細(xì)胞生物中，大多以結(jié)合成組織或器官的形式存在，因而細(xì)胞的形狀一般與其存在的部位和行使的功能有關(guān)。在單細(xì)胞生物中，雖然沒(méi)有像多細(xì)胞那種典型的細(xì)胞分化過(guò)程，但是在其生活周期中細(xì)胞也表現(xiàn)出有規(guī)律的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能上的階段變化，這種變化也有細(xì)胞分化的性質(zhì)。6一般來(lái)說(shuō)，體內(nèi)各種細(xì)胞均含有物種的全部基因。但是在細(xì)胞中只有一少部分基因在活動(dòng)。這些表達(dá)的基因可分為兩類(lèi)：一是維持細(xì)胞生存所必需，稱(chēng)為持家基因；另一類(lèi)是在各種細(xì)胞中專(zhuān)一選擇表達(dá)的，稱(chēng)為組織專(zhuān)一基因，其表達(dá)合成了組織專(zhuān)一的蛋白產(chǎn)物。在具有全能性的胚胎細(xì)胞和多功能干細(xì)胞水平上，細(xì)胞間沒(méi)有表現(xiàn)出形態(tài)上的差異?？墒沁@些細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次分裂，所產(chǎn)生的子細(xì)胞卻限定向一定方向發(fā)育。7細(xì)胞分化能力的強(qiáng)弱稱(chēng)為發(fā)育潛能，細(xì)胞具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能稱(chēng)為細(xì)胞全能性。但是隨著胚胎的發(fā)育，有的體細(xì)胞雖然具有分化出多種組織的潛能，但是失去了發(fā)育成完整個(gè)體的潛能，細(xì)胞具有的這種發(fā)育潛能叫多能性，也就是說(shuō)，在發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的發(fā)育潛能逐漸變窄。8通常情況下，分化細(xì)胞的表型要保持穩(wěn)定，以執(zhí)行特定的功能。然而在某些條件下，分化細(xì)胞也不穩(wěn)定，其基因活動(dòng)模式會(huì)發(fā)生可逆的變化，又回到未分化的狀態(tài)，這一過(guò)程稱(chēng)為去分化。例如如，在培養(yǎng)條件下的植物愈傷組織，它具有全能性，可再生出完整的植株。9在發(fā)育潛能上植物細(xì)胞不同于動(dòng)物細(xì)胞。高度分化的植物營(yíng)養(yǎng)組織仍保持著發(fā)育成為完整植株的能力，也就是具有全能性。高等動(dòng)物在發(fā)育過(guò)程中，產(chǎn)生了體細(xì)胞與生殖細(xì)胞兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞系。動(dòng)物細(xì)胞的分化潛能隨分化程度的提高而逐漸變窄。而對(duì)于細(xì)胞核而言，高度分化的細(xì)胞仍保留著物種的全套基因。10動(dòng)物細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)表明，不僅分化的胚胎細(xì)胞的核具有指導(dǎo)卵質(zhì)雜交體發(fā)育為成熟個(gè)體的全能性，而且高度分化的體細(xì)胞的核也具有全能性。也就是說(shuō)，分化細(xì)胞中不表達(dá)的基因仍然存在，保持著重新啟動(dòng)表達(dá)的潛能，體細(xì)胞克隆技術(shù)充分證明了這一點(diǎn)。細(xì)胞的這種發(fā)育的全能性或潛能癥是細(xì)胞工程中細(xì)胞與組織培養(yǎng)、克隆等技術(shù)的理論基礎(chǔ)。111.2細(xì)胞工程的基本操作無(wú)菌操作技術(shù)細(xì)胞工程的所有實(shí)驗(yàn)都要求在無(wú)菌的條件下進(jìn)行，稍有疏忽都可能導(dǎo)致試驗(yàn)的失敗。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行，無(wú)菌室應(yīng)定期用紫外線(xiàn)或化學(xué)試劑消毒，實(shí)驗(yàn)前后也應(yīng)消毒。無(wú)菌室外應(yīng)有緩沖室，實(shí)驗(yàn)人員在此換鞋、更衣、帶帽，做好準(zhǔn)備后進(jìn)入無(wú)菌室。12超凈工作臺(tái)是基本實(shí)驗(yàn)設(shè)備，所有的操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。其次對(duì)生物材料進(jìn)行徹底的消毒和除菌是實(shí)驗(yàn)成功的前提，實(shí)驗(yàn)所用一切器械、器皿和藥品都應(yīng)進(jìn)行滅菌，實(shí)驗(yàn)者雙手應(yīng)戴無(wú)菌手套。13細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)是指動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞在體外無(wú)菌條件下的保存和生長(zhǎng)。雖然這些細(xì)胞培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)要求等方面有很多差異，但它們也有共同之處：首先，要取材和除菌；其次，根據(jù)各類(lèi)細(xì)胞的特點(diǎn)，配制細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌或除菌；最后將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，提供各種細(xì)胞生長(zhǎng)所需的最佳培養(yǎng)條件。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定生物量時(shí)及時(shí)收獲或傳代。14細(xì)胞融合技術(shù)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞互相接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞融合。細(xì)胞融合是細(xì)胞工程的重要基本技術(shù)，其主要過(guò)程包括：①制備原生質(zhì)體，有細(xì)胞壁的細(xì)胞需用酶或其他方法去壁；②誘導(dǎo)細(xì)胞融合；③篩選雜合細(xì)胞，一般用選擇性培養(yǎng)基篩選。152.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)象不同，細(xì)胞培養(yǎng)可以分為微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。相對(duì)于微生物細(xì)胞而言，動(dòng)植物細(xì)胞要“嬌貴”得多，因此動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)要求更高，操作復(fù)雜而精細(xì)，是細(xì)胞培養(yǎng)研究的重點(diǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)常被泛稱(chēng)為組織培養(yǎng)，它實(shí)際上包括了三個(gè)不同層次的培養(yǎng)技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。16細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)起源于組織培養(yǎng)技術(shù)，而組織培養(yǎng)技術(shù)是從胚胎學(xué)技術(shù)開(kāi)始的。細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵首先是解決細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題，也就是說(shuō)要設(shè)計(jì)和研制出適合細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)液，通常稱(chēng)之為培養(yǎng)基。172.1微生物細(xì)胞的培養(yǎng)2.1.1培養(yǎng)基的組成一般培養(yǎng)基包括以下組分：碳源。常用的是糖類(lèi)物質(zhì)氮源。氮源無(wú)機(jī)氮源有機(jī)氮源氨氣銨鹽硝酸鹽蛋白質(zhì)氨基酸尿素18無(wú)機(jī)鹽。無(wú)機(jī)鹽是微生物生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)，其主要功能有：構(gòu)成菌體組成作為酶活性基團(tuán)的組成調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)的pH值等維生素。維生素是生物體生長(zhǎng)不可缺少的一種或數(shù)種極微量的有機(jī)物質(zhì)192.1.2培養(yǎng)基的種類(lèi)按成分不同分為：天然培養(yǎng)基：有機(jī)化學(xué)成分不清楚或不恒定的培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基：由化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基，如高氏和察氏培養(yǎng)基20根據(jù)物理狀態(tài)劃分：固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑，使其成為固體狀態(tài)。常用凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠該培養(yǎng)基常用來(lái)進(jìn)行微生物的分離、鑒定、計(jì)數(shù)、保藏等半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入比固體培養(yǎng)基中少的凝固劑形成。