細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)教材

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)第一個(gè)問題…我根本不知道細(xì)胞是什么我聽說過細(xì)胞培養(yǎng)，但沒有見過我見過別人操作，但是沒親自養(yǎng)過我會養(yǎng)至少1種細(xì)胞我各種培養(yǎng)精通，今天純屬來打醬油細(xì)胞培養(yǎng)基本概念（一）原代培養(yǎng)：細(xì)胞是直接通過機(jī)械分離，酶解等方式從動物組織，胚胎或成體中獲得的組織塊培養(yǎng)獲得。形態(tài)上與來源的組織的細(xì)胞相似；生理上也接近體內(nèi)的細(xì)胞；有限傳代細(xì)胞:正常的細(xì)胞只能分裂有限的次數(shù)，隨后就會喪失增殖的能力。這種細(xì)胞就被稱為有限傳代細(xì)胞系；形態(tài)與生理特性仍與來源處細(xì)胞比較接近；增殖快的細(xì)胞會占據(jù)優(yōu)勢，最終導(dǎo)致細(xì)胞群體在基因型和表型上達(dá)到一定程度一致；有限傳代細(xì)胞系可以轉(zhuǎn)化成持續(xù)傳代細(xì)胞系（如：引入病毒的SV40）連續(xù)傳代細(xì)胞株/系：通過對高生長率的細(xì)胞篩選，自然或人工轉(zhuǎn)化的方式可以得到性狀穩(wěn)定，能無限傳代的細(xì)胞；相當(dāng)部分來源于腫瘤細(xì)胞，也可以通過人工轉(zhuǎn)化；形態(tài)學(xué)，細(xì)胞功能，生長特性發(fā)生改變；由于基因型的改變，有時(shí)不能很好地模擬invivo的情況；實(shí)驗(yàn)中使用相對原代或有限傳代細(xì)胞更容易獲得及培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)基本概念貼壁細(xì)胞：這類細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面黏附，形成單層細(xì)胞大多數(shù)組織來源的細(xì)胞都需要貼壁才能生長，包括成纖維細(xì)胞核上皮細(xì)胞。容易進(jìn)行顯微觀察、雜交和其他試驗(yàn)懸浮細(xì)胞：在培養(yǎng)基中懸浮生長。起源于血液，脾臟或骨髓的細(xì)胞，特別是未成熟的細(xì)胞趨向懸浮生長。懸浮培養(yǎng)的好處是容易得到大量懸浮細(xì)胞，收集容易。細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)主要優(yōu)勢：使用一批同源細(xì)胞獲得穩(wěn)定、可重復(fù)的結(jié)果。細(xì)胞培養(yǎng)可以為細(xì)胞正常生理和生化、藥物和毒性化合物對細(xì)胞的作用以及致突變和致癌研究提供上佳的模型系統(tǒng)。細(xì)胞培養(yǎng)還可以用于藥物篩選和開發(fā)以及生物化合物的大規(guī)模生產(chǎn)?！?xì)胞培養(yǎng)操作安全預(yù)防實(shí)驗(yàn)室感染工作臺和相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備均要保持干凈整齊和定期消毒，以防止被試劑或細(xì)胞培養(yǎng)物污染。新潔爾滅或84消毒：細(xì)胞房的地面和實(shí)驗(yàn)室臺面設(shè)備等等酒精：70%醫(yī)用酒精常規(guī)消毒廢棄物處理：每日清理垃圾和廢棄物細(xì)胞培養(yǎng)廢棄物（槍頭，培養(yǎng)皿，廢液等等）要按規(guī)定進(jìn)行單獨(dú)處理生物安全性等級美國疾控預(yù)防控制中心（CDC）和國立衛(wèi)生研究院（NIH）制定、美國衛(wèi)生和福利部頒布的《微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全》文件，規(guī)定了四個(gè)逐漸升高的安全等級：BSL-1~4級。中國也先后出臺多項(xiàng)法律法規(guī)以保證生物實(shí)驗(yàn)室安全。生物安全性等級與操作要求*所操作的微生物危險(xiǎn)等級參考《人間傳染的病原微生物名錄》（衛(wèi)生部，2006），并向?qū)嶒?yàn)室管理人員咨詢相應(yīng)的操作區(qū)域與設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥（層流通風(fēng)櫥或生物安全柜）CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37度恒溫）恒溫水浴鍋移液器離心機(jī)冰箱和冰柜：用于儲存培養(yǎng)試劑倒置顯微鏡：觀察和記錄耗材：細(xì)胞培養(yǎng)基：根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞選擇配制培養(yǎng)容器：培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶，多孔細(xì)胞培養(yǎng)板，滾板等等無菌的一次性吸管、移液頭、離心管等等70%醫(yī)用酒精、酒精棉球其他：廢液罐、pH計(jì)等等無菌操作基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)往往要求一段時(shí)間的連續(xù)培養(yǎng)，因此，保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染對成功的細(xì)胞培養(yǎng)至關(guān)重要。