生物信息學(xué)軟件及使用技巧市公開課一等獎百校聯(lián)賽特等獎?wù)n件

生物信息學(xué)軟件及使用技巧BioinformaticsBasics吳元明講師第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部wuym@第1頁生物信息學(xué)軟件分類單機分析軟件：如winplas在線分析軟件:如webcutter生物學(xué)數(shù)據(jù)庫:如NCBI,DDBJ,EBI第2頁生物信息學(xué)軟件意義分析和處理試驗數(shù)據(jù)和公共數(shù)據(jù)，加緊研究進度，縮短科研時間。提醒、指導(dǎo)、替換試驗操作，利用對試驗數(shù)據(jù)分析所得結(jié)論設(shè)計下一階段試驗。用計算機管理試驗數(shù)據(jù)。BioinformaticsBasics第3頁生物學(xué)軟件慣用功效（核酸類）DNA序列片斷拼接----ContigExpress分析mRNA開放讀框限制性酶切位點分析DNA模擬電泳PCR引物設(shè)計RNA二級結(jié)構(gòu)分析BioinformaticsBasics第4頁生物學(xué)軟件慣用功效（蛋白類）蛋白一級結(jié)構(gòu)分析（氨基酸分析）蛋白二級結(jié)構(gòu)分析（結(jié)構(gòu)域分析）蛋白三級結(jié)構(gòu)分析（空間結(jié)構(gòu)分析）BioinformaticsBasics第5頁生物學(xué)軟件慣用功效（共同類）DNA、蛋白質(zhì)序列同源分析進化樹構(gòu)建BioinformaticsBasics生物學(xué)軟件慣用功效（其它類）質(zhì)粒繪圖類圖象處理軟件第6頁一、DNA序列片斷拼接（電子基因克隆）取得感興趣EST，在dbEST數(shù)據(jù)庫中找出EST最有路徑是尋找同源序列，標(biāo)準(zhǔn)：長度≥100bp，同源性50%以上、85%以下。然后將檢出序列組裝為重合群（contig），以此重合群為被檢序列，重復(fù)進行BLAST檢索與序列組裝，延伸重合樣系列，重復(fù)以上過程，直到?jīng)]有更多重合EST檢出或者說重合群序列不能繼續(xù)延伸，有時可取得全長基因編碼序列。再與GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫進行相同性檢測，假如有準(zhǔn)確匹配基因，將EST序列數(shù)據(jù)據(jù)EST六種閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)，接著與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比較分析。第7頁VectorNTI5.2---contigExpress第8頁二、分析mRNA開放讀框（一)5’-UTR結(jié)構(gòu)

1、mRNA5’端m7G帽有增強翻譯水平作用．

2、“上游AUG密碼子”(位于起始AUG上游其它AUG密碼子)存在往往抑制下游開放讀框翻譯效率．

3、起始AUG旁側(cè)序列對翻譯效率影響．

Kozak序列：GCCAUGG(二)3’-UTR結(jié)構(gòu)

1．poly(A)尾增加翻譯效率

2．富含UA序列抑制翻譯。

第9頁二、分析mRNA開放讀框取得盡可能長mRNA序列。分析可能讀框（六種）。軟件：VectorNTI，Omiga等。在線:（/tools/dna.html）選取最可能一個?？词欠穹细鞣N條件。分析步驟：第10頁當(dāng)前應(yīng)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測算法同源預(yù)測(一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu))結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)相對比（DALI算法）當(dāng)前最先進結(jié)構(gòu)預(yù)測方法： 結(jié)構(gòu)類識別（foldrecognition）先建立一個已知結(jié)構(gòu)類數(shù)據(jù)庫（foldlibrary)，將待測序列“穿過”該數(shù)據(jù)庫組成座標(biāo)，并依據(jù)事先確定物理限制，逐一位置移動（threading，sequence-structurealignment)，并一個函數(shù)（sequence-structurefitnessalignment)判斷序列與結(jié)構(gòu)類符合程度，找出未知序列在目標(biāo)結(jié)構(gòu)上能量最優(yōu)和構(gòu)象最穩(wěn)固比對位置。對計算機要求很高。第11頁Cn3D2.5顯示1EQFA鏈三維結(jié)構(gòu)第12頁十一、質(zhì)粒繪圖winplasPlasmidprocessorDMUPbetaVectorNTI第13頁Winplas2.6質(zhì)粒構(gòu)建第14頁七、DNA與蛋白質(zhì)序列同源分析（進化樹構(gòu)建）個體與數(shù)據(jù)庫比較。兩個或兩個以上個體比較。不一樣情況：internet網(wǎng)絡(luò)。如，NCBIBLAST;ExPASyAlignment.軟件。如，VecotrNTI分析方法：第15頁VectorNTISuitAlignX同源比較—主窗口第16頁VectorNTISuit同源比較—進化樹第17頁八、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析氨基酸組成。PIMW亞細(xì)胞定位包含：internet網(wǎng)絡(luò)。如，ExPASyprimarystructureanalysis

topologyprediction.軟件。如，VecotrNTI,Antheprot分析方法：第18頁Omiga2.0ORFMap第19頁三、限制性酶切位點分析一個能識別特殊，短核苷酸序列，并在DNA一些位點上切割蛋白質(zhì)。細(xì)菌包含了400種這么酶，能識別和切割100種以上不一樣DNA序列。