該培養(yǎng)基常用來(lái)觀(guān)察微生物的運(yùn)動(dòng)特性、分類(lèi)鑒定及噬菌體效價(jià)滴定等液體培養(yǎng)基：不加凝固劑。常用于工業(yè)生產(chǎn)中和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的理論研究和應(yīng)用研究21按用途劃分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。加富培養(yǎng)基：也稱(chēng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制成的一類(lèi)營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。用來(lái)富集和分離微生物鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入特殊化學(xué)物質(zhì)，可與微生物的代謝產(chǎn)物發(fā)生特征性變化，根據(jù)這些變化鑒別微生物。用于分類(lèi)鑒定、分離和篩選菌種選擇培養(yǎng)基：用來(lái)將不同的微生物或某類(lèi)微生物從群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基。22其它培養(yǎng)基：分析培養(yǎng)基：分析某些化學(xué)物質(zhì)的濃度和微生物的營(yíng)養(yǎng)需求等還原性培養(yǎng)基：專(zhuān)門(mén)用來(lái)培養(yǎng)厭氧性微生物組織培養(yǎng)物培養(yǎng)基：含有動(dòng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)基，用來(lái)培養(yǎng)病毒、衣原體、立克次氏體及某些螺旋體等專(zhuān)性活細(xì)胞寄生的微生物232.1.3培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基表面上培養(yǎng)，多用于菌種分離、純化、保藏和種子制備。表面培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)便，設(shè)備簡(jiǎn)單，但存在缺點(diǎn)：不適用于大規(guī)模生產(chǎn)不便于對(duì)體系進(jìn)行監(jiān)測(cè)控制不宜于保持體系中環(huán)境條件的均一單菌落懸浮液瓊脂培養(yǎng)基稀釋保溫培養(yǎng)24在工業(yè)生產(chǎn)中，固體培養(yǎng)常用來(lái)制曲和進(jìn)行食用菌菌絲的培養(yǎng)制曲的一般步驟是：將接種的固體基質(zhì)薄薄的攤鋪在容器表面，在一定溫度下通風(fēng)培養(yǎng)。這樣就可以使微生物獲得充分的氧氣，又可以讓微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中釋放熱量。食用菌培養(yǎng)一般用棉籽殼、花生殼等固體基質(zhì)進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)252.液體培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，微生物處于懸浮狀態(tài)，空氣通過(guò)氣液界面?zhèn)髻|(zhì)進(jìn)入液相，再擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)部。采用液體培養(yǎng)可以得到混合均勻的菌體懸浮液，便于檢測(cè)控制，容易放大到工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模在培養(yǎng)過(guò)程中，微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中有四個(gè)階段：延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰亡期263.連續(xù)培養(yǎng)就是將培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度和培養(yǎng)條件維持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不變，則可以保證細(xì)胞高速增長(zhǎng)或產(chǎn)物高速形成。根據(jù)控制方式不同，連續(xù)培養(yǎng)可以分為恒濁培養(yǎng)和恒化培養(yǎng)。恒濁培養(yǎng)是根據(jù)體系內(nèi)微生物的生長(zhǎng)密度，通過(guò)自控儀表調(diào)節(jié)料液的流量，來(lái)氏菌體濃度和生長(zhǎng)速度恒定的培養(yǎng)方式恒化培養(yǎng)是保持培養(yǎng)液的流速不變，使罐內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本恒定，并使微生物在始終低于其最高生長(zhǎng)速度的條件下繁殖2728培養(yǎng)方法控制對(duì)象生長(zhǎng)限制因子培養(yǎng)液流速生長(zhǎng)速度產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒化培養(yǎng)培養(yǎng)液流速有恒定低于最高生長(zhǎng)速度不同生長(zhǎng)速度的菌體實(shí)驗(yàn)室為主恒濁培養(yǎng)菌液密度無(wú)不恒定最高生長(zhǎng)速度大量菌體和代謝產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化培養(yǎng)和恒濁培養(yǎng)的比較29連續(xù)培養(yǎng)面臨的問(wèn)題單個(gè)罐染菌的話(huà)，所有的罐都要停止運(yùn)作，滅菌后再啟動(dòng)連續(xù)培養(yǎng)的收率和產(chǎn)物濃度相對(duì)于分批培養(yǎng)要低，不利于下游提取連續(xù)培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率低，增加了生產(chǎn)成本連續(xù)培養(yǎng)必須與其它工序連貫進(jìn)行，對(duì)設(shè)備要求高連續(xù)培養(yǎng)更易受菌種退化的影響304.中間補(bǔ)料培養(yǎng)又稱(chēng)為半連續(xù)培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)等，它是根據(jù)菌株生長(zhǎng)和初始培養(yǎng)基的特點(diǎn)，在分批培養(yǎng)的某些階段適當(dāng)添加培養(yǎng)基，使菌體和代謝產(chǎn)物生產(chǎn)時(shí)間延長(zhǎng)。優(yōu)點(diǎn)：可以消除底物抑制可以達(dá)到高密度培養(yǎng)延長(zhǎng)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間稀釋有毒代謝產(chǎn)物降低染菌和避免遺傳不穩(wěn)定性315.同步培養(yǎng)在分批或連續(xù)培養(yǎng)中，培養(yǎng)中的細(xì)胞并不一定都處于同一生長(zhǎng)階段。，通常微生物的生理生化測(cè)定是取群體的平均值，因而并不合理。細(xì)胞的同步培養(yǎng)技術(shù)，使培養(yǎng)中的細(xì)胞同時(shí)分裂。同步化方法有兩種：選擇法：根據(jù)處于不同階段的細(xì)胞的性質(zhì)差異，將其分離出來(lái)培養(yǎng)誘導(dǎo)法：控制環(huán)境條件，使細(xì)胞生長(zhǎng)處于相同階段，從而達(dá)到同步培養(yǎng)326.混合培養(yǎng)混合培養(yǎng)互不相干競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系互生關(guān)系333.2微生物原生質(zhì)體的制備和融合3.2.1原核細(xì)胞的原生質(zhì)體融合細(xì)菌是最典型的原核生物，細(xì)菌細(xì)胞外有一層成分不同、結(jié)構(gòu)相異的堅(jiān)韌細(xì)胞壁。根據(jù)細(xì)胞壁的差異一般將細(xì)菌分為格蘭氏陽(yáng)性菌和格蘭氏陰性菌，前者肽聚糖占細(xì)胞壁成分的90％，后者的細(xì)胞壁上除了部分肽聚糖外還有大量的脂多糖等有機(jī)大分子，由此決定了它們對(duì)溶菌酶的敏感性差異很大，去壁方法也不相同。34溶菌酶廣泛存在于動(dòng)植物、微生物細(xì)胞及其分泌物中，它能特異性的切開(kāi)肽聚糖中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，從而使格蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁溶解。但由于格蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁差異，處理其細(xì)胞壁時(shí)，除溶菌酶外還要添加少量EDTA（乙二胺四乙酸），才能去除細(xì)胞壁，制的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。353.2.2原生質(zhì)體融合和再生融合就是把兩親本的原生質(zhì)體混合在一起，通常采用PEG融合和電融合。融合過(guò)程：原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B混合離心高滲穩(wěn)定液40％PEG水浴保溫涂布沉渣稀釋高滲再生平板細(xì)胞分散保溫培養(yǎng)檢查3637PEG能促進(jìn)細(xì)胞融合的原因是，它是一種具有很強(qiáng)吸水性的大分子物質(zhì)，能使細(xì)胞膜表面的水分和電荷發(fā)生變化，從而使細(xì)胞發(fā)生凝集，細(xì)胞膜緊密接觸，導(dǎo)致膜分子發(fā)生交換、重排，最后細(xì)胞膜融合，細(xì)胞便合二為一。