【人參抗氧化活性的探究11000字（論文）】

VI頁(yè)共22頁(yè)1引言1.1研究背景人參是五加科的一種多年生草本，主要在中國(guó)，俄羅斯，朝鮮等地區(qū)。人參是一種補(bǔ)氣的藥物，主要有補(bǔ)氣固元、補(bǔ)脾益肺、益氣生津、安神益智等作用，主要是針對(duì)氣血虧虛、脾虛乏力、心神不安、久病體虛氣脫等癥狀。人參葉多為長(zhǎng)柄掌形復(fù)葉，其輪生葉的數(shù)量因其生長(zhǎng)年份而異，最多可達(dá)六個(gè)。人參葉中的多糖、皂苷、黃酮等多種成分。[1-3]人參葉是一種常用的中藥材，主要有補(bǔ)氣益肺、祛暑生津的作用，而且容易獲得，價(jià)格便宜，口感好，是輕工業(yè)的重要原料。例如，藥膏、煙、酒等含有人參葉的產(chǎn)品，在餐飲業(yè)中也廣泛應(yīng)用。因此，人參葉在我國(guó)有著巨大的發(fā)展?jié)摿?，若加以利用，不但可以為本地農(nóng)業(yè)提供巨大的發(fā)展機(jī)會(huì)，更可為我國(guó)的經(jīng)濟(jì)增加一筆可觀的收入。1.2研究意義隨著生活節(jié)奏的加快，生活質(zhì)量的不斷提高，人們對(duì)健康的要求也越來(lái)越高，保健品的市場(chǎng)也在不斷地?cái)U(kuò)張。由于人參的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，其使用量也在逐年增長(zhǎng)，因此，對(duì)人參的需求量也在不斷增長(zhǎng)。而且，人參的藥效太強(qiáng)，不能作為一種保健品。所以，開(kāi)發(fā)人參葉只非常重要的。人參葉不僅有人參的功效，而且藥性柔和，是一種很好的保健食品。人參葉含有豐富的氨基酸、黃酮等多種有益于人體健康的物質(zhì)，黃酮是一種常見(jiàn)的植物次生代謝物。在養(yǎng)殖中，黃酮是一種比較常用的藥物，可以促進(jìn)動(dòng)物的繁殖，同時(shí)也可以起到抗氧化、延緩衰老的作用。另外，還能改善心腦血管疾病，高血壓，腦溢血。本文采用微波、超聲、熱回流三種常用方法對(duì)人參葉進(jìn)行了初步對(duì)比，并建立了響應(yīng)面模型，探討了人參葉總黃酮的提取工藝，并進(jìn)行了相應(yīng)的抗氧化試驗(yàn)。1.3相關(guān)概念闡述1.3.1皂苷類(lèi)成分目前，已從人參皂苷中分離、鑒定出了40多個(gè)皂苷單體。盡管這種皂苷在自然界中的含量很低，但是它具有大量的、復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，使它的結(jié)構(gòu)更加豐富。此外，該物質(zhì)具有多種有效的生物活性，可為新藥的研發(fā)提供豐富的前驅(qū)物，具有較好的應(yīng)用前景。1.3.2黃酮類(lèi)成分人參黃酮能顯著提高心臟冠狀動(dòng)脈血流，并能增強(qiáng)其生理活性，但目前從人參中提取的黃酮成分很少，多數(shù)為黃酮醇。1.3.3人參皂苷Rg1人參、三七和西洋參富含人參皂苷Rg1，其分子結(jié)構(gòu)如圖1-1所示。近年來(lái)，Rg1具有很強(qiáng)的降血糖和抗氧化活性。人參皂甙Rg1對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞有明顯的抑制作用。圖1-1人參皂苷Rg1分子結(jié)構(gòu)Fig.1-1ThemolecularstructureofGRg1人參皂甙Rg1已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的防治。四君子茶由人參、白術(shù)、茯苓、甘草等組成，是一種滋補(bǔ)中藥，是一種優(yōu)良的中藥制劑。另外，它還具有保護(hù)神經(jīng)退化的作用，提高學(xué)習(xí)和記憶的能力?？剐募∪毖蜏p少心肌細(xì)胞增生。此外，此外，人參皂甙Rg1還具有一定的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制包括調(diào)控免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡。1.3.4人參皂苷RH2、RG3人參皂苷是人參當(dāng)中主要的抗腫瘤成分，人參皂甙RH2、人參皂甙RG3是具有抗癌作用的主要組分。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷RH2、Rg3具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、延緩細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)控免疫等作用。二醇皂甙Rg3是一種罕見(jiàn)的人參皂甙，具有抗炎、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抑制血管新生等功效。與人參皂甙RH2結(jié)合，可促進(jìn)血液的吸收，提高其功效[5]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂甙RH2和Rg3在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中具有重要的作用，RH2和Rg3對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有一定的抑制作用，但PDL1的加入使其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲有一定的影響，說(shuō)明RH2和Rg3在胃癌中的抑癌作用，PDL1是腫瘤的啟動(dòng)因子。