無菌技術(shù)主要包括以下幾個(gè)方面：清潔的細(xì)胞房工作環(huán)境使用無菌或滅菌的玻璃及塑料器皿良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣和操作技巧保持培養(yǎng)基、試劑不受污染清潔的細(xì)胞培養(yǎng)工作區(qū)細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥/生物安全柜：相對封閉的操作環(huán)境工作區(qū)能保持清潔，容易維護(hù)需要定期更換HEPA濾網(wǎng)需要供電操作前后用紫外燈照射操作前后用70%酒精擦拭當(dāng)使用結(jié)束后關(guān)好玻璃柜門獨(dú)立的層流細(xì)胞培養(yǎng)間：實(shí)驗(yàn)室中劃出的獨(dú)立區(qū)域所有氣體經(jīng)過HEPA濾網(wǎng)過濾清潔的塑料或玻璃器皿細(xì)胞培養(yǎng)用移液管、試劑瓶、培養(yǎng)皿、多孔板等等

一次性的塑料制品：經(jīng)處理的表面，細(xì)胞更容易貼附生長，特別是單層細(xì)胞培養(yǎng)比可重復(fù)使用的玻璃制品貴適合4度冰箱低溫保存玻璃制品：能耐受0度以下低溫可以反復(fù)滅菌使用良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣和操作技巧穿好實(shí)驗(yàn)服、戴好乳膠手套，換專用拖鞋。用70%酒精擦拭工作區(qū)只有在操作時(shí)才打開滅菌的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)板的包裝，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后未使用的器材要盡快包好實(shí)驗(yàn)所用的移液管，移液器槍頭只有在工作臺內(nèi)打開包裝并且保持干凈細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基或試劑均需要預(yù)先過濾或高溫滅菌保持試劑瓶與桌面成45度角的時(shí)候打開瓶蓋，打開后不要將瓶蓋開口朝上放置。使用完要立刻蓋上蓋子每瓶溶液用單獨(dú)的移液管，避免移液管或槍頭碰觸任何的非滅菌物品，移液管不要留在瓶內(nèi)工作區(qū)內(nèi)盡量減少手臂運(yùn)動，提前準(zhǔn)備好可能用到的東西。酒精燈附近會形成向上的氣流，操作可以在酒精燈附近完成。細(xì)胞培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基的成分細(xì)胞生長所需必需氨基酸、維生素、有機(jī)鹽、葡萄糖

和一定比例的血清（血清中含有生長因子，激素及細(xì)胞因子），酚紅及抗生素血清和基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MEM、DMEM、RMPI1640等等）分開購買細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常添加10%小牛血清，胎牛血清，也有部分細(xì)胞需要馬血清，羊血清。pH值培養(yǎng)基的pH值介于7.2-7.4一般都會以NaHCO3緩沖當(dāng)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)消耗時(shí)，培養(yǎng)基中的酚紅（指示劑）會變黃。細(xì)菌污染或者培養(yǎng)箱中CO2濃度過高也會引起變黃，注意區(qū)分不同的培養(yǎng)基配制時(shí)需要添加不同濃度的NaHCO3細(xì)胞培養(yǎng)基（續(xù)）市售基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉：需要自行加去離子水按比例配制，價(jià)格最低；需要用0.22微米濾器正壓過濾。（負(fù)壓產(chǎn)生的泡沫會破壞其中的蛋白成分）濃縮液：用滅菌去離子水按比例稀釋液體：直接可以使用，方便，進(jìn)口的液體培養(yǎng)基價(jià)格最昂貴。血清：血清是非常昂貴的試劑，常常分裝后凍存，在使用前再加入培養(yǎng)基中不同細(xì)胞需要的血清種類和濃度不同，請事先確認(rèn)通過血清可能傳播某些感染因子或顆粒，因此只購買能夠確定血清來源的血清。例如，禁止從出現(xiàn)瘋牛病的國家進(jìn)口牛血清市面上有假冒血清，不要為省錢去購買來源不明的血清同一品牌不同批次的血清仍可能存在差異，盡量購買使用后效果好的批次培養(yǎng)基儲存存放4度冰箱暗處避光保存，某些成分對光和熱敏感禁止高溫滅菌血清可以在使用時(shí)再按比例添加細(xì)胞的獲得請同一實(shí)驗(yàn)室的同事同學(xué)給送給你觀看贈送者的培養(yǎng)操作步驟，盡量記下操作細(xì)節(jié)特殊細(xì)胞系需要請某些實(shí)驗(yàn)室贈送找出使用該種細(xì)胞的文獻(xiàn)和報(bào)告，寫信請求向周圍的人詢問原代細(xì)胞一般需要自行取得，很少有人贈送向可靠的細(xì)胞庫購買常用細(xì)胞庫除列表外仍然有其他的一些可靠來源，請向同實(shí)驗(yàn)室的人咨詢細(xì)胞的獲得當(dāng)你拿到一株細(xì)胞時(shí)，需要了解：有沒有使用抗生素，使用的抗生素濃度是多少？