如：EcoRI識別序列定義：GAATTCGTTAAC第20頁三、限制性酶切位點分析找到待分析核酸序列。利用VectorNTI軟件分析。利用webcutter2.0在線分析。（/cutter）分析步驟：第21頁四、DNA模擬電泳找到待分析核酸序列。利用VectorNTI或其它軟件分析。分析步驟：DNA模擬電泳含有一定試驗預(yù)示功效。模擬電泳不能作為試驗結(jié)果或依據(jù)。注意：第22頁VectorNTISuit5.5模擬電泳第23頁GeneConstructionKit2.0模擬電泳第24頁五、PCR引物設(shè)計（雜交探針設(shè)計）引物設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)引物要跟模板緊密結(jié)合；引物與引物之間不能有穩(wěn)定二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在；引物不能在別非目標(biāo)位點引發(fā)高效DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。第25頁如：引物長度（primerlength），產(chǎn)物長度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，ΔG值(internalstability)，引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin），錯誤引發(fā)位點（falseprimingsite），引物及產(chǎn)物GC含量（composition），有時還要對引物進行修飾，如增加限制酶切點，引進突變等。引物設(shè)計需要考慮原因第26頁引物設(shè)計關(guān)鍵點普通引物長度為16-23bp，慣用長度為18-21bp，過長或過短都不適當(dāng)。引物3’端堿基普通不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點引發(fā)效率相對比較高，而其它三種堿基錯誤引發(fā)效率相對小一些。引物GC含量普通為45-55%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物GC含量不能相差太大。引物所對應(yīng)模板序列Tm值最好在72℃左右，當(dāng)然因為模板序列本身組成決定其Tm值可能偏低或偏高，可依據(jù)詳細(xì)情況靈活利用。第27頁引物設(shè)計關(guān)鍵點ΔG值反應(yīng)了引物與模板結(jié)合強弱程度，也是一個主要引物評價指標(biāo)。普通情況下，在Oligo5.0軟件ΔG值窗口中，引物ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間部分ΔG值較高，而3’端ΔG值相對較低，且不要超出9（ΔG值為負(fù)值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可預(yù)防錯誤引發(fā)。其原理，引物與模板應(yīng)含有較高結(jié)合能量，這么有利于引物與模板序列整合，所以5’端與中間段ΔG值應(yīng)較高，而3’端ΔG值影響DNA聚合酶對模板DNA解鏈，過高則不利于這一步驟。第28頁引物設(shè)計關(guān)鍵點可能錯誤引發(fā)位點決定于引物序列組成與模板序列組成相同性，相同性高則錯誤引發(fā)率高，錯誤引發(fā)引發(fā)率普通不要高過100，最好沒有錯誤引發(fā)位點，如此能夠確保不出非目標(biāo)產(chǎn)物假帶。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)能量普通不要超出4.5，不然輕易產(chǎn)生引物二聚體帶，且會降低引物濃度從而造成PCR正常反應(yīng)不能進行。對引物修飾普通是增加酶切位點，應(yīng)參考載體限制酶識別序列確定，經(jīng)常對上下游引物修飾序列選取不一樣限制酶識別序列，以有利于以后工作。

第29頁關(guān)于引物自動搜索和評價分析推薦使用自動搜索軟件：PrimerPremier5.0推薦使用引物評價軟件：Oligo5/6第30頁OLIGO5.0PCR引物設(shè)計第31頁六、RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測主要軟件：

DNAsis,RNAstructure,RNAdraw

ViennaRNAPackageRDFolder是RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Web服務(wù)器

（北京大學(xué)生物信息學(xué)中心）意義：

分析RNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，為可能（酶、核酸）作用位點分析等提供依據(jù)。第32頁DNASIS2.5RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測第33頁DNASIS2.5tRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測第34頁RNAStructure3.5RNA二結(jié)構(gòu)預(yù)測第35頁Antheprot5.0預(yù)測蛋白跨膜區(qū)域第36頁Antheprot5.0預(yù)測信號肽斷裂點第37頁九、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析Helix,Sheet,Turn,Coil包含：internet網(wǎng)絡(luò)。如，ExPASysecondarystructureanalysis

軟件。如，DNAsis,DNAstar,VecotrNTI分析方法：第38頁DNASIS2.5蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測第39頁DnaStar之Protean對dif14蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Bioinformatics