3839電融合法就是將細(xì)胞放在正負(fù)電極之間，施加很高的電壓，由于細(xì)胞表面帶有很多電荷，在高壓下，細(xì)胞靠近正極的一端負(fù)電荷聚集，而靠近負(fù)極的一端正電荷聚集，這樣異性相吸，細(xì)胞就會(huì)像糖葫蘆一樣串在一起，相鄰的細(xì)胞膜緊密接觸，這時(shí)再施加一個(gè)強(qiáng)大的脈沖電流，細(xì)胞膜有可能因此受損而產(chǎn)生小孔，由于膜分子的運(yùn)動(dòng)，在小孔處的兩層細(xì)胞就會(huì)混合在一起，導(dǎo)致細(xì)胞融合。電融合技術(shù)的融合效率比PEG法高，而且對(duì)細(xì)胞毒性小，易于操作。40413.2.3真菌的原生質(zhì)體融合真菌主要有單細(xì)胞的酵母和多細(xì)胞菌絲真菌類(lèi)，同樣的降解它們的細(xì)胞壁、制備原生質(zhì)體是細(xì)胞融合的關(guān)鍵。真菌的細(xì)胞壁成分比較復(fù)雜，主要由幾丁質(zhì)及各類(lèi)葡聚糖構(gòu)成纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中雜夾著少量的甘露糖、蛋白質(zhì)和脂類(lèi)。因此一般在含有滲透壓穩(wěn)定劑的反應(yīng)介質(zhì)中加入消解酶或蝸牛酶處理。真菌原生質(zhì)體融合與前述細(xì)胞類(lèi)似。423.4.1微生物融合子的篩選融合重組子（融合子）：原生質(zhì)體融合后，來(lái)自?xún)捎H本的遺傳物質(zhì)通過(guò)發(fā)生交換并發(fā)生重組而形成的子代。一般通過(guò)兩親本的遺傳標(biāo)記的互補(bǔ)而得以識(shí)別，有直接法和間接法。常用直接法：選擇標(biāo)記篩選方法營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)型高滲再生培養(yǎng)基抗藥性含藥物的平板培養(yǎng)基形態(tài)特征或色素方法色素、形態(tài)特征43間接法：把融合液涂布在高滲再生完全培養(yǎng)基上，使親本細(xì)胞和融合子都形成菌落，然后用影印法將它們復(fù)制到選擇培養(yǎng)基上檢出融合子。以上獲得的僅是融合子，還需要對(duì)它們進(jìn)行生理生化測(cè)定及生產(chǎn)性能的測(cè)定，確定是否為符合育種要求的優(yōu)良菌種。442.2植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)2.2.1植物組織培養(yǎng)定義與基本原理：植物組織培養(yǎng)是在無(wú)菌和人為控制外因（營(yíng)養(yǎng)成分、光、溫度、濕度）條件下，培養(yǎng)、研究植物組織器官，甚至進(jìn)而從中分化、發(fā)育出整體植株的技術(shù)。45幾個(gè)重要概念：①愈傷組織：愈傷組織是由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞。愈傷組織是分化的，但還沒(méi)有形成組織上的結(jié)構(gòu)，因此愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有明顯的組織或器官上的分化。愈傷組織可以用繼代培養(yǎng)的方式長(zhǎng)期保存，也可以通過(guò)懸浮培養(yǎng)而迅速增殖，用作無(wú)性系；也可以用作原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)原生質(zhì)體的來(lái)源。46②外植體：外植體是指植物組織培養(yǎng)中用來(lái)進(jìn)行離體無(wú)菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。③繼代培養(yǎng)：是指愈傷組織在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，并已經(jīng)積累一些代謝產(chǎn)物，此時(shí)需要將這些組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這種轉(zhuǎn)移稱(chēng)為繼代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)。47植物組織培養(yǎng)的歷史20世紀(jì)初，德國(guó)生物學(xué)家Haberlandt曾預(yù)言“植物細(xì)胞具全能性“。不久，Hanning成功的在他的培養(yǎng)基上培育出能正常發(fā)育的蘿卜和辣根菜的胚，成為植物組織培養(yǎng)的鼻祖。1943年，美國(guó)人White以番茄根為材料，建立了第一個(gè)能無(wú)限生長(zhǎng)的植物組織。481956年，Miller發(fā)現(xiàn)了激動(dòng)素，并指出激動(dòng)素能強(qiáng)有力地誘導(dǎo)組織培養(yǎng)中的愈傷組織分化出幼芽。1958年，Steward從胡蘿卜的細(xì)胞培養(yǎng)中分化長(zhǎng)出了胚狀體乃至整個(gè)植株。從此以后，通過(guò)組織培養(yǎng)方法培育完整植株的探索便在世界范圍內(nèi)蓬勃開(kāi)展。49植物組織培養(yǎng)的階段1.預(yù)備階段：①選擇合適的外植體是本階段的首要問(wèn)題。選擇外植株，要綜合考慮以下幾個(gè)因素：大小要適宜，不宜太小，外植體的組織塊要達(dá)到2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞以上才容易成活。同一植物不同部位的外植體，其細(xì)胞的分化能力、分化條件及分化類(lèi)型有相當(dāng)大的差別。植物胚與幼齡組織器官比老化組織、器官更容易去分化，產(chǎn)生大量愈傷組織。50不同物種相同部位的外植體其細(xì)胞分化能力可能大不一樣?？傊庵搀w的選擇，一般以幼嫩的組織或器官為宜。此外，外植體的去分化及再分化的最適條件都需經(jīng)過(guò)摸索。51②除去病原菌及雜菌：選擇外觀(guān)健康的外植體，經(jīng)可能除凈外植體表面的各種微生物是成功進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的前提。消毒劑的選擇和處理時(shí)間的長(zhǎng)短與外植體對(duì)所用試劑的敏感性密切相關(guān)，通常幼嫩材料處理時(shí)間比成熟材料可短些。對(duì)外植體除菌的一般程序如下：外植體→自來(lái)水多次漂洗→無(wú)菌水反復(fù)沖洗→無(wú)菌濾紙吸干52常用消毒劑除菌效果比較消毒劑使用濃度處理時(shí)間（min）除菌效果去除難易氯化汞0.1-1％2-10最好較難次氯酸鈉2％5-30很好容易次氯酸鈣9-10％5-30很好容易溴水1-252-10很好容易過(guò)氧化氫10-12%5-15好最易硝酸銀1%5-30好較難抗生素20-50mg/L30-60較好一般53③配制適宜的培養(yǎng)基:由于物種的不同,外植體的差異,組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基多種多樣,但它們通常都包括以下三大類(lèi)組份:含量豐富的基本成分,包括蔗糖或葡萄糖、以及氮、磷、鉀、鎂等；微量無(wú)機(jī)物，如鐵、錳、硼酸等；微量有機(jī)物，如激動(dòng)素、吲哚乙酸、肌醇等；各培養(yǎng)基中，激動(dòng)素和吲哚乙酸的變化幅度很大，主要因培養(yǎng)目的而異。一般較高的生長(zhǎng)素（吲哚乙酸）與細(xì)胞分裂素（激動(dòng)素）的比值有利于誘導(dǎo)外植株產(chǎn)生愈傷組織，反之則促進(jìn)胚芽和胚根的分化542.誘導(dǎo)去分化階段組織培養(yǎng)的第一步就是讓外植體去分化，使各細(xì)胞重新處于旺盛有絲分裂的分生狀態(tài)，因此培養(yǎng)基中一般應(yīng)添加較高濃度的生長(zhǎng)類(lèi)激素?？梢圆捎霉腆w培養(yǎng)基（添加瓊脂0.6-1.0％），這種方法簡(jiǎn)便易行，可多層培養(yǎng)，占地面積小。55外植體表面除菌后，切成小片段插入或貼放培養(yǎng)基即可。但外植體的營(yíng)養(yǎng)吸收不均、氣體及有害物質(zhì)排換不暢，愈傷組織易出現(xiàn)極化現(xiàn)象是本方法的主要缺點(diǎn)。如把外植體浸沒(méi)于液體培養(yǎng)基中，營(yíng)養(yǎng)吸收及物質(zhì)交換便捷，但須提供振蕩器等設(shè)備，投資較大，且一旦染菌難以挽回。本階段為植物細(xì)胞依賴(lài)培養(yǎng)基中的有機(jī)物等進(jìn)行的異養(yǎng)生長(zhǎng)，原則上無(wú)需光照。563.繼代增殖階段愈傷組織長(zhǎng)出后經(jīng)過(guò)4-6周的迅速細(xì)胞分裂，原有培養(yǎng)基中的水分及營(yíng)養(yǎng)成分多已耗盡，細(xì)胞的有害代謝產(chǎn)物已在培養(yǎng)基中積累，因此必須進(jìn)行移植，即繼代增殖。同時(shí)通過(guò)移植，愈傷組織的細(xì)胞數(shù)能大大擴(kuò)增，有利于下一階段收獲更多的胚狀體或小苗。574.生根成芽階段愈傷組織只有經(jīng)過(guò)重新分化才能形成胚狀體，繼而長(zhǎng)成小植株。所謂的胚狀體是指在組織培養(yǎng)中分化產(chǎn)生的具有芽端和根端類(lèi)似合子胚的構(gòu)造。通常要將愈傷組織移置于合適量細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的分化培養(yǎng)基中，才能誘導(dǎo)胚狀體的形成。光照是在本階段的必備外因。585.移栽成活階段生長(zhǎng)于人工照明玻璃瓶中的小苗，要適時(shí)移栽到室外以利于生長(zhǎng)。此時(shí)的小苗還十分幼嫩，移植時(shí)應(yīng)在能保證適度的光、溫、濕的條件下進(jìn)行。在人工氣候室中鍛煉一段時(shí)間能大大提高幼苗的成活率。592.2.2植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用1.無(wú)性系快速繁殖技術(shù)：采用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖植物是組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)成效最大的實(shí)例。