細(xì)胞是怎樣生長的？貼壁還是懸??？生長速度快慢？傳代的方法是什么？最適合的傳代密度是多少？密度過高是否會發(fā)生分化？最好使用的是什么培養(yǎng)基？血清類型和比例是多少？是否需要其他成分？培養(yǎng)皿是否需要做特殊處理？膠原包被？Laminin?對一個(gè)細(xì)胞系的特性了解的越多，越容易解釋和解決培養(yǎng)中可能出現(xiàn)的問題。例：細(xì)胞株的說明書來源：例：細(xì)胞株說明書-ATCC來源：/例：細(xì)胞株說明書（續(xù)1）例：細(xì)胞株說明書（續(xù)2）細(xì)胞的日常維護(hù)為了維護(hù)細(xì)胞，必須：給養(yǎng)：細(xì)胞生長過程中匯消耗培養(yǎng)基中的某些必需因子，必須及時(shí)更換培養(yǎng)基傳代：隨著細(xì)胞的生長，細(xì)胞數(shù)量會不斷增長，多數(shù)細(xì)胞每24小時(shí)增殖一倍，很快培養(yǎng)皿里就滿了凍存：無論什么時(shí)候你獲得或構(gòu)建了一個(gè)細(xì)胞株，都必須分裝凍存。避免細(xì)胞受到污染后發(fā)生表型漂變永遠(yuǎn)不要在沒有進(jìn)行顯微鏡觀察的情況下就進(jìn)行細(xì)胞傳代、實(shí)驗(yàn)或者凍存細(xì)胞。貼壁細(xì)胞的傳代從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中小心吸走培養(yǎng)基緩慢加入37度溫浴的PBS或不含血清的培養(yǎng)基，讓培養(yǎng)基沿容器壁流下，小心不要直接滴在細(xì)胞上，以免沖掉附著不牢的細(xì)胞小心移去PBS或培養(yǎng)基加入含0.25%胰蛋白酶的PBS，加入量以剛沒過細(xì)胞為宜停留30秒左右，立刻吸去胰蛋白酶室溫放置5-15min，每隔幾分鐘用肉眼觀察當(dāng)容器晃動時(shí)細(xì)胞是否脫落，如果是，下一步。如果沒有，可以在37度保溫5min加入含血清的新鮮培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞使細(xì)胞分散，在顯微鏡下確認(rèn)獲得的是游離的單個(gè)細(xì)胞吸取少量細(xì)胞懸液到EP管細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定需要的稀釋倍數(shù)吸出適量的懸液到新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，加入適量的新鮮培養(yǎng)液輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分散在培養(yǎng)皿表面將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱，適度擰松蓋子懸浮細(xì)胞的傳代從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，輕輕搖勻培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)物，吸出大約1ml到EP管中對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)計(jì)算所需要的稀釋倍數(shù)，決定需要的種子液的量吸出適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)瓶加入適量37度預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱中，并把蓋子松開，以便進(jìn)行充分的氣體交換繼續(xù)培養(yǎng)原瓶細(xì)胞，不加入新的培養(yǎng)基，以防傳代后細(xì)胞污染，在培養(yǎng)瓶上標(biāo)明“備份”，并在下一次傳代后丟棄活細(xì)胞計(jì)數(shù)

將臺盼藍(lán)染液與細(xì)胞樣品混合?；罴?xì)胞會排斥染料進(jìn)入，而死細(xì)胞會染成深藍(lán)色。推薦稀釋比為1:20（5μl細(xì)胞懸液加入95μl臺盼藍(lán)染液)將混合液小心地填滿血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的小室靜置1-2min在顯微鏡下數(shù)出4個(gè)1x1x0.1mm面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，死細(xì)胞和活細(xì)胞最好都數(shù)出來理想的情況下，每個(gè)小室大約有200-500個(gè)細(xì)胞

