細(xì)胞及培養(yǎng)試劑中細(xì)菌、真菌快速檢測(cè)通則TaqMan探針熒光定量PCR法

本文件定義了規(guī)定了細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)菌、真菌快速檢測(cè)TaqMan熒光定量PCR方法的下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條生物技術(shù)核酸靶序列定量方法的性能評(píng)價(jià)要求qPCR法和dPCR法非必需氨基酸、生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、谷氨以細(xì)菌16SrRNA、真菌18SrRNA基因保守序列為6.1除特別說明外,所有試劑均為分析純或生化試劑,實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的和目的基因擴(kuò)增長(zhǎng)度應(yīng)滿足GB/T42077的相關(guān)要求。引物和探針設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)充分考慮細(xì)菌真2)合成成引物和探針,加雙蒸水配制成100μmol3)如使用多重PCR進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)時(shí)，可通過設(shè)置不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記的細(xì)菌探針注：熒光基團(tuán)的波長(zhǎng)范圍呈正態(tài)分布的，有一定的帶寬，不同熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)會(huì)有一定的交集，因此，在同時(shí)選擇多個(gè)熒光基團(tuán)時(shí)，要注意盡量選擇波長(zhǎng)差或具有同等效果的商品化產(chǎn)品，陽(yáng)性菌株應(yīng)在驗(yàn)證合7.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀：應(yīng)符合GB/T42753的要求，在計(jì)量有效期內(nèi)，且應(yīng)含有T7.2離心機(jī)：轉(zhuǎn)速范圍應(yīng)包含2000r/min~230008.1.1供試品的檢驗(yàn)量可參考《中華人8.1.2取樣和制樣應(yīng)滿足相應(yīng)核酸提取試劑盒中說明書中質(zhì)控和適用性要求。細(xì)胞樣品可采用去除宿主DNA的前處理，以降低后續(xù)提取中過量宿主DNA對(duì)細(xì)菌、真菌基因組提取與擴(kuò)8.1.3DNA提取過程中所在環(huán)境和所使用的試劑雖經(jīng)過滅菌處理，但后DNA片段的殘留。這些DNA殘留可能會(huì)產(chǎn)生本底擴(kuò)增，可選用適當(dāng)?shù)奶幚矸绞剑ㄈ绡B氮溴化丙錠法或WS/T230中的光化學(xué)滅活法）對(duì)核酸提取試劑進(jìn)行前處理，來(lái)降低相8.2.1陽(yáng)性提取對(duì)照：使用含有滅活細(xì)菌陽(yáng)性質(zhì)控、滅活真菌陽(yáng)性質(zhì)控的樣本，從樣本處理8.2.2空白提取對(duì)照：以有水或緩沖液代替樣本進(jìn)行提取，與供試品平行8.2.3陽(yáng)性擴(kuò)增對(duì)照：以具有良好目的片段擴(kuò)增性能的核酸溶液（如細(xì)菌和真菌的基因組DNA或含目的擴(kuò)增序列的質(zhì)粒溶液等）為模板進(jìn)行擴(kuò)增的反應(yīng)。8.3.1按照擴(kuò)增試劑說用說明配置反應(yīng)體系，反如使用2×qPCR預(yù)混液和50×ROX50×ROX0.4μl注:反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行適當(dāng)8.3.2根據(jù)不同型號(hào)實(shí)時(shí)熒光PCR儀和所選擴(kuò)增試劑的使用說明設(shè)置實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程8.4檢出限應(yīng)按照GB/T40277的要求計(jì)算給--陽(yáng)性提取對(duì)照：16S或18S靶標(biāo)基因擴(kuò)增未檢出或C--陽(yáng)性擴(kuò)增對(duì)照：16S或18S靶標(biāo)基因擴(kuò)增未檢出或C--測(cè)試樣品16S靶標(biāo)基因擴(kuò)增Ct值均>30,且與空白提取對(duì)照和陰性擴(kuò)增對(duì)照的CT值相比無(wú)顯著差異或Ct值顯著升高，則可判定該樣品的細(xì)菌含量--測(cè)試樣品16S靶標(biāo)基因擴(kuò)增Ct值均≤30,或與空白提取對(duì)照和陰性擴(kuò)增對(duì)照的CT值相比顯--測(cè)試樣品18S靶標(biāo)基因擴(kuò)增Ct值均>30,且與空白提取對(duì)照和陰性擴(kuò)增對(duì)照的CT值相比無(wú)顯--測(cè)試樣品18S靶標(biāo)基因擴(kuò)增Ct值均≤30,或與空白提取對(duì)照和陰性擴(kuò)增對(duì)照的CT值相比顯a)樣本：類型、批號(hào)、來(lái)源;b)檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)地點(diǎn)、檢測(cè)人員d)試劑：包括名稱、來(lái)源、批號(hào)g)檢測(cè)結(jié)果及原始數(shù)據(jù)保存路徑b)檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)地點(diǎn)、檢測(cè)人員f)檢測(cè)結(jié)果與經(jīng)過驗(yàn)證的方法檢出限稱GRAM-GGACTACCAGGGTATCTAAAGGCAGCAGTDRGGAATAGAGTTTGATCMTGGCTCAGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAGGGACTAC(C/T/A)AGGGTTACGGGAGGCAGCAGTTTACCCGCAGAATAAGCACCGGCTEnviron.Microbiol.molecularbroad-rangediagnosisdiagnosis.JApplMicrneutropeniabyreal-timePCuniversalprimersandpreactionforrapidbroad-s稱FFungiQuant:Abroad-coveragefquantitativereal-timePCMicrobiology2012TACTTTCGATCGTAGGATAGThePathologicalSoATTGGAGGGCAAGTCTGGTGneutropeniabyreal-timePuniversalprimersandprobATCGATGAAGAACGYAGC