通過(guò)對(duì)人參皂甙RH2、Rg3、PDL1的相互作用研究，可以為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)人參皂甙RH2、Rg3、PDL1的作用機(jī)理提供新的思路。1.3.5人參皂苷G-Rg3人參皂苷G-Rg3是被認(rèn)為是人參最重要的活性成分之一，具有嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的抑制作用，改善免疫功能和增強(qiáng)抗病能力，抗腫瘤作用，抑制NLRP3炎性小體激活等。Yang[6]等發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3抗炎機(jī)制新位點(diǎn)，人參皂甙Rg3通過(guò)PI3K/AKT/mTOR通路介導(dǎo)脂多糖致急性肺損害的保護(hù)效應(yīng)。Tang[7]等人的研究表明，Rg3可以作為一種新的治療結(jié)直腸癌的方法，Rg3不但可以抑制CRC細(xì)胞的增殖，還可以抑制腫瘤的新生血管形成。Wang[8]等人探討Rg3對(duì)鼻咽癌（NPC）細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)作用及作用機(jī)理。Rg3能調(diào)控MMP-2和MMP-9在MMP-2和MMP-9中的表達(dá)，從而抑制EMT與EMT有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。1.4研究綜述1.4.1抗腫瘤人參皂甙具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)控信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)體免疫功能的作用。人參皂甙Rg3具有抑制乳腺癌增生、抑制甲狀腺癌轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)A549/DDP的多藥耐藥性、提高結(jié)直腸癌對(duì)放射治療的敏感性、抑制胰腺腫瘤的增殖。它具有多種機(jī)制，具有較強(qiáng)的抗癌活性。相對(duì)于人參皂甙Rg3，人參皂甙Rh2具有更大的抗腫瘤活性。它能降低microRNA-31的增殖和遷移，逆轉(zhuǎn)人結(jié)直腸癌的耐藥性，抑制Bcl-2細(xì)胞和子宮肌瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制NSCLC的遷移和侵襲，抑制人A172細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制Bcl-2在白血病細(xì)胞中的作用。另外，達(dá)瑪烷類(lèi)皂甙的很多成份都具有很好的抗癌作用。人參皂甙Rb1,Rb2,Rc,Rd,F2,Rh1,Rh4，三七皂苷R1，原人參三醇，CK和gypenosideLXXV等皂甙類(lèi)物質(zhì)，對(duì)卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤有明顯的療效。周成等人發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg3能抑制人腔鱗癌細(xì)胞的增殖及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，其作用機(jī)制是調(diào)控miR-221[11]。郭奕維等人發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3與PD-1抑制劑結(jié)合后，能抑制T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的分化，從而具有抑制DLBCL細(xì)胞的作用。王學(xué)謙發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2能調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。何運(yùn)元等發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3能通過(guò)調(diào)控Wnt/b-Catenin信號(hào)途徑，從而對(duì)大腸癌細(xì)胞的增殖起到一定的抑制作用。武文華相信，人參皂甙Rg1可以促進(jìn)免疫和IL-2的產(chǎn)生，而Inf-IL-12p40則可以提高人體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答，并在裸鼠卵巢癌中起到了一定的免疫調(diào)控作用[15]。腫瘤的形成與腫瘤細(xì)胞數(shù)量增加密切相關(guān)。一些天然藥物可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而實(shí)現(xiàn)抗癌。1.4.2神經(jīng)保護(hù)人參皂甙Rg1是一種具有重要作用的神經(jīng)保護(hù)藥物，它被用于治療抑郁癥，缺血性中風(fēng)，阿爾茨海默綜合癥，帕金森病等?？