組織培養(yǎng)與傳統(tǒng)的無(wú)性繁殖相比，不受季節(jié)限制，具有用材少、速度快等優(yōu)點(diǎn)，尤其對(duì)一些繁殖系數(shù)低、不能利用種子繁殖的名、優(yōu)、特植物品種的繁殖意義重大。此外雖然一些經(jīng)濟(jì)作物可以用種子繁殖，但它們的后代會(huì)出現(xiàn)各種變異，不能保持原來(lái)品種的特性，因此需要采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行無(wú)性繁殖。602.獲得無(wú)病毒植株：很多農(nóng)作物都帶有病毒，尤其是無(wú)性繁殖植物，如馬鈴薯、甘草、草莓、大蒜等。一些用無(wú)性繁殖方法來(lái)繁衍的花卉，如康乃馨、菊花、郁金香、水仙等，不能通過(guò)種子途徑去除病毒。對(duì)于花卉而言會(huì)影響其觀(guān)賞效果，對(duì)于經(jīng)濟(jì)作物也會(huì)影響其產(chǎn)量。如病毒常使馬鈴薯減產(chǎn)50％左右；蘋(píng)果被病毒感染后一般要減產(chǎn)14-45％，而且品質(zhì)惡化、口感變差、不宜儲(chǔ)藏。61但是病毒并不是會(huì)感染植物的每一個(gè)部位，懷特早在1943年就發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)點(diǎn)附近的病毒濃度很低甚至無(wú)病毒，所以莖尖培養(yǎng)成為獲得無(wú)病毒植株的重要途徑?？梢匀∫欢ù笮〉那o尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，再生的植株可能會(huì)不帶病毒，從而獲得脫病毒植株，再用它進(jìn)行繁殖，種植的作物就不會(huì)或很少發(fā)生病毒病害。623.新品種選育：與傳統(tǒng)育種相比，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行新品種選育具有效率高、周期短、純度高等優(yōu)點(diǎn)。采用其他相關(guān)的技術(shù)，包括誘發(fā)突變、遠(yuǎn)源雜交、單倍體育種，以及細(xì)胞融合、基因轉(zhuǎn)移等，特別是通過(guò)花藥培養(yǎng)進(jìn)行單倍體育種已成為一種重要的手段，并在生產(chǎn)上獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。634.在遺傳、生理生化和病理等研究上的應(yīng)用組織培養(yǎng)由于能快速、大量的獲得性狀一致的實(shí)驗(yàn)材料，從而大大推動(dòng)了植物遺傳、生理生化和病理等領(lǐng)域的研究過(guò)程。如植物組織培養(yǎng)有助于了解植物營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題、進(jìn)行光合作用理論研究、研究植物的抗病性、觀(guān)察染色體的變異等。通過(guò)組織培養(yǎng)，可縮短育種年限和世代，也有利于基因突變中隱性突變的分離。645.種質(zhì)資源的保存農(nóng)業(yè)是在現(xiàn)有種子資源的基礎(chǔ)之上的，由于自然災(zāi)害、生物競(jìng)爭(zhēng)、人類(lèi)活動(dòng)等影響，已有相當(dāng)多的植物物種在自然界消失或正在消失。具有獨(dú)特遺傳性狀的生物物種的滅絕是一種不可挽回的損失。目前，很多無(wú)性繁殖的植物因沒(méi)有種子供長(zhǎng)期保存，其種質(zhì)資源傳統(tǒng)上只能在田間種植保存，耗費(fèi)人力物力，且資源易受人為因素和環(huán)境的影響而丟失。65利用植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞低溫保存等方法保存種子，可大大節(jié)省物力、人力，大大延長(zhǎng)保存期。同時(shí)也便于種子資源的交換和轉(zhuǎn)移，防止病害。如：胡蘿卜和煙草等植物細(xì)胞培養(yǎng)懸浮物可在-20℃～-196℃的低溫保存數(shù)月后恢復(fù)生長(zhǎng)，再生成為植株。662.2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)2.2.2.1培養(yǎng)基組成及種類(lèi)植物細(xì)胞培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，將立體的單個(gè)游離細(xì)胞在人工控制的環(huán)境里培養(yǎng)，以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他生物產(chǎn)品的一種技術(shù)。植物細(xì)胞體系建立程序：整體植株組織或器官外植體愈傷組織繼代培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)67植物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成無(wú)機(jī)鹽類(lèi)：主要有N、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等。對(duì)于不同的培養(yǎng)對(duì)象和形式，無(wú)機(jī)鹽的最佳濃度是不同的。碳源：主要是糖類(lèi)，葡萄糖和蔗糖最為常用。果糖效果比這二者差。通常增加培養(yǎng)基中蔗糖的含量，可以增加培養(yǎng)細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物量。68植物生長(zhǎng)激素：分為兩類(lèi)，生長(zhǎng)素和分裂素。生長(zhǎng)素促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，最常用的有吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸和萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物，使用最多的是6-芐基嘌呤（BA）、6-糠氨基嘌呤和玉米素。分裂素和生長(zhǎng)素通常一起使用，來(lái)促使細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)，使用量根據(jù)不同細(xì)胞株而異。69有機(jī)氮源：蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺、氨基酸混合物等。有機(jī)氮源對(duì)細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)的早期生長(zhǎng)階段有利，L-谷氨酰胺可代替或補(bǔ)充某種蛋白質(zhì)水解物。有機(jī)酸：加入丙酮酸或者三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物如檸檬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸等，能夠保證植物細(xì)胞在以銨鹽為單一氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。加入三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物同樣能提高低密度接種的細(xì)胞和原生質(zhì)體的生長(zhǎng)。70復(fù)合物質(zhì)：復(fù)合物質(zhì)通常作為細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，包括酵母抽提液、麥芽抽提液、椰子汁和水果汁等，現(xiàn)在這些制劑通常已被成分已知的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所替代。但許多例子表明，一些抽提液對(duì)細(xì)胞有毒性。目前仍在廣泛使用的是椰子汁。712.2.2植物細(xì)胞培養(yǎng)方法植物細(xì)胞培養(yǎng)有多種方法：有單細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)；有固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)又分為搖瓶懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模懸浮培養(yǎng)等懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是應(yīng)用最多的一種方法，它是把離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的無(wú)菌培養(yǎng)。良好的懸浮體系要滿(mǎn)足：懸浮培養(yǎng)物分散性好均一性好生長(zhǎng)迅速7273建立良好的懸浮體系要注意的事項(xiàng)：選擇合適的外植體挑選顆粒細(xì)小、疏松易碎、生長(zhǎng)快的愈傷組織進(jìn)行初始培養(yǎng)選擇合適的培養(yǎng)基和及時(shí)更換新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng)液滅菌時(shí)注意選用合適的方法懸浮培養(yǎng)取疏松易碎的愈傷組織在搖瓶中于黑暗或弱光處培養(yǎng)懸浮細(xì)胞的繼代與選擇保留小細(xì)胞團(tuán)，直至得到均一的懸浮系742.2.2.1植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法分批培養(yǎng)法在新鮮培養(yǎng)基中加入少量的細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程既不從培養(yǎng)系統(tǒng)中放出培養(yǎng)液，也不從外界向培養(yǎng)系統(tǒng)中補(bǔ)加培養(yǎng)基的一種方法特征：培養(yǎng)基基質(zhì)濃度隨培養(yǎng)時(shí)間下降，細(xì)胞濃度和產(chǎn)物隨培養(yǎng)時(shí)間增加75半連續(xù)培養(yǎng)法在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法反應(yīng)過(guò)程以一定時(shí)間間隔進(jìn)行反復(fù)操作，此法可不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，減少接種次數(shù)。