納米技術(shù) 利用紫外圓二色性評(píng)估納米材料引起的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化 征求意見(jiàn)稿

1GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021納米技術(shù)利用紫外圓二色性評(píng)估與納米材料作用的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)本文件規(guī)定了利用紫外圓二色（UV-CD）光譜法測(cè)定蛋白質(zhì)與納米材料相互作用引起的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的測(cè)量方案和測(cè)試條件。本文件不適用于表征無(wú)序蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ISO/TS80004-1納米科技術(shù)語(yǔ)第1部分：核心術(shù)語(yǔ)（Nanotechnologies—Vocabulary—Part1:Coreterms）注：GB/T30544.1—2014納米科技術(shù)語(yǔ)第1部分：核心ISO/TS80004-2納米科技術(shù)語(yǔ)第2部分：納米物體（Nanotechnologies—Vocabulary—Part2:Nano-objects）ISO/TS80004-4納米科技術(shù)語(yǔ)第4部分：納米結(jié)構(gòu)材料（Nanotechnologies—Vocabulary—Part4:Nanostructuredmaterials）注：GB/T30544.4—2019納米科技術(shù)語(yǔ)第4部分：納米結(jié)構(gòu)ISO/TS80004-6納米科技術(shù)語(yǔ)第6部分：納米物體表征（Nanotechnologies—Vocabulary—Part6:Nano-objectcharacterization）注：GB/T30544.6—2016納米科技術(shù)語(yǔ)第6部分：納米物體表3術(shù)語(yǔ)和定義ISO/TS80004-1、ISO/TS80004-2、ISO/TS80004-4和ISO/TS80004-6界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1納米顆粒nanoparticle；NP三個(gè)維度的外部尺寸都在納米尺度的納米物體，納米物體的最長(zhǎng)和最短軸的長(zhǎng)度沒(méi)有明顯差距。注：如果納米物體最長(zhǎng)軸和最短軸的長(zhǎng)度差別顯著（大于3）時(shí)，應(yīng)當(dāng)用納米纖維和納米片來(lái)表示納米顆粒。[來(lái)源：ISO/TS80004-2：2015，4.4]3.2納米材料nanomaterial任一外部維度、內(nèi)部或表面結(jié)構(gòu)處于納米尺度的材料。2GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021[來(lái)源：ISO/TS80004-1：2015，2.4]3.3圓二色性circulardichroism對(duì)左旋和右旋圓偏振光吸收差異的光學(xué)效應(yīng)。4縮略語(yǔ)以下縮略語(yǔ)適用于本文件。AgNP：銀納米顆粒（silvernanoparticle）AuNP：金納米顆粒（goldnanoparticle）AU：吸光度單位（absorbanceunit）BSA：牛血清白蛋白（bovineserumalbumin）CD：圓二色性（circulardichroism）DLS：動(dòng)態(tài)光散射（dynamiclightscattering）HSA：人血清白蛋白（humanserumalbumin）MRE：平均殘基橢圓率（meanresidueellipticity）MWCNT：多壁碳納米管（multiwallcarbonnanotubes）NOAA：納米物體及其聚集體和團(tuán)聚體（nano-objectsandtheiraggregatesandagglomerates）PAA-AuNP：聚丙烯酸包覆的金納米顆粒（poly(acrylicacid)-coatedgoldnanoparticles）SRCD：同步輻射圓二色性（synchrotronradiationcirculardichroism）SWCNT：?jiǎn)伪谔技{米管（single-wallcarbonnanotubes）UV-CD：紫外圓二色性（ultravioletcirculardichroism）UV-Vis：紫外/可見(jiàn)（ultraviolet-visible）5納米材料與蛋白質(zhì)的相互作用在生物環(huán)境中，NOAA容易與載脂蛋白、纖連蛋白、HSA、玻連蛋白等蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用[5]。NOAA周?chē)Y(jié)合或吸附的蛋白質(zhì)層被稱(chēng)為蛋白質(zhì)冠。納米材料的物理化學(xué)性質(zhì)（如尺寸、表面積、疏水性、電荷密度、表面化學(xué)、形貌）可能會(huì)影響其與周?chē)锓肿拥南嗷プ饔谩＿@種相互作用依賴(lài)于蛋白質(zhì)的結(jié)合和解離動(dòng)力學(xué)。納米材料-配體復(fù)合物的壽命從微秒到數(shù)天不等[3-9]。蛋白質(zhì)與納米材料相互作用后，其二級(jí)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生可逆或不可逆的構(gòu)象變化。