寡趸吧窠?jīng)抑制細(xì)胞凋亡的研究，抑制谷氨酸的炎癥毒性，防止鈣離子過(guò)量流入神經(jīng)元，維持細(xì)胞ATP水平和保護(hù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性。周婷婷等[16]通過(guò)了關(guān)于連環(huán)蛋白保護(hù)機(jī)制的Wnt/b-研究。通過(guò)連接蛋白的信號(hào)途徑可以保護(hù)帕金森病的神經(jīng)，為帕金森病的治療開(kāi)辟了新途徑。海馬內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)和大腦皮層中約50%的錐體細(xì)胞具有神經(jīng)元活性減少神經(jīng)損傷。人參皂甙Rg1還可以防止慢性應(yīng)激大鼠前額葉皮質(zhì)中受損的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子蛋白水平下降，并改善抑郁行為。人參皂甙Rg1是人參中一種主要的有效成份，它能有效地調(diào)節(jié)人體的核酸合成，并能有效地保護(hù)人體的神經(jīng)。為證實(shí)人參皂甙Rg1能有效地保護(hù)BBB，減少TBI的損害，已有學(xué)者從宏觀角度進(jìn)行了腦組織損害評(píng)分、腦組織含水率、腦組織伊文思藍(lán)滲透試驗(yàn)，結(jié)果顯示，腦組織含水量、伊文思藍(lán)的滲透率都增加，Rg1對(duì)腦組織的影響程度、腦組織含水量、伊文思藍(lán)的滲透率都明顯降低；應(yīng)用WesternBlot法從微觀層面研究了人參皂甙Rg1對(duì)TBI后繼發(fā)損害的影響。本研究顯示，Rg1對(duì)BBB及TBI有較強(qiáng)的保護(hù)及治療作用，且有一定的劑量依賴(lài)性，本試驗(yàn)以15mg/kgRg1為最佳。達(dá)瑪烷型皂苷對(duì)于神經(jīng)保護(hù)方面的功效首先集中于增強(qiáng)認(rèn)知能力，如CK和原人參三醇可改善東莨菪堿引起的小鼠認(rèn)知功能障，而人參皂苷Re可改善高脂飲食引起的認(rèn)知功能障礙。通過(guò)調(diào)節(jié)單胺類(lèi)和氨基酸能受體，人參皂苷Rb1發(fā)揮顯著的抗抑郁功效。通過(guò)不同的抑郁模型評(píng)價(jià)，人參皂甙Rb3具有明顯的抗抑郁作用。人參皂甙Rg3能減輕脂多糖引起的抑郁癥，而人參皂甙Rg2對(duì)慢性應(yīng)激抑郁癥有顯著作用。在當(dāng)代的疾病模型中，導(dǎo)致神經(jīng)損害的毒素種類(lèi)繁多。結(jié)果表明：人參皂甙Rd能有效地防止三甲基錫的神經(jīng)毒性，而人參皂甙Re可通過(guò)活化IL-6介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)抑制三甲基錫的神經(jīng)毒性，三七皂苷R1能通過(guò)提高Trx-1的Trx-1對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用，而人參二醇則能通過(guò)PI3K/Akt通路來(lái)抑制其毒性，而三七皂苷R2則能通過(guò)活化MER1/2-ERK1/2/2/2途徑對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用。另外，人參皂甙Rg1對(duì)神經(jīng)有明顯的保護(hù)作用。它能調(diào)節(jié)黑質(zhì)α-突觸核蛋白，緩解MPTP引起的帕金森病模型動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)炎，并能誘導(dǎo)TIPE-2基因在梗阻性黃疸模型中的表達(dá)[18]。人參皂苷對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷的影響作用，從而保護(hù)神經(jīng)元免受炎癥反應(yīng)、能量紊亂、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的影響，自由基產(chǎn)生和凋亡基因激活。楊俊華等發(fā)現(xiàn)，結(jié)果表明，Rg1對(duì)FZD1、PIWIL1、FoxM1等相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)有一定的影響。Tiangyang等人發(fā)現(xiàn)，Rg1可以通過(guò)降低大腦皮層中促炎細(xì)胞因子、蛋白聚合體和蛋白酶體的表達(dá)，從而抑制NF-k核轉(zhuǎn)位B和IkBPH的增殖，從而減輕腦缺血-再灌注的損害。徐慧等研究表明，人參皂苷Rb1能降低大鼠腦缺血再灌注后腦組織SOD活力，從而起到保護(hù)腦功能的作用。人參皂甙對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的促進(jìn)作用，能改善神經(jīng)性癡呆和帕金森病等的臨床表現(xiàn)。人參總皂苷Rg1,Rb1,re,Rg3，以及它們的代謝物，人參二醇[20(s)-原人參二醇]可以調(diào)節(jié)HPA軸功能，增加腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，使星狀細(xì)胞數(shù)目增加，增加腦部單胺神經(jīng)傳遞素的含量。這些功能可通過(guò)減少淀粉樣肽的形成和沉淀、減少腦內(nèi)老年斑和神經(jīng)纖維池的形成、抑制微管相關(guān)蛋白的磷酸化、抗凋亡、改善神經(jīng)可塑性、減少腦細(xì)胞對(duì)鐵的吸收、抗氧化應(yīng)激與促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。