連續(xù)培養(yǎng)法在培養(yǎng)過(guò)程中，不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補(bǔ)充和保持其恒定體積的培養(yǎng)方法特點(diǎn)：1.能充分供應(yīng)養(yǎng)分，不會(huì)出現(xiàn)懸浮培養(yǎng)物發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良的現(xiàn)象2.可使細(xì)胞長(zhǎng)久的保持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增殖速率快3.適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)76連續(xù)培養(yǎng)的種類(lèi)封閉式連續(xù)培養(yǎng)：新鮮培養(yǎng)液和老培養(yǎng)液等量進(jìn)出，并把排出的細(xì)胞收集，放入培養(yǎng)系統(tǒng)中繼續(xù)培養(yǎng)開(kāi)放式連續(xù)培養(yǎng)：新鮮培養(yǎng)液的注入速度等與細(xì)胞懸浮液的排出速度，細(xì)胞也隨懸浮液一起排出。細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定時(shí)，流出細(xì)胞數(shù)等于新增細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞密度恒定。①濁度恒定法，根據(jù)懸浮液渾濁度提高來(lái)注入新鮮培養(yǎng)液的開(kāi)放式連續(xù)操作②化學(xué)恒定法，通過(guò)限制營(yíng)養(yǎng)物的濃度來(lái)控制細(xì)胞的增殖速率772.2.2.2植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)固定化細(xì)胞培養(yǎng)：即把細(xì)胞固定在一種惰性基質(zhì)，如瓊脂、藻酸鹽、聚丙烯酰胺、纖維或膜上面或里面，，細(xì)胞不能運(yùn)動(dòng)，而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可在細(xì)胞間流動(dòng)，供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)，其特點(diǎn)：可以消除或極大的減弱流質(zhì)流動(dòng)引起的切應(yīng)力固定化細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢導(dǎo)致次生代謝物產(chǎn)量高細(xì)胞所處的物理和化學(xué)環(huán)境與懸浮培養(yǎng)時(shí)不同便于操作便于次生代謝物的收集78常見(jiàn)的細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)平床培養(yǎng)系統(tǒng)本系統(tǒng)由培養(yǎng)床、貯液罐和蠕動(dòng)泵等組成它能比懸浮培養(yǎng)體系更有效的合成次生物質(zhì)79立柱培養(yǎng)系統(tǒng)褐藻酸鈣固定植物細(xì)胞的技術(shù)路線(xiàn)為提高次生物質(zhì)產(chǎn)量，應(yīng)注意：選用高產(chǎn)細(xì)胞株系在營(yíng)養(yǎng)液中加入目的產(chǎn)物的直接或僅直接前提物理，對(duì)增產(chǎn)目的產(chǎn)物有效對(duì)各類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)都應(yīng)在摸索后找出最佳方案適當(dāng)光照及通氣在多數(shù)情況下有利于產(chǎn)物形成802.2.2.3植物細(xì)胞原生質(zhì)體制備與融合81歷史上很早就有人提出過(guò)，在不同物種間進(jìn)行雜交，一起獲得雙方優(yōu)良性狀的雜種生物的美好愿望。然而常規(guī)的雜交育種由于物種間難以逾越的天然屏障而舉步維艱，科學(xué)家們受細(xì)胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功的啟示，將目光逐漸轉(zhuǎn)向了細(xì)胞融合。1937年，Michel首先實(shí)施植物細(xì)胞融合試驗(yàn)，如何去除堅(jiān)韌的細(xì)胞壁成了首要的難題。821960年，英國(guó)諾丁漢大學(xué)Cocking教授領(lǐng)導(dǎo)的小組率先利用真菌纖維素酶，成功的制備出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根細(xì)胞原生質(zhì)體，開(kāi)辟了原生質(zhì)體融合研究的新階段。植物細(xì)胞原生質(zhì)體是指那些已去除全部細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，這使細(xì)胞外僅有細(xì)胞膜包裹，呈圓形，要在高滲溶液中才能維持細(xì)胞的相對(duì)穩(wěn)定性。此外在酶解過(guò)程中殘存少量細(xì)胞壁的原生質(zhì)體叫原生質(zhì)球或球狀體。831973年，Keller提出的高鈣高pH法為原生質(zhì)體融合的一個(gè)有效方法；1974年加拿大籍華人高國(guó)楠首創(chuàng)聚乙二醇（PEG）法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合；1977年，他又把聚乙二醇法和高鈣高pH法結(jié)合，1978年，Melchers用此法獲得番茄與馬鈴薯細(xì)胞融合的雜種；1979年Senda發(fā)明了以電激法提高原生質(zhì)體融合率的新方法。843.3植物原生質(zhì)體的制備取材與除菌：一般取生活力較強(qiáng)，再生與分生比例較高的部分，如種子根、子葉、胚細(xì)胞、下胚軸、花粉母細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和嫩葉等。植株一般先清洗后用酒精消毒，再用3％次氯酸鈉處理，最后用無(wú)菌水漂洗。85酶解：采用纖維素酶的復(fù)合酶或者蝸牛酶，以葉片為例說(shuō)明制備過(guò)程①配制酶解反應(yīng)液②酶解：除菌后的葉片，撕下表皮，切塊，放入反應(yīng)液中，不時(shí)輕搖，反應(yīng)液轉(zhuǎn)綠③鏡檢④終止反應(yīng)86分離：一般選用200-400目的不銹鋼網(wǎng)或尼龍布進(jìn)行過(guò)濾除渣，也可用低速離心法或比重漂浮法獲取比較純的原生質(zhì)體洗滌：用新的滲透壓穩(wěn)定劑或原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心洗滌2～3次鑒定：在顯微鏡下可以觀(guān)察到原生質(zhì)體的狀態(tài)，一般細(xì)胞呈圓形，放入低滲溶液中易漲破。也可用熒光增白劑染色后在紫外顯微鏡下觀(guān)察，如有細(xì)胞壁殘留會(huì)呈現(xiàn)明顯熒光。872.2.3.4植物原生質(zhì)體的融合1.化學(xué)法誘導(dǎo)融合化學(xué)法誘導(dǎo)融合無(wú)需貴重儀器，試劑易于得到，因此一直是細(xì)胞融合的主要方法，尤其是聚乙二醇結(jié)合高鈣高pH法已成為化學(xué)法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的主流。88以下簡(jiǎn)介此方法：按比例混合雙親原生質(zhì)體→滴加PEG溶液，搖勻，靜置→滴加高鈣高pH溶液，搖勻，靜置→滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次→離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)→篩選、再生雜合細(xì)胞通常，在PEG處理階段，原生質(zhì)體間只發(fā)生凝集現(xiàn)象。加入高鈣高pH溶液后，緊挨著的原生質(zhì)體間才出現(xiàn)大量的細(xì)胞融合，其融合率可達(dá)10-50％。這是一種非選擇性融合，即可發(fā)生在同種細(xì)胞之間，也可發(fā)生在異種細(xì)胞之間。89不過(guò)，高濃度的PEG溶液結(jié)合高鈣高pH溶液對(duì)原生質(zhì)體是有一定的毒性的，因此進(jìn)行誘導(dǎo)融合的時(shí)間要適中。處理時(shí)間過(guò)短，融合頻率較低；處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則將因原生質(zhì)體活力明顯下降而導(dǎo)致融合失敗。Jelodar近年介紹，以丙酸鈣代替氯化鈣作為助融合劑，細(xì)胞融合頻率和植板率都有明顯提高，甚至超過(guò)了電激融合法。902.物理法誘導(dǎo)融合1979年Senda等發(fā)明了微電極法誘導(dǎo)細(xì)胞融合。1981年Zimmermann等提出了改進(jìn)的平行電極法。其基本原理同微生物原生質(zhì)體融合。電激融合不使用有毒害作用的試劑，作用條件比較溫和，而且基本上是同步發(fā)生融合。91最近，又有人提出以X射線(xiàn)、伽馬射線(xiàn)、紡錘體毒素或染色體濃縮劑等對(duì)供體原生質(zhì)體進(jìn)行前處理。輕劑量處理可造成染色體不同程度的丟失、失活、斷裂和損傷，融合后實(shí)現(xiàn)僅有少數(shù)染色體甚至是DNA片段的轉(zhuǎn)移；致死劑量處理后融合可能造成產(chǎn)生沒(méi)有供體方染色體的細(xì)胞質(zhì)雜種。