細(xì)胞懸液的濃度：每個(gè)1x1x0.1mm面積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量=細(xì)胞數(shù)x1*10^-4cm3，即為(1*10-4ml).再乘上稀釋倍數(shù)避免同一個(gè)細(xì)胞數(shù)兩次，只數(shù)兩條邊細(xì)胞凍存細(xì)胞可以在-135~175度的液氮中保存保存上幾年時(shí)間，或者在-80度冰箱中保存幾個(gè)月而仍能復(fù)蘇生長凍存細(xì)胞以防備因?yàn)橐馔舛鴵p失重要細(xì)胞系即使是無限傳代的細(xì)胞系，經(jīng)過長期傳代和培養(yǎng)都可能發(fā)生表型漂變準(zhǔn)備細(xì)胞凍存所需的試劑和設(shè)備耗材：參考ATCC、細(xì)胞庫提供的冷凍特定細(xì)胞株的冷凍配方一般凍存液為10%DMSO+90%FCS專用的細(xì)胞凍存管，一般都帶有螺紋蓋，可以耐受低溫。不能使用EP管在液氮罐里找好存放細(xì)胞的位置選擇生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，不要凍存死細(xì)胞比例達(dá)到20%的細(xì)胞根據(jù)凍存細(xì)胞量準(zhǔn)備凍存管，每個(gè)管一般裝1ml液體，細(xì)胞量在5X106左右準(zhǔn)備好凍存液，一般凍存液包含10%DMSO+90%FCS，也可以是10%DMSO+20%FBS+基礎(chǔ)培養(yǎng)基用凍存液重懸細(xì)胞，輕柔的吹散細(xì)胞每個(gè)凍存管裝入1ml懸液，并放在冰上30min將凍存管放入-80度冰箱24小時(shí)過夜轉(zhuǎn)移到液氮罐或超低溫冰箱長期保持細(xì)胞凍存流程細(xì)胞復(fù)蘇流程將細(xì)胞凍存管從液氮罐中取出，迅速放入37度水浴鍋中快速解凍（1min內(nèi)）捏住凍存管的蓋子部分，輕輕而快速的轉(zhuǎn)動凍存管，小心不要讓水沒過蓋子或滲入凍存管內(nèi)全部解凍后，在生物安全柜中將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到15ml離心管中添加10ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，在200X的離心力下將細(xì)胞懸液離心5-10分鐘。實(shí)際的離心速度和時(shí)間取決于細(xì)胞的種類小心的移去培養(yǎng)基，用預(yù)熱的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。以適當(dāng)?shù)拿芏绒D(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱大約1hr后可以觀察細(xì)胞的生長情況發(fā)生細(xì)胞污染是件讓人抓狂的事?。?！讓人抓狂浪費(fèi)時(shí)間和金錢丟失有價(jià)值的細(xì)胞和產(chǎn)物獲得錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)識別污染肉眼觀察：將培養(yǎng)皿瓶拿起來，對著光線檢查渾濁：即使細(xì)胞的密度很高，培養(yǎng)基也應(yīng)該是透明的。細(xì)菌、酵母都會導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁。霉菌可能在培養(yǎng)基的表面形成菌落培養(yǎng)基的顏色：酸性條件下，加了酚紅的培養(yǎng)基會變黃；堿性條件下則會偏紫。細(xì)菌污染會使培養(yǎng)基變黃，真菌污染則會使培養(yǎng)基變成深紫紅色。聞！當(dāng)然不能直接打開瓶子去聞。許多污染發(fā)生以后都會散發(fā)出易察覺的、特殊的氣味，甚至一開培養(yǎng)箱門就聞到了顯微觀察：其他微生物：真菌的菌絲、酵母、細(xì)菌，根據(jù)形態(tài)可以初步判斷損傷和死亡的細(xì)胞：感染會殺死細(xì)胞，可能導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞裂解，或細(xì)胞層從附著物上完全剝離，更可能是細(xì)胞變得不規(guī)則，在低倍鏡下看到黑色的粒狀物細(xì)菌污染非常常見容易與細(xì)胞碎片弄混注意細(xì)菌有游動能力，而且形態(tài)一致注意pH值下降培養(yǎng)基渾濁真菌與酵母污染也很常見個(gè)體較大，容易發(fā)現(xiàn)和區(qū)分酵母明亮，有些有出芽真菌往往在培養(yǎng)基表面形成聚落污染的處理首先鑒別發(fā)生污染的是細(xì)菌、真菌、酵母或是支原體將被污染的培養(yǎng)物與其他的細(xì)胞分開。清潔細(xì)胞培養(yǎng)箱和生物安全柜，檢查HEPA濾網(wǎng)是否需要更換如果細(xì)胞系不是特別難獲得的那種，丟掉被污染的細(xì)胞，復(fù)蘇新的細(xì)胞。特殊情況下，用2-3倍的濃度的抗生素培養(yǎng)2-3代。再用無抗培養(yǎng)基培養(yǎng)1代重復(fù)以上兩步用無抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)4-6代以確定污染是否已經(jīng)完全去除常用抗生素抗生素并不能抑制所有的污染濫用抗生素也是引起支原體污染的原因除非特別必要，不推薦使用兩性霉素B支原體污染支原體是一類普遍而難察覺的污染支原體僅有0.3微米，顯微鏡下通常觀察不到支原體沒有細(xì)胞壁，對常用的抗生素不敏感支原體污染會造成不易察覺的細(xì)胞