1.4.3抗糖尿病在中國(guó)古代，人參就被用于治療糖尿病，并且長(zhǎng)期以來(lái)在預(yù)防和治療慢性病方面取得了良好的效果。防止氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。它有很好的降糖作用，對(duì)糖尿病有很好的抑制作用。它在血管生成、細(xì)胞凋亡、肝細(xì)胞保護(hù)等方面也有一定的作用。結(jié)論：人參皂苷Rg1能降低人體對(duì)葡萄糖的吸收，降低體內(nèi)脂肪的生成，并能有效地抑制體內(nèi)脂質(zhì)的沉積。增強(qiáng)Akt與FoxO1的交互作用，阻斷其轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而減少胰高血糖素的應(yīng)答。結(jié)果表明：CK和人參Rb1可以通過(guò)AMPK通路減輕大鼠的糖耐量，并能明顯降低大鼠的血糖水平[22]。人參皂甙Rb2能促進(jìn)糖代謝，降低脂肪的積聚，并激活A(yù)MPK通路，起到抑制糖尿病的作用。同時(shí)，人參皂甙Rb3還能促進(jìn)AMPK信號(hào)途徑的活化，從而抑制肝糖的異生，提高其降糖效果。人參皂甙Re可以減輕高脂肪食物對(duì)C57BL/6大鼠的胰島素抵抗，還可以通過(guò)活化PPAR-γ通路、抑制TNF-α的生成來(lái)減少胰島素抵抗。高脂飲食中AMPK活化蛋白激酶能抑制HepG2細(xì)胞和高脂飲食，起到降低血糖、血脂的作用。三七皂苷R1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-29a而降低TNF-α所致胰腺β細(xì)胞凋亡及功能紊亂。1.4.4心血管保護(hù)人參皂甙是一種具有抗心律失常作用的多離子通道阻斷劑。缺血-再灌注損傷是指機(jī)體在遭受局部缺血和隨后的再灌注時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一系列的器官功能損害和微循環(huán)紊亂。心臟、腦、腎、小腸等組織器官都有可能出現(xiàn)這種情況，而心肌缺血-再灌注損傷是最為普遍的。當(dāng)心臟受到缺血和再灌注的損害時(shí)，冠狀動(dòng)脈的供血不足，會(huì)導(dǎo)致心肌的損害、心電傳導(dǎo)的異常，甚至是惡性的心律失常，甚至是心跳停止。由于缺血再灌注損傷，導(dǎo)致缺血再灌注損傷，導(dǎo)致心肌功能衰竭，導(dǎo)致心悸、胸痛。人參皂甙補(bǔ)益氣血，滋養(yǎng)心肌，保持血管和心肌的正常功能，減少心臟的損害。1.4.5抗炎作用炎性反應(yīng)與許多疾病有關(guān)，達(dá)瑪烷類(lèi)皂甙具有不同的抗炎活性。例如，CK能降低COX2的抗炎、人參皂甙Rb1對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞有明顯的抑制作用；人參皂甙F2可通過(guò)NF-κB通路抑制HEK-293細(xì)胞的凋亡，從而降低HEK-293的發(fā)生。人參皂苷Rb2和Rc都能提高GPR120的表達(dá)，提高其對(duì)LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞的抗炎效果。人參皂甙Rh2通過(guò)調(diào)控NF-κB在哮喘模型中活化，從而緩解了過(guò)敏性氣道炎癥，而人參皂甙Rh1、人參三醇對(duì)TNBS引起的大鼠結(jié)腸炎有明顯的抑制作用。1.4.6肝腎保護(hù)人參皂苷Rg1也廣泛用于肝臟疾病。肝臟在外源生物的代謝中起著重要作用。當(dāng)肝臟受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、變性、壞死、肝纖維化和功能障礙。人參皂苷Rg1通過(guò)減少細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，保護(hù)肝臟免受缺血再灌注損傷和2型糖尿病，以及保護(hù)四氯化碳引起的急性肝損傷。人參皂苷Rb3通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬和抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，對(duì)順鉑引起的腎臟損害有一定的保護(hù)作用。人參皂甙Re對(duì)LLC-PK1的腎臟有明顯的毒性效應(yīng)。三七皂苷R1對(duì)大鼠腎臟的損害有一定的抑制作用。同時(shí)，它還能通過(guò)調(diào)控Kltho/TGFβ1/Samd信號(hào)途徑對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性腎損害有一定的作用。CK、人參皂甙Rh1對(duì)無(wú)酒精性脂肪病有明顯的改善作用。人參皂甙Rg1在抑制TLR4信號(hào)途徑的作用下，能抑制LLR4信號(hào)途徑引起的急性肝臟損害，并能通過(guò)抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和活性氧產(chǎn)生而減輕肝纖維化。1.4.7抗氧化從人參中提煉出的珍貴的皂甙和次生糖甙被注入了模仿太空壓力的老鼠。這些珍稀的皂苷、次皂苷對(duì)模擬太空飛行應(yīng)激大鼠SOD、過(guò)氧化氫酶活力、TAOC、MDA含量明顯下降。結(jié)果表明，人參皂甙能顯著降低丙二醛濃度，延緩氧化應(yīng)激。