蛋白質(zhì)與納米材料相互作用引起的二級(jí)結(jié)構(gòu)微小變化多數(shù)是可逆的，但顯著的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變則極可能是不可逆的。這些變化可以通過(guò)監(jiān)測(cè)UV-CD光譜獲得[9]。UV-CD光譜測(cè)量的是手性物質(zhì)的電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)的光物理過(guò)程。UV-CD光譜法廣泛用于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)折疊及其結(jié)合特性的表征[4-6]。該技術(shù)使用偏振光測(cè)量物質(zhì)對(duì)左旋和右旋圓偏振光吸收差異產(chǎn)生的UV-CD信號(hào)。波長(zhǎng)小于240nm的吸收來(lái)自肽鍵，而在260nm~320nm的吸收來(lái)自芳香氨基酸的側(cè)鏈。α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角都是最常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元（參見(jiàn)附錄A和圖C.1）。需注意的是，芳香氨基酸的側(cè)鏈也可能對(duì)小于240nm的CD光譜有貢獻(xiàn)。此外，二硫鍵可能對(duì)這兩個(gè)波長(zhǎng)區(qū)間的CD光譜也有貢獻(xiàn)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)表征則超出了本文件的范圍。采用UV-CD測(cè)定與納米顆粒作用的關(guān)鍵人源蛋白的結(jié)構(gòu)變化已有報(bào)道（參見(jiàn)表B.1）。例如，人轉(zhuǎn)鐵蛋白與超順磁氧化鐵納米顆粒（SPION）、纖維蛋白原與AuNP相互作用引起的不可逆結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)主要生物功能的喪失[10]。通過(guò)使用UV-Vis、透射電子顯微鏡（TEM）和UV-CD的測(cè)量方法研究AgNP和HSA之間的相互作用，探索納米顆粒與細(xì)胞相互作用中物理力的角色。研究表明，氫鍵、3GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021靜電和疏水相互作用介導(dǎo)了二者的結(jié)合，導(dǎo)致α-螺旋減少，β-折疊增加，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的生物功能[11]。利用SRCD光譜法研究了HSA-AgNP的相互作用和穩(wěn)定性，結(jié)果表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量減少。Mac-1蛋白與PAA-AuNP結(jié)合產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊，促使其與整聯(lián)蛋白受體發(fā)生相互作用。該受體的激活增強(qiáng)了NF-kB信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的釋放[14]。6樣品制備6.1概述UV-CD光譜儀需帶有溫度控制元件，其波長(zhǎng)范圍175nm～700nm。需配備光程從0.5mm～10mm的石英玻璃比色皿（矩形或圓柱形）。便于UV-CD光譜獲取，所用材料、溶劑和緩沖溶液應(yīng)在紫外區(qū)吸收低，并盡可能透明。使用具有光學(xué)活性的緩沖溶液會(huì)帶來(lái)很多問(wèn)題，因此不建議使用（見(jiàn)表C.1、C.2和C.3）。處理蛋白質(zhì)溶液時(shí)，應(yīng)使用經(jīng)特殊處理的與蛋白質(zhì)親和力弱的玻璃器皿。所有溶液均應(yīng)使用去離子水配制。6.2UV-CD石英比色皿的性能要求宜使用透明度高的石英比色皿采集UV-CD光譜。石英比色皿應(yīng)無(wú)光學(xué)活性，所需光程范圍為0.5mm～10mm（矩形或圓柱形）。每次測(cè)量前應(yīng)徹底清洗比色皿（參見(jiàn)附錄C）。6.3蛋白質(zhì)溶液制備在與蛋白質(zhì)親和力弱的的試管中稱(chēng)取蛋白質(zhì)，并加入緩沖液制成濃度合適的儲(chǔ)備溶液。所需的濃度可使用分光光度法通過(guò)摩爾消光系數(shù)來(lái)確定[11]。緩沖溶液應(yīng)根據(jù)研究中使用的蛋白質(zhì)和納米顆粒的類(lèi)型進(jìn)行選擇。制備濃度范圍為1mg/mL～5mg/mL的蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液。然后，對(duì)儲(chǔ)備溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屵M(jìn)行UV-CD測(cè)量。蛋白質(zhì)的UV-CD光譜使用0.5mm～10mm比色皿采集。根據(jù)光程和緩沖溶液類(lèi)型，可測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.005mg/mL～5mg/mL。但蛋白質(zhì)含量在0.005mg/mL～0.3mg/mL之間時(shí)，可獲得理想的UV-CD光譜。典型的UV-CD測(cè)量如下：—0.5mm比色皿：蛋白質(zhì)濃度0.2mg/mL～1mg/mL時(shí)，所需體積為0.025mL～0.05mL；—1mm比色皿：蛋白質(zhì)濃度0.05mg/mL～0.2mg/mL時(shí)，所需體積為0.3mL～0.4mL；—2mm比色皿：蛋白質(zhì)濃度0.1mg/mL～0.3mg/mL時(shí)，所需體積為0.9mL～1mL；—10mm比色皿：蛋白質(zhì)濃度0.005mg/mL～0.01mg/mL時(shí)，所需體積為3mL至4mL。