利用這種所謂的不對(duì)稱(chēng)融合法，大大提高了融合體的生存率和可利用率。92經(jīng)過(guò)上述融合處理后再生的細(xì)胞株將可能出現(xiàn)以下幾種類(lèi)型：①親本雙方的細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)能融洽的合為一體，發(fā)育成為完全的雜合植株，這種情況不多。②融合細(xì)胞由一方細(xì)胞核與另一方細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成，可能發(fā)育為核質(zhì)異源植株。親緣關(guān)系越遠(yuǎn)的物種，某個(gè)親本的染色體被丟失的現(xiàn)象越嚴(yán)重93③融合細(xì)胞由雙方胞質(zhì)及一方核或再附加少量他方染色體或DNA片段構(gòu)成。④原生質(zhì)體融合后兩個(gè)細(xì)胞核尚未完全融合時(shí)就過(guò)早的被新出現(xiàn)的細(xì)胞壁分開(kāi)，以后它們各自分生長(zhǎng)成嵌合植株。942.2.3.5植物細(xì)胞雜合體的鑒別與篩選雙親本原生質(zhì)體經(jīng)融合后產(chǎn)生的雜合細(xì)胞，一般要經(jīng)含有滲透壓穩(wěn)定劑的原生質(zhì)體培養(yǎng)基培養(yǎng)，再生出細(xì)胞壁后轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基中。待長(zhǎng)出愈傷組織后按常規(guī)方法誘導(dǎo)其長(zhǎng)芽、生根、成苗。在此過(guò)程中可對(duì)是否是雜合細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒別與篩選。95雜合細(xì)胞的顯微鏡鑒別：如果雙方原生質(zhì)體在特殊顯微鏡下或者經(jīng)不同染料染色后可見(jiàn)不同特征，可作為雜合的標(biāo)志雜合細(xì)胞一方細(xì)胞大，一方細(xì)胞小一方細(xì)胞無(wú)色，一方細(xì)胞綠色96互補(bǔ)法篩選雜合細(xì)胞遺傳互補(bǔ)法的前提是獲得各種有遺傳突變的細(xì)胞株系。如不同基因的白化突變株aBXAb，可互補(bǔ)為綠色細(xì)胞株AaBb，這叫白化互補(bǔ)。甲菌株缺乏外源激素A不能生長(zhǎng)，乙菌株缺乏B不能生長(zhǎng)，則甲株和乙株融合，在不含A、B的選擇培養(yǎng)基上融合子可能生長(zhǎng)，這稱(chēng)為選擇互補(bǔ)還有如抗性互補(bǔ)篩選、營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)篩選、代謝互補(bǔ)篩選等。97采用細(xì)胞與分子生物學(xué)的方法鑒別雜合體：把融合后長(zhǎng)出的愈傷組織或植株，進(jìn)行染色體核型分析、染色體譜帶分析、同功酶分析以及更為精細(xì)的核酸分子雜交、限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析等，來(lái)確定是否結(jié)合了兩親本的遺傳物質(zhì)。根據(jù)融合處理后再生長(zhǎng)出來(lái)的植株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒別982.2.4單倍體植物的誘發(fā)與利用單倍體生物是指細(xì)胞中僅含一組染色體的個(gè)體。單倍體植物比單倍體動(dòng)物多見(jiàn)。1921年Bergner首次在高等植物曼陀羅中發(fā)現(xiàn)了單倍體植物，此類(lèi)植物與正常二倍體植物相比，葉片小、植株矮小、生活力弱，且高度不育。1924年，Blackeslse等提出了在育種中培植利用單倍體生物，然后加倍獲得正常二倍體的設(shè)想。991964年，Guha等率先人工誘導(dǎo)毛曼陀羅單倍體植株成功。到80年代末，世界范圍的人工誘導(dǎo)單倍體株已達(dá)34科88屬約250種，其中約1／5是我國(guó)科學(xué)工作者建立的。在自然界中偶爾也能見(jiàn)到天然誘發(fā)的單倍體植株。100天然的單倍體植株通常經(jīng)以下途徑發(fā)育而成：孤雌繁殖系統(tǒng)：植物卵細(xì)胞不經(jīng)受精而發(fā)育成單倍體孤雄繁殖系統(tǒng)：精子進(jìn)入囊胚后不與卵細(xì)胞受精而獨(dú)自發(fā)育成單倍體胚，再發(fā)育成植株，卵細(xì)胞退化消失無(wú)融合生殖：精卵結(jié)合后，不僅受精卵發(fā)育，由于某種原因，足細(xì)胞或反足細(xì)胞與受精卵形成二倍體胚同步發(fā)育成單倍體胚，形成雙胚或多胚種子101不過(guò)自然界產(chǎn)生單倍體植株的機(jī)率很低，小于千分之一。我們可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的誘導(dǎo)大量培育出符合需要的單倍體植株。1.花藥培養(yǎng)花藥由花藥壁和花粉囊構(gòu)成。經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)，花粉囊中的花粉（單倍體）可能去分化而發(fā)育成單倍體胚或愈傷組織，最終形成花粉植株。2.花粉培養(yǎng)由于花藥培養(yǎng)時(shí)，一些二倍性的花藥壁細(xì)胞亦能形成愈傷組織，從而增加了培育單倍體植株的難度。1021974年Nitsch等首創(chuàng)用擠壓法分離花粉進(jìn)行培養(yǎng)的方法。1977年Sunderland等提出了自然散開(kāi)法收集花粉的方法。雖然以花藥和花粉培養(yǎng)單倍體植株的研究都已取得長(zhǎng)足的進(jìn)展，但白化苗出現(xiàn)過(guò)多仍是有待解決的問(wèn)題。1033.未授粉子房或胚珠的培養(yǎng)子房、胚珠中的成熟胚囊由6個(gè)單倍體細(xì)胞（包括一個(gè)卵細(xì)胞）和1個(gè)具2個(gè)極核的中央細(xì)胞構(gòu)成。理論上這6個(gè)單倍體細(xì)胞都可能發(fā)育成單倍體植株。1976年SanNoeum首先從大麥的未授粉子房培養(yǎng)獲得單倍體植株。雖然該領(lǐng)域的工作目前還開(kāi)展不多，但由于誘導(dǎo)出的植株大多是單倍體幼苗，因此這可能是一個(gè)充滿(mǎn)希望的發(fā)展方向。1044.雜交法獲得單倍體植株雜交，特別是遠(yuǎn)緣雜交，雜種胚在胚胎發(fā)育過(guò)程中往往會(huì)將一方親本的染色體逐步排除，最終將得到僅含一方染色體的單倍體植株。1970年，Kasha利用該原理將球莖大麥與普通大麥雜交，培育出了普通大麥的單倍體胚和植株。由本方法得出的單倍體胚長(zhǎng)成的植株都是綠苗，這是本方法的突出優(yōu)點(diǎn)。1055.單倍體培養(yǎng)物的加倍我們之所以要得到單倍體培養(yǎng)物（愈傷組織、幼胚以及植株），其目的是為了對(duì)它們進(jìn)行染色體加倍，從而獲得純合的正常二倍體植物。在誘發(fā)單倍體植株的各階段（形成愈傷組織、幼胚以及小苗），都可用0.2-0.4％的秋水仙素處理24-48小時(shí)，然后按常規(guī)途徑培養(yǎng)，就可能得到染色體加倍的能正常開(kāi)花、結(jié)果的二倍體植株。1062.2.5人工種子的研制人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營(yíng)養(yǎng)成分、激素以及其他成分的人工膠囊。1071.人工種子的構(gòu)成及特點(diǎn)人工種子由以下三部分構(gòu)成：人工種皮：這是包裹在人工種子最外層的膠質(zhì)化合物薄膜。這層薄膜既能允許內(nèi)外氣體交換通暢，又能防止人工胚乳中水分及各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲漏，此外還應(yīng)具備一定的機(jī)械壓力。人工胚乳：這是人工配制的保證胚狀體生長(zhǎng)發(fā)育需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一般以生成胚狀體的培養(yǎng)基為主要成分。108胚狀體：胚狀體是由組織培養(yǎng)產(chǎn)生的具有胚芽、胚根雙極性、類(lèi)似天然種子胚的結(jié)構(gòu)，具有萌發(fā)長(zhǎng)成植株的能力。人工種子具有以下優(yōu)點(diǎn)：①可以不受環(huán)境因素的制約，一年四季可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)；②由于胚狀體是經(jīng)人工無(wú)性繁殖產(chǎn)生，有利于保存該種系的優(yōu)良性狀；③與試管苗相比，人工種子成本更低，更適合于機(jī)械化田間播種；109④可根據(jù)需要在人工胚乳中添加適量的營(yíng)養(yǎng)物、激素、農(nóng)藥、抗生素、除草劑等，以利于胚狀體的健康生長(zhǎng)。雖然人工種子的研制經(jīng)過(guò)十幾年取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，但還有一些關(guān)鍵技術(shù)仍未攻克，如人工種皮的性能還不盡人意，還未找到符合多數(shù)物種需要的人工胚乳，如何讓胚狀體處于健康的休眠狀態(tài)，人工種子怎樣做到既延長(zhǎng)保存時(shí)間又不明顯降低萌芽等。1102.人工種子的制備①胚狀體的制備及其同步生長(zhǎng)：由于很多獲得的胚狀體往往處于胚胎發(fā)育的不同時(shí)期，不符合制備大量人工種子的需要，因此誘導(dǎo)胚狀體的同步化生長(zhǎng)成了制備人工種子的核心問(wèn)題。采取以下措施可促進(jìn)胚狀體的同步生長(zhǎng)：低溫法：在細(xì)胞培養(yǎng)的早期對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行適當(dāng)?shù)蜏靥幚砣舾尚r(shí)，由于低溫阻礙了微管蛋白的形成，紡錘體形成受阻，滯留于有絲分裂中期的細(xì)胞增多，此時(shí)再讓培養(yǎng)物回復(fù)到正常溫度，細(xì)胞則同步分裂。