此外，人參皂甙Rg1還能改善催化劑、超氧化物及GSHPX，并能顯著降低Oka誘發(fā)的PC12神經(jīng)元ROS的累積，從而保護(hù)神經(jīng)元；人參皂甙Rg2能增加大鼠的SOD活力，并能顯著降低大鼠的MDA含量，從而減輕大鼠的氧化損傷，并能明顯地抑制其體內(nèi)的XOD活力，從根本上抑制其過(guò)氧化自由基。2實(shí)驗(yàn)材料與儀器2.1試劑與材料材料：人參葉于2020年3月購(gòu)于安徽菌啟健康科技有限公司，原產(chǎn)地中國(guó)吉林。其他所用試劑如表1所示。表1主要試劑及廠家試劑廠家無(wú)水乙醇（分析純）安徽安特食品股份有限公司亞硝酸鈉（分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司硝酸鋁（分析純）山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司氫氧化鈉（分析純）西隴科學(xué)股份有限公司蘆丁北京索萊寶科技有限公司1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（dpph）上海麥克林生化科技有限公司2.2儀器與設(shè)備表2主要儀器及廠家儀器廠家多功能粉碎機(jī)永康市鉑歐五金制品有限公司電子天平海特勒-托利多儀器上海有限公司液晶超聲波清洗機(jī)昆山潔力美超聲儀器有限公司SHZ-D(3)型循環(huán)水真空泵鞏義市英峪高科儀器廠恒溫水浴鍋鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司可見(jiàn)光分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司3實(shí)驗(yàn)方法3.1樣品的制備將買(mǎi)來(lái)的人參葉的莖桿去掉，稱(chēng)取500克人參葉，將其粉碎，時(shí)間為10秒，然后用80目篩將得到的人參葉粉末過(guò)濾，密封保存。3.2人參葉總黃酮含量的測(cè)定3.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制參照田建華等人的方法[10]采用不同濃度的蘆丁溶液，在510nm下進(jìn)行吸光度的測(cè)量，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，以吸收為縱坐標(biāo)，繪出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。3.2.2人參葉總黃酮提取得率的測(cè)定用紫外光分光光度計(jì)對(duì)黃酮的吸收進(jìn)行了分析，并用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的有關(guān)公式求出了總黃酮的含量，并按以下公式求出了總黃酮的浸出率：公式中Y表示人參葉總黃酮的提取速率（mg/g),C表示質(zhì)量濃度（mg/ml),N表示稀釋數(shù)，V表示萃取液的體積（ml),M表示人參葉片的粉末重量（g）。3.3人參葉總黃酮提取方式的篩選首先，在樊志強(qiáng)等人的基礎(chǔ)上，對(duì)超聲波、熱回流、微波三種提取工藝進(jìn)行了考察。3.3.1提取溶劑的篩選采用超聲波輔助萃取，以不同的蒸餾水、40%乙醇濃度和70%乙醇濃度對(duì)總黃酮的提取效果進(jìn)行了研究。按照樊志強(qiáng)（10）等人的實(shí)驗(yàn)方法，將參葉粉2.5克的粉狀樣品，在20℃下超聲波萃取30分鐘，然后在60℃下進(jìn)行濃縮，定體積，冷凍保存。用總黃酮的方法對(duì)提取物的吸光率進(jìn)行篩選。3.3.2超聲輔助提取人參葉總黃酮將2.5g的人參葉干燥粉精確稱(chēng)取于圓錐形容器內(nèi)，將干燥的人參葉片粉末溶于相應(yīng)的溶劑中，密封10分鐘，然后根據(jù)相應(yīng)的溫度進(jìn)行超聲波萃取，然后在60℃下進(jìn)行萃取，在60℃下進(jìn)行浸膏處理，然后密封保存。3.3.3微波法提取人參葉總黃酮將干燥的人參葉的粉末精確稱(chēng)取7g加入到燒杯中，然后將其加入相應(yīng)的溶劑中，密封浸泡10分鐘，然后將其放入三個(gè)燒瓶中，根據(jù)相應(yīng)的要求進(jìn)行微波萃取，然后在60℃下進(jìn)行真空濃縮，將萃取液在60℃下進(jìn)行浸漬，然后密封保存。3.3.4熱回流法提取人參葉總黃酮將12.5克的人參葉干燥粉末精確稱(chēng)取于燒杯內(nèi)，將其干燥后的參葉粉末溶解在相應(yīng)的溶劑中，密封浸泡10分鐘，然后將其放入圓形燒瓶中，根據(jù)相應(yīng)的溫度，在60℃下加熱，在60℃下進(jìn)行一定的回流，然后將萃取液放入60℃的鍋中制成浸膏，最后密封保存。3.4超聲提取人參葉總黃酮單因素試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用超聲波提取率高的方法提取人參葉中的總黃酮，并對(duì)乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度等進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其提取效果進(jìn)行了分析對(duì)比。3.4.1乙醇濃度對(duì)總黃酮提取得率的影響首先參考田建華[10]提取超聲總黃酮的方法，提取溫度和時(shí)間保持一致，考察乙醇濃度為20%、40%、60%、80%時(shí)對(duì)人參葉總黃酮提取率的影響。