蛋白質(zhì)宜產(chǎn)生足夠強(qiáng)的UV和UV-CD信號(hào)。蛋白質(zhì)溶液在UV波長(zhǎng)處的吸光度宜在0.5AU～1AU之間，最佳吸光度為0.89AU（參見(jiàn)圖C.2）。6.4儀器條件設(shè)置在儀器開(kāi)機(jī)前，需要用氮?dú)鈱?duì)其吹掃30min～60min（制造商建議的時(shí)間）。使用水套式恒溫比色皿支架/軟件控制的珀耳帖效應(yīng)調(diào)控循環(huán)水浴的實(shí)驗(yàn)溫度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)定水浴溫度，并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持溫度恒定。實(shí)驗(yàn)前宜打開(kāi)光源，確保光信號(hào)輸出穩(wěn)定（30min～40min）。6.5UV-CD光譜的采集步驟6.5.1概述在UV-CD開(kāi)始測(cè)量前，將溫度設(shè)置為所需溫度（25℃)[3-4]。為了獲得合適信噪比下足夠的光譜分辨率，將光譜帶寬設(shè)置在1nm～1.5nm之間。根據(jù)所使用的樣品和比色皿調(diào)整波長(zhǎng)范圍：—0.1mm比色皿中0.2mg/mL～0.8mg/mL的蛋白質(zhì)樣品，190nm～260nm；4GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021—1mm和2mm比色皿中0.1mg/mL～0.2mg/mL的蛋白質(zhì)樣品，190nm～260nm；—10mm比色皿中0.01mg/mL～0.02mg/mL的蛋白質(zhì)樣品，190nm～260nm。對(duì)于低橢圓度、信噪比在0.1nm～0.25nm之間的樣品，數(shù)據(jù)采集間隔宜為1nm。UV-CD光譜推薦的測(cè)量范圍為190nm～260nm。數(shù)據(jù)宜按1nm/s的速率進(jìn)行采集。6.5.2緩沖溶液采集緩沖溶液的光譜確保其沒(méi)有任何橢圓度。確保狹縫寬度、掃描步長(zhǎng)、積分時(shí)間和掃描速率/積分時(shí)間等測(cè)量參數(shù)與樣品測(cè)量時(shí)的參數(shù)一致。當(dāng)緩沖溶液與蛋白質(zhì)的UV-CD引起任何重疊的響應(yīng)時(shí)，都可能產(chǎn)生誤導(dǎo)性的結(jié)果。緩沖溶液與去離子水吸收比的增加會(huì)降低信噪比。緩沖溶液和去離子水的光譜在實(shí)驗(yàn)誤差內(nèi)宜盡量重疊，但通常在短波長(zhǎng)區(qū)域，緩沖溶液比去離子水的光譜具有更低信噪比[4]?！扑]使用磷酸鈉或磷酸鉀緩沖溶液溶解蛋白質(zhì)，最佳濃度為10mmol/L，也可作為空白樣品?！苊馐褂酶蓴_UV-CD光譜的緩沖溶液，如檸檬酸鹽、3-(N-嗎啉)丙磺酸（MOPS）、咪唑和二硫蘇糖醇（DTT）。緩沖溶液及其UV截止波長(zhǎng)如表C.3所示?！跇悠稢D光譜測(cè)量前，先采集緩沖溶液的CD譜。得到的空白CD光譜宜相對(duì)平坦，以確保緩沖溶液對(duì)吸光度產(chǎn)生影響。6.5.3蛋白質(zhì)樣品在干凈的比色皿中加入蛋白質(zhì)溶液，采集UV-CD光譜。重復(fù)測(cè)量5次～6次。將所有光譜疊加并對(duì)數(shù)據(jù)加取平均。對(duì)樣品和空白光譜進(jìn)行平滑處理[4]。多種方法可用于光譜平滑。一般采用基于3階多項(xiàng)式和20點(diǎn)平滑窗口的薩維茨基-戈萊平滑算法。從樣品的平滑光譜中減去平滑基線[4-15]。大多數(shù)蛋白質(zhì)在250nm～260nm之間的橢圓度宜接近于零。6.5.4納米顆粒懸浮液在蛋白質(zhì)溶液中的穩(wěn)定性需對(duì)納米顆粒在的緩沖溶液中的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試，避免納米顆粒發(fā)生任何團(tuán)聚。理想情況下，納米顆粒在樣品和對(duì)照中的團(tuán)聚狀態(tài)宜相同。然而，許多研究表明蛋白質(zhì)可以增強(qiáng)顆粒團(tuán)聚。所以這個(gè)設(shè)想多半是不可行的。因?yàn)閷?duì)納米顆粒的團(tuán)聚進(jìn)行初步研究，能夠?yàn)榫彌_液和顆粒濃度的選擇提供關(guān)鍵信息。所以在進(jìn)行UV-CD分析之前，宜先進(jìn)行初步研究，并作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一部分。團(tuán)聚測(cè)量可通過(guò)DLS技術(shù)實(shí)現(xiàn)（參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]和ISO22412[16]）。6.6蛋白質(zhì)-納米顆粒結(jié)合物懸浮液的制備蛋白質(zhì)-納米顆粒結(jié)合物懸浮液的制備如下：a)使用與蛋白質(zhì)親和力弱的玻璃小瓶。b)根據(jù)計(jì)算的所需蛋白質(zhì)儲(chǔ)備溶液的體積，用移液器在每個(gè)小瓶中加入相同的體積。c)在玻璃小瓶中加入足量的去離子水，得到一定濃度的蛋白質(zhì)溶液。d)輕搖小瓶，并在在室溫（25℃)下孵化5min。e)在蛋白質(zhì)溶液中加入一定體積的納米材料懸浮液（10μg/mL～100μg/mL輕輕混合（蛋白質(zhì)和納米顆粒的合適比例參見(jiàn)附錄E）。