111抑制劑法：同理，細(xì)胞培養(yǎng)初期加入DNA合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶等，是細(xì)胞生長(zhǎng)基本上都停頓與G1期（細(xì)胞分裂間期的第一生長(zhǎng)期），除去抑制劑后，細(xì)胞進(jìn)入同步分裂狀態(tài)。分離法：在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的適當(dāng)時(shí)期，用一定孔徑的尼龍網(wǎng)或鋼絲網(wǎng)或密度梯度離心法，收取處于胚胎發(fā)育某個(gè)階段的胚性細(xì)胞團(tuán)，然后轉(zhuǎn)移到無(wú)生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上，使多數(shù)胚狀體同步正常發(fā)育。112通氣法：有人發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中每天通入氮?dú)饣蛞蚁?～2次，每次幾秒或更長(zhǎng)時(shí)間，可顯著提高有絲分裂同步率。滲透壓法：隨著植物胚狀體發(fā)育從小到大，其滲透壓值呈現(xiàn)規(guī)律性的從高到低的變化。我們可配制一定滲透壓值的培養(yǎng)基而使胚狀體的發(fā)育停留在指定的階段，從而達(dá)到同步發(fā)育的目的?？刂萍?xì)胞及胚狀體的同步化生長(zhǎng)是一個(gè)尚未完全解決的問(wèn)題，除了上述提出的外因干預(yù)以外，物種及不同外植體細(xì)胞的敏感性，對(duì)實(shí)現(xiàn)同步生長(zhǎng)也有很大的影響。113②人工胚乳的制備人工胚乳的營(yíng)養(yǎng)需求因種而異，但與細(xì)胞、組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基大體相仿，通常還要配加一定量的天然大分子碳水化合物（淀粉、糖類(lèi)）以減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)泄漏。常用人工胚乳有：MS（或SH、White）培養(yǎng)基＋馬鈴薯淀粉水解物；0.5×SH培養(yǎng)基＋麥芽糖等。也可根據(jù)需要在上述培養(yǎng)基中添加適量激素、抗生素、農(nóng)藥、除草劑等。114③配制包埋劑及包埋褐藻酸鈉是目前最好的人工種子的包埋劑，它無(wú)毒，使用方便，具有一定的保水、透氣性能，價(jià)格較低，經(jīng)氯化鈣離子交換后，機(jī)械性能較好。其次是瓊脂、白明膠等。115通常以人工胚乳溶液調(diào)配成4％的褐藻酸鈉，再按一定的比例加入胚狀體，混勻后，逐滴滴到2.0-2.5％的CaCl2溶液中。經(jīng)過(guò)10-15分鐘的離子絡(luò)合作用，即形成一個(gè)個(gè)圓形的具有一定剛性的人工種子，而后以無(wú)菌水漂洗20分鐘，終止反應(yīng)，撈起晾干。116以上采用滴液法獲得的人工種子，其直徑隨滴管口徑的大小而定；每顆種子內(nèi)含胚狀體數(shù)目主要取決于包埋劑中胚狀體的密度；人工種皮的厚度則隨人工種子在CaCl2溶液中離子交換的時(shí)間的長(zhǎng)短而定，一般掌握在10～15分鐘。種皮太厚不利于胚狀體萌芽；種皮太薄，則在貯存、運(yùn)輸以及播種過(guò)程中都會(huì)遇到問(wèn)題。117④人工種子的貯存與萌芽人工種子的貯存與萌發(fā)是至今尚未攻克的難題。一般要將人工種子保存在低溫（4-7℃）、干燥（<67％相對(duì)濕度）條件下。有人將胡蘿卜人工種子保存在上述條件下，兩個(gè)月后的發(fā)芽率仍接近100％，但這種貯存方式的費(fèi)用是昂貴的，而在自然條件下，人工種子的貯存時(shí)間短，萌發(fā)率較低。118盡管人工種子的研制尚處于實(shí)驗(yàn)室階段，但它那令人神往的產(chǎn)業(yè)化前景正吸引著各國(guó)政府和科學(xué)家投入巨額資金，付出辛勤的汗水。成功研制人工種子的美好時(shí)刻相信不久一定會(huì)到來(lái)。1195.2植物細(xì)胞工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用植物中含有大量的次生代謝物，如藥用成分、色素、生物堿、酶等。由于植物生長(zhǎng)緩慢，滿(mǎn)足不了需求，所以工業(yè)化培養(yǎng)細(xì)胞以提取其產(chǎn)物是一條良好的途徑。下面介紹一下各種培養(yǎng)細(xì)胞能積累的各種次生代謝產(chǎn)物利用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)香料：比如甜菊苷（天然甜味劑）、磷酸二酯酶（催化RNA分解為可作調(diào)味劑用的核苷酸）、鄰苯二酸酐、類(lèi)萜烯、辣椒素等120利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)食品添加劑：①色素：甜菜苷②甜味劑：甜菊苷③鮮味劑：5‘核苷酸和有關(guān)的酶④防腐劑：沒(méi)食子酸乙酯⑤增稠劑：瓊膠利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然食品：如咖啡堿、可可堿、奶皮蛋白、黃豆甙、瓊脂等利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)植物藥材：如人參皂苷、迷迭香酸、醌、小檗堿和治療心臟病用的輔酶Q－10等1212.3動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)2.3.1細(xì)胞培養(yǎng)基的組成動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：離散的動(dòng)物活細(xì)胞在體外人工無(wú)菌條件下的生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。根據(jù)細(xì)胞是否貼附于支持物，培養(yǎng)的細(xì)胞分為：懸浮型：生長(zhǎng)時(shí)呈懸浮狀態(tài)貼附型：貼附于支持物生長(zhǎng)122冰凍保存分離培養(yǎng)供體組織細(xì)胞原代培養(yǎng)傳代細(xì)胞系123124培養(yǎng)基的常用成分氨基酸：必需氨基酸，半胱氨酸和酪氨酸等維生素鹽：主要是指Na＋、K＋、Mg2＋、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-等金屬和酸根離子葡萄糖有機(jī)添加劑：包括核苷、檸檬酸循環(huán)中間體、丙酮酸、脂類(lèi)等激素和生長(zhǎng)因素1252.3.2常用培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：取自動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織分離提取。營(yíng)養(yǎng)豐富、培養(yǎng)效果好，缺點(diǎn)是成分復(fù)雜，來(lái)源有限。主要有血清、組織浸液、凝固劑等合成培養(yǎng)基它是對(duì)動(dòng)物體內(nèi)生存環(huán)境中各種已知物質(zhì)在體外人工條件下的模擬，給細(xì)胞提供了一個(gè)近似體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和標(biāo)準(zhǔn)化體外生存空間，它是成分已知的培養(yǎng)基，還加入一定比例的天然培養(yǎng)基主要有eagel培養(yǎng)基、DMEM、RPM1640等培養(yǎng)基126無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基就是試圖全部采用已知營(yíng)養(yǎng)成分，包括血清中的細(xì)胞生長(zhǎng)有效因子，從而代替血清。1272.3.3動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)方法有兩種類(lèi)型：懸浮培養(yǎng)，或者叫非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞培養(yǎng)。貼壁依賴(lài)性細(xì)胞培養(yǎng)，就是細(xì)胞附著在帶有適量電荷的固體或半固體表面上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。1281.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)其中自由懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁保護(hù)，所以不能耐受劇烈攪拌和通氣，采用滾瓶和轉(zhuǎn)瓶的方法培養(yǎng)，大規(guī)模的采用發(fā)酵罐培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單、有成熟的理論指導(dǎo)，缺點(diǎn)是細(xì)胞密度低易變異，有潛在的致癌危險(xiǎn)。1292.貼壁培養(yǎng)將細(xì)胞貼附在固體表面介質(zhì)上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法，主要用于非淋巴組織等貼壁依賴(lài)性細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞貼壁包括貼壁因子吸附培養(yǎng)表面、細(xì)胞與表面接觸、細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)表面、細(xì)胞在培養(yǎng)表面上擴(kuò)展等幾個(gè)步驟現(xiàn)在研究人員開(kāi)發(fā)了微載體系統(tǒng)來(lái)培養(yǎng)貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，這種方法容易控制和檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)基利用率高，采用重復(fù)性好，收獲過(guò)程簡(jiǎn)單，放大容易1303.