3.4.2提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的影響提取時(shí)間為30、40、50分鐘、60分鐘、70分鐘，提取時(shí)間在很大程度上對(duì)人參總黃酮的提取效果有影響。3.4.3提取溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響固定了15℃、30℃、45℃、60℃和75℃條件下提取人參總黃酮的最佳工藝條件。3.5超聲提取人參葉總黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)參照2.2單因子分析結(jié)果，采用Designexpert8軟件，以乙醇A濃度、B提取時(shí)間、C溫度為反應(yīng)因子，以人參葉中總黃酮提取率為反應(yīng)因子，采用三因子三水平BOX-Beknke法測(cè)定[11]。測(cè)試因子的水平見(jiàn)表3。表3響應(yīng)面因素水平表水平LevelA乙醇濃度Ethanolconcentration（%）B提取時(shí)間Extractiontime（min）C提取溫度Extractiontemperature（℃）-1204030040504516060603.6提取液抗氧化活性試驗(yàn)3.6.1DPPH的配制將2毫克DPPH稱(chēng)入并溶于95%酒精中，將其定容到50毫升褐色容量瓶子中，待用。3.6.2測(cè)定人參提取液清除率按照反應(yīng)面談結(jié)果，提取了人參葉粉，用42號(hào)濾紙濾出人參葉粉，用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器旋干燥，以25毫克/毫升的質(zhì)量濃度30%乙醇進(jìn)行復(fù)溶。對(duì)不同濃度的萃取溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)妹笜?biāo)儀測(cè)定其對(duì)自由基的清除作用。用同樣的方法將Vc溶液作為正比。對(duì)DPPH自由基進(jìn)行了清除活性測(cè)試[12]。用100微升的DPPH與100微升的人參葉浸提液或Vc液進(jìn)行比較，用無(wú)水乙醇作對(duì)照。將該混合物置于暗室內(nèi)進(jìn)行30分鐘的反應(yīng)，用517nm的酶標(biāo)計(jì)測(cè)定吸收率。計(jì)算其對(duì)DPPH自由基的清除作用，其表達(dá)式如下：A0為空白對(duì)照的吸光度，A1為參葉浸膏的吸光度。4結(jié)果與分析4.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)對(duì)上述方法的分析，我們得到了蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在該圖中，該曲線(xiàn)的相關(guān)方程式是：Y=6.7098×-0.0002,R2=0.9971，因此，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)具有較好的線(xiàn)性關(guān)系。圖1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)4.2人參葉總黃酮方法得率對(duì)比4.2.1提取溶劑預(yù)試驗(yàn)將三種不同的溶劑按相關(guān)的方法進(jìn)行了初步的對(duì)比，得到了相應(yīng)的結(jié)果。由該圖可知，在乙醇濃度為40%的情況下，在蒸餾水和70%乙醇的濃度下，萃取的溶劑為40%。圖2不同溶劑對(duì)人參總黃酮提取得率的影響4.2.2提取方法的篩選通過(guò)對(duì)超聲、微波、回流三種工藝的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)超聲、微波、回流等工藝對(duì)黃酮的提取效果優(yōu)于其它兩種工藝，因此，采用超聲波法進(jìn)行后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)。表4三種路線(xiàn)提取得率比較路線(xiàn)methods條件Conditions提取得率Totalflavonoidsextractionamount（mg/g）乙醇濃度Ethanolconcentration（%）提取溫度Extractiontemperature（℃）提取時(shí)間Extractiontime（min）超聲波提取Ultrasonic4030404.65熱回流提取Hotreflux4030403.91微波提取Microwave4030403.46圖3不同提取路線(xiàn)對(duì)人參總黃酮提取得率的影響4.3單因素試驗(yàn)在對(duì)不同的提取路線(xiàn)進(jìn)行了初步的篩選后，選擇了超聲提取工藝，并用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉的方法，對(duì)不同的提取方法進(jìn)行了比較：4.3.1乙醇濃度對(duì)人參葉總黃酮提取得率的影響通過(guò)對(duì)不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行分析，結(jié)合以前的萃取溶劑預(yù)試驗(yàn)，得到了黃酮的提取率。從圖表中可以看出，隨著酒精含量的增加，人參葉中總黃酮的提取率也隨之增加，其中40%為最高，隨后的實(shí)驗(yàn)中，隨著酒精含量的增加，總黃酮的提取率顯著下降，80%時(shí)含量最低?？