f)將制備好的樣品在室溫下（25℃)下孵化4h。g)將溶液轉(zhuǎn)移到UV-CD比色皿中。h)在室溫（25℃)下，采集190nm～260nm區(qū)間的UV-CD光譜。在光譜帶寬1nm、掃描速率50nm/min下采集數(shù)據(jù)，重復(fù)測(cè)量5次～6次并進(jìn)行平均。最終的光譜宜進(jìn)行基線校正，數(shù)據(jù)用平均殘基橢圓率（MRE）表示，如6.8所述。6.7UV-CD光譜測(cè)量5GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021按如下步驟測(cè)量UV-CD光譜：a)采集所用緩沖溶液的UV-CD光譜（參見(jiàn)表C.1和表C.2）。b)納米顆粒分散液中可能有試劑殘留。采集相應(yīng)溶液的UV-CD光譜。c)測(cè)試所用納米顆粒在190nm～260nm區(qū)間的紫外吸收。如果納米顆粒在該區(qū)間的吸光度大于1.0AU，則該顆粒不適合UV-CD實(shí)驗(yàn)（參見(jiàn)圖C.1和圖C.2）。d)重復(fù)測(cè)量蛋白質(zhì)-納米顆粒分散體系的UV-CD至少5次～6次，驗(yàn)證測(cè)試重復(fù)性。如果重復(fù)性不能接受，則可能平衡時(shí)間不足或懸浮液不穩(wěn)定。e)從樣品數(shù)據(jù)中減去背景/空白光譜。應(yīng)采集NOAA在190nm～260nm區(qū)間的CD光譜。非手性NOAA在具有強(qiáng)CD信號(hào)的NOAA不適合做這個(gè)測(cè)試。NOAA、空白樣品和蛋白質(zhì)樣品的CD采集步驟應(yīng)完全相同。6.8摩爾橢圓率計(jì)算蛋白質(zhì)中的α-螺旋含量可以通過(guò)公式（1）將UV-CD信號(hào)（參見(jiàn)圖C.2和表D.1）轉(zhuǎn)換為MRE進(jìn)行定量分析：…………式中：[θ]——222nm處的MRE，單位為deg.cm2.dmol-1；θ——測(cè)量得到的橢圓率，單位為deg；C——蛋白質(zhì)的摩爾濃度，單位為mol/L；n——氨基酸殘基的數(shù)量；l——光程，單位為cm。螺旋含量利用公式（2）計(jì)算：…………………式中：H——α-螺旋含量（%[θ]——222nm處的MRE；3000——222nm處無(wú)規(guī)卷曲和β型構(gòu)象混合的MRE[θ]；36000——純?chǔ)?螺旋在222nm處的MRE[θ]。6.9數(shù)據(jù)分析通過(guò)UV-CD光譜的定量分析可對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行評(píng)估。蛋白質(zhì)圓二色數(shù)據(jù)庫(kù)（PCDDB）公開(kāi)提供了許多有效的參考光譜[17]?？梢圆捎貌煌姆椒▽?duì)UV-CD光譜進(jìn)行去卷積（參見(jiàn)表F.1）。有許多平臺(tái)可用于評(píng)估蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)含量，如CDPro[18]，ValiDichro[19]，PDB2CD，K2D3，DichroCalc，DICHROWEB，CCA+[20]和Beta結(jié)構(gòu)選擇（BeStSel）[21-22]。其他一些簡(jiǎn)化的程序也可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)含量的定量[4,21,23-24]。應(yīng)用這些方法可以評(píng)估蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并測(cè)量蛋白質(zhì)-納米顆粒相互作用引起的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的變化。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化在5%以上可以認(rèn)為是顯著的，≥90%則認(rèn)為其已變性[56]。測(cè)量的UV-CD光譜可以以文本文件上傳到網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（參見(jiàn)附件G也可以以?xún)闪袛?shù)據(jù)的形式復(fù)制到給定的窗口；數(shù)據(jù)的單位為deltaepsilon、MRE或mdeg。建議輸入數(shù)據(jù)的波長(zhǎng)間隔為1nm。結(jié)構(gòu)含量評(píng)估的輸出結(jié)果包括實(shí)驗(yàn)和估算光譜圖、二級(jí)結(jié)構(gòu)組成列表、總量、均方根偏差（RMSD）和歸6GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021一化RMSD（NRMSD）數(shù)據(jù)的擬合光譜。文件可以以圖形格式或文本格式保存，方便進(jìn)一步的數(shù)據(jù)或圖形處理。用戶(hù)可以調(diào)整波長(zhǎng)范圍和使用比例因子重新計(jì)算結(jié)果。輸出的數(shù)據(jù)格式可由用戶(hù)進(jìn)行修改。7測(cè)試報(bào)告測(cè)試報(bào)告應(yīng)包括表1中的信息。