固定化培養(yǎng)是一種既適用于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，又適用于非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞的包埋培養(yǎng)方式。一般貼壁依賴(lài)性細(xì)胞采用膠原包埋培養(yǎng)，而對(duì)于非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞則通常采用海藻鈣包埋。常用的細(xì)胞固定化方法有吸附、共價(jià)貼附、離子共價(jià)交聯(lián)、包埋和微膠囊化等。1311324.大規(guī)模培養(yǎng)法動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，融合了固定化細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)罐技術(shù)以及人工灌流和溫和攪拌系統(tǒng)等技術(shù)后發(fā)展起來(lái)的。133①中空纖維法：中空纖維是一種由硝酸纖維和醋酸纖維混合物組成的空心纖維，這種纖維具有一定的通透性，它允許小分子營(yíng)養(yǎng)物自由出入，而大分子物質(zhì)和細(xì)胞則不能隨便進(jìn)出，因此這種纖維結(jié)構(gòu)又叫半透膜管道。用中空纖維培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞都貼附在纖維外壁生長(zhǎng)，而生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，則由一臺(tái)灌流機(jī)從內(nèi)腔不斷的灌流供給。這種培養(yǎng)方法在分離和純化分泌物是很方便，因而在生產(chǎn)激素和單抗體時(shí)廣泛應(yīng)用。134②微載體法1967年，VanWezel開(kāi)發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。微載體是由天然葡聚糖聚合物或其它聚合物制成的固體小珠，其直徑在幾十到數(shù)百微米之間。培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，將微載體浸一下血清后和細(xì)胞懸浮液混合孵育，等細(xì)胞貼附于微載體上后，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)液中培養(yǎng)。微載體法能使細(xì)胞均勻分布、提高了對(duì)培養(yǎng)液和培養(yǎng)空間的利用，適于大規(guī)模培養(yǎng)，收獲簡(jiǎn)單，放大生產(chǎn)也容易。135③微膠囊法微膠囊法是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體，小分子物質(zhì)可以自由透過(guò)，而各種酶、附酶、離子交換劑、活性炭等大分子物質(zhì)包裹在其中不能逸出，利用它們催化底物。微膠囊化培養(yǎng)是借鑒此種固定化技術(shù)將細(xì)胞包埋在微囊中，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到一定的保護(hù)，細(xì)胞密度增加較多，純度得到了提高。微膠囊化培養(yǎng)對(duì)單克隆抗體、干擾素等有用產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)提供了一種有效途徑。1363.動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合是研究細(xì)胞間遺傳物之間信息轉(zhuǎn)移、基因在染色體上的定位、以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。動(dòng)物細(xì)胞融合的途徑有以下三條：1.病毒誘導(dǎo)融合：1958年岡田善雄偶然發(fā)現(xiàn)已滅活的仙臺(tái)病毒（HVJ,副粘液病毒的一種）可誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞相互融合形成多核體細(xì)胞。137科學(xué)家已證實(shí)，其他的副粘液病毒、天花病毒和皰疹病毒也能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法如下：雙親本細(xì)胞細(xì)胞懸浮液混和離心細(xì)胞沉淀滅活仙臺(tái)病毒懸浮液混勻細(xì)胞凝集細(xì)胞融合選擇培養(yǎng)基冰浴20分鐘間歇搖動(dòng)水浴37℃，30分鐘間歇搖動(dòng)138如果雙親本細(xì)胞都呈單層貼壁生長(zhǎng)，則將它們混合培養(yǎng)后直接加入滅活仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)融合即可。本方法雖然建立較早，但由于病毒的致病性及寄生性，制備比較困難；此外本方法誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞融合率比較低，重復(fù)性不夠高，所以近年來(lái)已不多用。1392.化學(xué)誘導(dǎo)融合1975年，Potecorvo用聚乙二醇（PEG）成功誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合。從此以后，PEG法誘導(dǎo)融合一直成為動(dòng)植物細(xì)胞融合的主要手段，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言，由于它們不具有細(xì)胞壁，它們的融合更加簡(jiǎn)便。關(guān)鍵在于親本雙方要有較明顯的可識(shí)別的篩選標(biāo)志（基因和／或性狀）。動(dòng)物細(xì)胞的PEG融合方法可參考前述的微生物、植物細(xì)胞融合的PEG懸浮混合法進(jìn)行。1403.電激誘導(dǎo)融合方法參見(jiàn)為微生物和植物原生質(zhì)體電激融合。與植物雜合細(xì)胞篩選的模式類(lèi)似，動(dòng)物雜合細(xì)胞篩選也可采用抗藥性互補(bǔ)性篩選和營(yíng)養(yǎng)缺陷性篩選方法，此外也有人采用溫度敏感突變等特征進(jìn)行篩選?？傊?，細(xì)胞株具備越多可識(shí)別的突變性狀，以它為親本進(jìn)行細(xì)胞融合和篩選就愈容易。1413.4.3動(dòng)物細(xì)胞融合子的鑒定同微生物、植物融合子篩選一樣，利用親本細(xì)胞的藥物抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型和穩(wěn)定敏感性等遺傳標(biāo)記，進(jìn)行篩選。另外，在融合前用人工標(biāo)記親本細(xì)胞，或以致死劑量生化阻抑劑處理親本細(xì)胞，也是一種有效的方法。142目前雜種細(xì)胞篩選比較成功的有：由抗性藥物組成的雜種的篩選：用各種選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選有營(yíng)養(yǎng)缺陷變異型細(xì)胞組成的雜種的選擇：用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基進(jìn)行選擇由溫度敏感突變型細(xì)胞組成的雜種的選擇：采用非許可溫度進(jìn)行培養(yǎng)，或根據(jù)需要結(jié)合適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基篩選1433.4.4單克隆抗體技術(shù)免疫反應(yīng)是人類(lèi)對(duì)疾病具有抵抗力的重要因素。當(dāng)動(dòng)物體受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體?？贵w的特異性取決于抗原分子的決定簇，各種抗原分子具有很多抗原決定簇，因此，免疫動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體實(shí)為多種抗體的混合物。用這種傳統(tǒng)方法制備抗體效率低、產(chǎn)量有限，且動(dòng)物抗體注入人體可產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。此外，要把這些不同的抗體分開(kāi)也極困難。近年，單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)，是免疫學(xué)領(lǐng)域的重大突破。144（1）單克隆抗體的基本概念抗體主要由B淋巴細(xì)胞合成。每個(gè)B淋巴細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因。動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)種不同的B淋巴細(xì)胞系，含遺傳基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成該細(xì)胞的后代，即克隆由許多個(gè)被激活B細(xì)胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多種抗體。如果能選出一個(gè)制造一種專(zhuān)一抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成一種決定簇的抗體，稱(chēng)為單克隆抗體。145（2）單克隆抗體技術(shù)的基本原理要制備單克隆抗體需先獲得能合成專(zhuān)一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長(zhǎng)。而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性