赡苁蔷凭刻叱恋砥渌镔|(zhì)對(duì)總黃酮的產(chǎn)率有一定的影響[13]。綜合考慮，選擇20%,40%,60%三種酒精濃度，對(duì)后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化研究。圖4不同乙醇濃度對(duì)人參葉總黃酮提取得率的影響4.3.2提取時(shí)間對(duì)人參葉總黃酮提取得率的影響對(duì)不同的超聲提取時(shí)間進(jìn)行了研究，得到了黃酮的提取速率。由圖表可知，隨著超聲波作用時(shí)間的增加，總黃酮的提取率在50分鐘內(nèi)達(dá)到最高，而在隨后的實(shí)驗(yàn)中，總黃酮的得率隨時(shí)間的推移而下降，而在30分鐘內(nèi)，總黃酮的得率最低?？赡苁怯捎谔崛r(shí)間太長(zhǎng)導(dǎo)致了總黃酮的分解[14]。綜合選擇40分鐘、50分鐘、60分鐘三種不同的萃取時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以尋求最佳工藝條件。圖5不同時(shí)間對(duì)人參葉總黃酮提取得率的影響4.3.3提取溫度對(duì)人參葉總黃酮提取得率的影響對(duì)不同萃取溫度進(jìn)行了研究，得到了黃酮的提取率。結(jié)果表明，溫度越高，總黃酮的提取率越高，在45℃下提取率越高，而在隨后的實(shí)驗(yàn)中，總黃酮的提取率隨溫度的提高而下降，總的提取率在15℃時(shí)下降，這主要是由于溫度升高引起的總黃酮分解[15]。從30℃、45℃和60℃三個(gè)不同的溫度下進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，探討了最優(yōu)反應(yīng)條件。圖6不同溫度對(duì)人參葉總黃酮提取得率的影響4.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及分析4.4.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果采用Designexpert8軟件設(shè)計(jì)了人參葉中的總黃酮，其響應(yīng)面的結(jié)果如表5所示。表5響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果實(shí)驗(yàn)組號(hào)乙醇濃度提取溫度提取時(shí)間黃酮提取量NoEthanolconcentrationExtractiontemperatureExtractiontimeTotalflavonoidsextractionamount（%）（℃）（min）（mg/g）10-1-15.04210-15.9430007.6340007.475-10-14.62601-16.467-1014.7881014.4791104.84100-115.38110007.2912-1-104.3013-1104.54140115.26150007.60160007.36171-104.684.4.2響應(yīng)面顯著性通過(guò)Designexpert8軟件對(duì)人參葉總黃酮對(duì)乙醇濃度（A）、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)進(jìn)行多元回歸分析二次回歸方程為：Y=7.47+0.21A+0.21B-0.27C-0.020AB-0.41AC-0.39BC-1.73A2-1.15B2-0.79C2R2=0.9912表6響應(yīng)面方差分析表方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性SourceSumofSquaresdfMeansquareFvaluePvalueSignificance模型Model25.4792.8387.2<0.0001***A0.3610.36110.0128*B0.3610.3611.130.0125*C0.5910.5918.140.0038**AB1.60E-0311.60E-030.0490.8306AC0.6610.6620.470.0027**BC0.5910.5918.270.0037**A212.62112.62388.86<0.0001***B25.5615.56171.21<0.0001***C22.612.680.2<0.0001***殘差Residual0.2370.032失擬LackofFit0.1430.0472.150.2369Notsignificant純誤差PureError0.08740.022總誤差CorTotal25.716R20.9912R2ADJ0.9798注：***表示P<0.001，差異極顯著；**表示P<0.01，差異較顯著；*表示P<0.05，差異顯著。方差分析見(jiàn)表6，由表可知此模型的F值為87.20，P值＜0.0001說(shuō)明回歸模型為極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.2369＞0.05為不顯著水平，說(shuō)明模型的試驗(yàn)誤差小，模型總體可靠；R2=0.9912，R2ADJ=0.9798即表示該模型的擬合程度較好，能較好的預(yù)測(cè)各因素和人參葉總黃酮提取得率之間的關(guān)系，從而確定人參葉總黃酮最佳提取工藝條件。一次項(xiàng)中提取溫度較顯著，提取時(shí)間和乙醇濃度均為顯著水平，二次項(xiàng)均為較顯著水平，交互項(xiàng)可看出溫度與乙醇濃度以及時(shí)間對(duì)提取得率的影響較顯著[16]。