表1測(cè)試報(bào)告基本信息產(chǎn)品名稱(chēng)：產(chǎn)品用途：批號(hào)：批量編號(hào)：制造方法：實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)：實(shí)驗(yàn)室地址：NOAA表征尺寸化學(xué)組成形狀表面化學(xué)NOAA濃度a蛋白質(zhì)表征蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）pH二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的評(píng)估結(jié)構(gòu)含量蛋白與NOAA作用前（%）蛋白質(zhì)與NOAA作用后（%）螺旋反平行式平行式其他RMSDNRMSD用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)含量分析的數(shù)據(jù)庫(kù)類(lèi)型：a濃度以μg/mL表示。7GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021蛋白質(zhì)典型UV-CD光譜圖a）在遠(yuǎn)紫外區(qū)的各種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)b)具有不同構(gòu)象的典型蛋白質(zhì)說(shuō)明：2β反平行式3延展結(jié)構(gòu)4膠原蛋白（三螺旋）5膠原蛋白（已變性）6肌紅蛋白7LDH8胰凝乳蛋白酶9本周氏蛋白圖A.1UV-CD光譜圖8GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021關(guān)于NOAA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的文獻(xiàn)檢索表B.1NOAA引起的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化納米顆粒類(lèi)蛋白質(zhì)類(lèi)形狀尺寸表面性質(zhì)納米顆粒濃度蛋白質(zhì)濃度pH結(jié)論參考文獻(xiàn)AgNP溶菌酶球形4nm20nm100nm帶負(fù)電1:1000（100nm為1:250）2.3×10184nm5.9×101620nm6.4×1014100nm50μg/mL9.26.95.0不可逆。對(duì)于所有顆粒尺寸，溶菌酶吸附隨pH減小而減小。對(duì)于100nm顆粒，大部分蛋白質(zhì)去折疊。[25]AgNP細(xì)胞色素C—4nm35nm帶負(fù)電20.0μg/mL200μg/mL7.0可逆。較大尺寸的AgNP，二級(jí)結(jié)構(gòu)損失很少。[26]AuNP細(xì)胞色素固體表面2nm~4nm—0nmol/L～18nmol/L3.5μmol/L7.2細(xì)胞色素C可通過(guò)疏水相互作用吸附在2nm～4nm的AuNP上。每個(gè)2nm～4nm的AuNP上吸附的細(xì)胞色素C不低于20個(gè)。細(xì)胞色素C可通過(guò)靜電相互吸附上吸附的細(xì)胞色素C為200個(gè)。[27]SiO2核糖核酸酶A球形4nm帶負(fù)電10mg/mL7.4可逆去折疊。在具有較小表面曲率的較大NP上，酶的穩(wěn)定性進(jìn)一步降低。[28]AgNP人碳酸酐固體表面6nm9nm帶負(fù)電5.09×10179nm50μmol/L8.4采用超離心法和凝膠滲透色譜法進(jìn)行脫附。直徑為15nm的顆[29]9GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021（HCAI）7.30×10176nm（顆粒數(shù)/mL）HCAI：AgNP（所有顆粒尺寸）粒引起的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化比直徑為6nm的顆粒約6倍。PAA-AuNP纖維蛋白原球形5nm20nm帶負(fù)電20μg/mL30μg/mL40μg/mL7.4帶負(fù)電荷的NP可能使纖維蛋白原去折疊，所以PAA-AuNP引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的損失。[30]AgNP矮刀豆尿酶（JBU）球形帶正電1000μmol/LJBU:AgNP[1:1,1:2,1:3,1:4,1:5(v/v)]40μmol/L8不可逆變化。在較高顆粒濃度形成蛋白質(zhì)-納米生物偶聯(lián)物。在較高AgNP濃度形成的蛋白冠完全抑制了脲酶的酶活性。[31]CuNPBSA（牛血清白蛋白）球形7.5nm立方體結(jié)構(gòu)1.58×10-4μmol/L3.53×10-4μmol/L7.34×10-4μmol/L11.66×10-4μmol/L5μmol/L因與CuNP的發(fā)生相互作用，BSA的α-螺旋度降低。[32]AgNP真菌蛋白（臭曲霉）—5nm—1:0μmol/L2:12.5μmol/L3:25μmol/L（蛋白質(zhì):AgNP）1mg/mL7.4AgNP與真菌細(xì)外蛋白結(jié)合可引起蛋白質(zhì)的不可逆改變。[33]Ag-PVTNP人血清白蛋白（HSA）———2.4×10-5mol/L4×10-5mol/L8×10-5mol/L16×10-5mol/L24×10-5mol/L32×10-5mol/L1.5μmol/L7.4Ag-PVPNPs輕微改變了蛋白質(zhì)的285-二級(jí)結(jié)構(gòu)。[34]GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:202140×10-5mol/L60×10-5mol/L80×10-5mol/LZnONPα-乳白蛋白球形4nm~7nm帶正電1:1～1:10（蛋白質(zhì):NP）7.4ZnO和蛋白質(zhì)可通過(guò)靜電、疏水或二者兼有的作用相結(jié)合。疏水相互作用可破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而靜電相互作用可穩(wěn)定蛋白質(zhì)。[35]C60NP人血清清蛋白（HAS）球形50nm~—3.38μmol/L5.63μmol/L11.8μmol/L7.3μmol/L7.4與nC60結(jié)合后，HSA的α-螺旋度百分比增加，蛋白變得更緊密。[36]CdS-QDNP溶菌酶球形2nm~3nm巰基丙酸、谷胱甘肽、L-半胱氨酸包覆的，帶負(fù)電0.4μmol/L 8μmol/L1.2μmol/L1.6μmol/L24.0μmol/L7.4當(dāng)3種CdS-QD的濃度達(dá)到2.4×10-5mol/L時(shí)，Lyz螺旋度含量突然下降，Lyz開(kāi)始變性。[37]CdS-QDNPBSA球形2nm~3nm0.4μmol/L 8μmol/L1.2μmol/L1.6μmol/L24.0μmol/L3μmol/L7.4MPA-CdS量子點(diǎn)的濃度增加到2.4×10-5mol/L，BSA的α-螺旋含量沒(méi)有恢復(fù)到其在MPA-CdS量子點(diǎn)中的初始值。隨GSH-CdS量子點(diǎn)濃度增加，BSA中α-螺旋含量降低。[37]HO-SWCNTNP血紅蛋白肌紅蛋白實(shí)心圓柱形外徑1nm~2nm長(zhǎng)度5μm～30供體0.5mg/L～10mg/L5μmol/L7.4HO-SWCNT誘導(dǎo)血紅蛋白和肌紅蛋白的變性和去折疊。[38]GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021SWCNT管狀外徑1nm~2nm帶負(fù)電低疏水性50μg/mL100μg/mL200μg/mL7.8Tau蛋白與SWCNT的結(jié)合引起蛋白質(zhì)折疊和形成更緊密的結(jié)[39]MWCNT管狀外徑10nm~20nm帶負(fù)電高疏水性50μg/mL100μg/mL200μg/mL7.8Tau蛋白和MWCNT的結(jié)合沒(méi)有改變Tau蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。[39]SWCNT溶菌酶管狀 疏水30μg/mL6.9μmol/L 在最小波長(zhǎng)處沒(méi)有測(cè)到光譜移動(dòng)，與SWCNT結(jié)合的溶菌酶接近原始狀態(tài)。[40]GQDNPHSA球形1.2nm高表面積8.55μmol/L34.2μmol/L2.0μmol/L7.4隨著GQD濃度的增加，HAS中α-螺旋含量降低，其他二級(jí)結(jié)構(gòu)含量增加。HSA與GQDs相互作用引起其生理活性降低。[41]AgNPBHb—5nm~—18.7μmol/L37.4μmol/L74.8μmol/L0.25μg/mL7.4BHb與AgNP結(jié)合導(dǎo)致其發(fā)生α-β轉(zhuǎn)變，引起部分去折疊。[42]Morin-AuNPBSA球形30nm~40nm還原型1.5μmol/L5.0μmol/L7.4BSA的結(jié)構(gòu)是以螺旋為主。在Morin-AuNP存在下，BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。[43]CdSNPHSA片狀5nm~高表面積0μmol/L～4μmol/L4μmol/L7.4雖然人血清白蛋白與CdSNP結(jié)合后α-螺旋度下降，但其結(jié)構(gòu)中仍以α-螺旋為主。[44]ZnONPToxR球形2.5nm帶正電1:1（蛋白質(zhì):NP）10.0μmol/L8ToxR與ZnONP結(jié)合會(huì)導(dǎo)致其主要結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，二級(jí)結(jié)構(gòu)大量損失。[45]ZnONP溶菌酶球形4nm~帶正電—7.4ZnONP與溶菌酶表面最大縫隙[46]GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:20217nm相結(jié)合，可以更大程度的保留溶菌酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，即便在變性條件下溶菌酶也表現(xiàn)出酶活性。ZnONPBSA球形5nm~六方纖鋅礦結(jié)構(gòu)0.09μmol/L——蛋白質(zhì)與ZnONP結(jié)合后，其基本結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化，但α-螺旋含量下降。[47]CdTeQDNPα-胰凝乳蛋白酶球形3nm~4nm—0.6μmol/L1.6μmol/L7.029.05pH=9.05時(shí)為氫鍵相互作用，pH=7.02時(shí)為靜電和疏水相互作用。CdTe納米顆粒能改變?chǔ)?胰凝乳蛋白酶的結(jié)構(gòu)，但加入CdTe納米顆粒24h后不同pH下，蛋白酶仍能保持高活性。[48]CdSe/ZnSQDHSA準(zhǔn)球形4.43nm帶負(fù)電2.5μmol/L5.0μmol/L7.4在QD存在下，HAS發(fā)生二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，在更高濃度下，變化更為明顯。QD的存在削弱了HSA的生物活性。[49]谷胱甘肽-CdTeQDHSA—5nm帶負(fù)電0.5μmol/L1.0μmol/L2.0μmol/L7.4QD能誘導(dǎo)HAS發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而可能改變HSA的生物活性。[50]CdTeQDHSA—2nm3.7nm4.8nmMPA包覆、GSH包覆、NAC包覆1.0μmol/L（20:1）（10:1）（5:1）（HSA:QD）7.4HSA與帶負(fù)電的QD的相互作用與表面修飾無(wú)關(guān)。