同時(shí)一次項(xiàng)可得出對(duì)人參葉總黃酮提取得率影響大小依次是溫度＞時(shí)間＞乙醇濃度。4.4.3響應(yīng)面因素交互分析乙醇濃度與提取溫度、乙醇濃度與提取時(shí)間以及提取溫度和提取時(shí)間的兩因素交互的響應(yīng)面圖如圖7所示。圖7因素間的交互作用對(duì)人參葉總黃酮提取得率的等高線(xiàn)和響應(yīng)面圖從表面上可以看到各因子間的相互關(guān)系和顯著性，其中，斜坡能反映反應(yīng)面各因子對(duì)參葉總黃酮提取速率的影響，而等高線(xiàn)則的相關(guān)形態(tài)則表明各因子間的交互作用是否明顯，橢圓的差異較大，而圓的差異不明顯。從不同的角度，可以得出不同濃度、不同萃取溫度對(duì)不同萃取條件下的人參葉總黃酮的提取速率有明顯的影響[17]。4.4.4人參葉最佳提取工藝結(jié)果通過(guò)反應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)，得出了以41.73%的乙醇、46.95℃、47.74分鐘為最佳提取工藝條件，該工藝條件下，人參葉中總黃酮的提取率為7.52mg/g。4.4.4人參葉最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)從反應(yīng)面的最佳萃取效果和實(shí)際情況，將萃取條件設(shè)定為42%的酒精濃度，47℃的溫度，48分鐘的時(shí)間，經(jīng)三個(gè)平行的實(shí)驗(yàn)，得出了人參葉中的總黃酮含量7.61mg/g和理論7.52mg/g的差異，表明該模型的總體數(shù)據(jù)是可信的。4.5人參葉提取液抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果圖8人參葉提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力圖8顯示了人參葉清除DPPH的能力。結(jié)果表明，不同濃度的參葉對(duì)DPPH的清除作用和DPPH的去除作用存在一定的相關(guān)性。結(jié)果表明：人參葉浸膏對(duì)DPPH自由基的清除作用與其濃度有顯著的相關(guān)性。從0.2毫克/毫升到0.6毫克/毫升的浸出量，在很大程度上由30%上升到61%，整體呈快速上升的態(tài)勢(shì)。Vc組的清除率總體上比較平穩(wěn)，從0.2mg/mL到0.6mg/ml，從76%上升到83%。結(jié)果表明：人參葉的抗氧化性與濃度呈顯著的正相關(guān)，且呈顯著的線(xiàn)性關(guān)系。5結(jié)論結(jié)果表明，不同乙醇濃度、溫度、時(shí)間條件下，提取葉中總黃酮的提取率也不同，采用反應(yīng)面試方法，建立了乙醇濃度、溫度和時(shí)間的三因子三水平模型，并將各因素的相互作用和對(duì)提取總黃酮的提取效果進(jìn)行了分析，得到了最佳提取條件：乙醇濃度42%，溫度47℃，48min,48min，提取率最高。另外，對(duì)人參葉浸提液進(jìn)行了抗氧化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：人參葉浸提液的抗氧化能力隨濃度的增加而增加，從0.0mg/ml-0.6mg/ml的清除率由30%上升到61%，總體上呈快速上升的趨勢(shì)，呈正線(xiàn)性關(guān)系，表明人參葉浸膏具有顯著的抗氧化性。參考文獻(xiàn)[1]陳英杰,崔承彬.人參葉中微量新皂甙—La的分離與鑒定[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1990,25(5):379-381.[2]張紹林,陳英杰.人參葉中的微量新皂甙[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1989,024(011):877-879.[3]吳錦忠,易駿.人參屬四種植物中氨基酸和無(wú)機(jī)元素的比較研究[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1992,017(003):230-232.[4]辜旭輝,于文濤,欒春海,等.人參,西洋參種質(zhì)資源的生態(tài)環(huán)境和分布[J].人參研究,2006,18(002):000004-7.[5]金鑫.山中珍品話(huà)人參[J].生態(tài)文化,2003,000(001):35-38.[6]李清民,王曉中,周洪玉,等.HPLC法測(cè)定人參葉中人參黃酮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2010,48(05):865-867.[7]趙雨晴,王寶慶,徐漢,等.醉魚(yú)草總黃酮的提取及抗氧化活性研究[J/OL].化學(xué)試劑:1-13[2021-05-17].[8]趙一暉,張培軍,戰(zhàn)英,等.紫外分光光度法測(cè)定人參葉茶中人參總皂苷的方法學(xué)研究[J].中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué),2012,11(01):63-64.[9]樊志強(qiáng).銀杏葉中總黃酮的提取工藝研究進(jìn)展[J].當(dāng)代農(nóng)機(jī),2020(10):78-80.[10]田建華,張春媛,魏璐.沙棘果渣總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2021,33(01):6