QD可能影響蛋白質(zhì)中α-螺旋含量，而HAS的構(gòu)象變化可能改變HSA的生物活性。[51]GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021可用于蛋白質(zhì)溶解的緩沖溶液說(shuō)明C.1緩沖溶液推薦緩沖溶液的性質(zhì)如表C.1所示，不推薦緩沖溶液如表C.2所示。表C.1推薦緩沖溶液的性質(zhì)[4]緩沖溶液a極限波長(zhǎng)下限（nm）10mmol/L磷酸鉀，100mmol/LKF10mmol/L磷酸鉀，100mmol/L(NH4)2SO410mmol/L磷酸鉀，50mmol/LNa2SO410mmol/L磷酸鉀，100mmol/LKCl20mmol/L磷酸鈉，100mmol/LNaCl杜爾貝科磷酸鹽緩沖溶液（PBS9.33mmol/L磷酸鉀、136mmol/LNaCl、2.7mmol/LKCl、0.6mmol/LMgCl2、0.9mmol/LCaCl22002mmol/Lhepes,50mmol/LNaCl,2mmol/LEDTA,1mmol/L二硫蘇糖醇20050mmol/LTris,150mmol/LNaCl,1mmol/L二硫蘇糖醇,0.1mmol/LEDTA201aDMSO和甲酰胺吸收強(qiáng)，不能用于CD測(cè)量。表C.2不推薦緩沖溶液的性質(zhì)緩沖溶液a極限波長(zhǎng)下限（nm）六氟-2-丙醇（HFIP）200三氟乙醇（TFE）200aDMSO和甲酰胺吸收強(qiáng)，不能用于CD測(cè)量。C.2清潔劑使用清潔劑清洗比色皿時(shí)，建議采用以下步驟。a)比色皿清潔劑的儲(chǔ)備溶液應(yīng)按供應(yīng)商的說(shuō)明與去離子水混合。b)將比色皿浸入清洗溶液中，在50℃至60℃之間加熱約20min。然后，比色皿用去離子水清洗幾次。c)使用王水去除比色皿中的納米顆粒。濃鹽酸和濃硝酸混合發(fā)生如下反應(yīng)：HNO3(aq)+3HCl(aq)→NOCl(aq)+2Clnasc(g)+2H2Od)兩種酸混合后生成王水，其顏色呈金黃色。王水適用于大多數(shù)金屬納米顆粒。但是對(duì)于其他某些顆粒可根據(jù)其本身性質(zhì)選擇更合適的溶劑。e)將比色皿放入少量王水的溶液中沸煮約5min。f)用去離子水清洗比色皿4次。檢查清洗水的pH值，并連續(xù)清洗直至清洗水的pH達(dá)到中性，確保所有王水都被沖走。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021圖C.1CD測(cè)量中信噪比（S/N）隨吸光度的函數(shù)關(guān)系[5]圖C.2優(yōu)化的蛋白質(zhì)濃度隨比色皿光程的函數(shù)關(guān)系[5]C.3CD實(shí)驗(yàn)中納米顆粒的吸收大部分尺寸大于10nm的NOAA是非手性的，不會(huì)測(cè)量到CD信號(hào)[52]。當(dāng)納米顆粒與手性分子或手性生物分子偶聯(lián)后，其可能產(chǎn)生誘導(dǎo)的CD信號(hào)[53]。尺寸小于10nm的納米材料也可能會(huì)產(chǎn)生CD信號(hào)，如金屬結(jié)構(gòu)的表面等離激元共振可能會(huì)在可見(jiàn)光區(qū)產(chǎn)生CD信號(hào)。另外，納米材料團(tuán)簇（0.5nm~2nm）可轉(zhuǎn)變?yōu)槭中泽w進(jìn)而產(chǎn)生CD信號(hào)[54]。C.4緩沖溶液在遠(yuǎn)紫外區(qū)的吸收參加表C.3。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021表C.3各種鹽和緩沖溶液中的物質(zhì)在遠(yuǎn)紫外的吸收[55]化合物pH以上無(wú)吸收10mmol/L溶液在1mm比色皿中的吸光度210nm200nm190nm180nmNaClO4170nm0.000.000.000.00NaF,KF170nm0.000.000.000.00硼酸180nm0.000.000.000.00NaCl205nm0.000.02>0.50>0.50Na2HPO4210nm0.000.050.3>0.50醋酸鈉220nm0.030.17>0.50>0.50甘氨酸220nm0.03010>0.50>0.50二乙胺240nm0.40>0.50>0.50>0.50NaOH230nm>0.50>2.00>2.00>2.00硼酸，NaOH200nm0.000.000.090.30Tricine8.5230nm0.220.44>0.50>0.50Tris8.0220nm0.020.130.24>0.50HEPES7.5230nm0.370.50>0.50>0.50PIPES7.0230nm0.200.490.29>0.50MOPS7.0230nm0.100.340.28>0.50MES6.0230nm0.070.290.29>0.50二甲基胂酸7.0210nm0.010.200.22C.5樣品制備控制和采集高質(zhì)量光譜使用CD時(shí)：a)在CD測(cè)量前后，應(yīng)對(duì)比色皿中的緩沖溶液和樣品進(jìn)行肉眼觀測(cè)：1)是否存在氣泡（樣品在測(cè)量過(guò)程中會(huì)排出氣體）？2)樣品在溶液中是否穩(wěn)定？3)樣品是否散射過(guò)強(qiáng)？b)應(yīng)檢查緩沖溶液是否存在CD信號(hào)。如果存在，可從樣品中扣除對(duì)應(yīng)的的緩存溶液CD信號(hào)。c)考慮比色皿是否可以重復(fù)放置在儀器中。如果不是，緩沖溶液和樣品的光譜可能出現(xiàn)垂直偏移。在250nm～260nm區(qū)域的CD信號(hào)可能會(huì)趨于0mdeg。d)考慮樣品是否在測(cè)量光束中發(fā)生光解。記錄重復(fù)測(cè)量，仔細(xì)檢查復(fù)現(xiàn)性。樣品光解可能引起信號(hào)強(qiáng)度的降低。e)當(dāng)將儀器設(shè)定為某個(gè)掃描速率時(shí)，可能偶爾出現(xiàn)過(guò)度平滑或失真的數(shù)據(jù)。儀器的用戶(hù)手冊(cè)會(huì)說(shuō)明如何選擇合適的掃描速率。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021CD測(cè)量中的單位轉(zhuǎn)換表D.1CD測(cè)量中的單位轉(zhuǎn)換初始單位吸光度a毫吸光度b摩爾消光c度d毫度e摩爾橢圓率f(A)AA×1000A×M/(C×L)A×32.98A×32980A×M×3298/(C×L)(mA)mA/1000mAA×M/(C×L×mA×0.03298mA×32.98mA×M×3298/(C×L)(ε)ε×C×L/Mε×C×L×1000/Mεε×C×L×32.98/Mε×C×L×32980/Mε×3298(°)°/32.98°/0.03298m°×M/(C×L×32.98)°°×1000°×M×100/(C×L)(m°)m°/32980m°/32.98m°×M/(C×L×32980)m°/1000m°m°×M/(10×C×L)[θ]×C×L/(3298×M)[θ]×C×L/(3.298×M)[θ]/3298[θ]×C×L/(100×M)[θ]×C×L×10/Ma單位為吸光度（A）。c單位為A×L/mol×cm。d單位為度(°)。e單位為毫度(m°)。f單位為度×cm2/dmol。GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021計(jì)算樣品的濃度范圍在蛋白質(zhì)溶液中，納米顆粒的合適濃度應(yīng)通過(guò)在其表面形成單層蛋白質(zhì)所需的蛋白質(zhì)數(shù)量來(lái)計(jì)算。選擇的納米顆粒濃度應(yīng)確保在混合體系中納米顆粒的總表面積理論上足以容納體系中所有的蛋白質(zhì)。納米顆粒懸浮液在緩沖溶液中的穩(wěn)定性通過(guò)DLS進(jìn)行測(cè)試[16]。表面位點(diǎn)濃度可通過(guò)顆粒的表面位點(diǎn)數(shù)乘以1L溶液中顆粒的數(shù)量并除以阿伏伽德羅常數(shù)（NA=6.022×1023mol-1）進(jìn)行簡(jiǎn)單地計(jì)算，如公式E.1所示：C表面位點(diǎn)濃度…………………GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的評(píng)估方法表F.1利用CD光譜評(píng)估二級(jí)結(jié)構(gòu)的各種方法的可靠性[21]方法失效螺旋校正系數(shù)反平行式平行式β-折疊轉(zhuǎn)角和其他RMSDRMSD校正系數(shù)RMSD校正系數(shù)RMSD校正系數(shù)RMSD校正系數(shù)BeStSel—0.0380.990.0500.980.0320.970.0390.990.0330.95VARSLC50.0890.970.1550.620.860-0.080.1330.730.1300.74LINCOMB—0.1190.910.2140.450.1980.590.2300.510.2320.59CDNN 0.0830.970.830.0760.910.1020.890.1150.81SELCON—0.1470.860.820.0770.73CONTIN20.0950.950.0680.960.0740.73CDSSTR—0.2010.760.1390.750.0990.71K2D—0.1980.840.1520.790.1530.55K2D2—0.2220.700.1620.710.0880.68K2D3 0.1360.870.1840.640.1430.65CAPITO—0.2600.570.1610.850.1470.70GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021利用UV-CD評(píng)估蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的典型數(shù)據(jù)表G.1利用UV-CD評(píng)估蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的典型數(shù)據(jù)波長(zhǎng)（nm）Deltaepsilon波長(zhǎng)（nm）Deltaepsilon波長(zhǎng)（nm）Deltaepsilon2002.7847217-2.2639234-0.034622013.1755218-2.28962350.031372023.3261219-2.3112360.098432033.2518220-2.27062372042.9984221-2.22052380.155722052.5517222-2.08262390.192472061.9434223-1.90362400.202172071.2864224-1.72892410.21082080.6035225-1.60522420.21834209-0.04016226-1.46752430.18156210-0.5339227-1.31682440.16533211-0.92011228-1.1392450.1329212-1.2422229-0.911572460.11236213-1.5534230-0.667892470.1199214-1.8005231-0.479482480.14905215-2.053232-0.291122490.13607216-2.1861233-0.129852500.1015GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021參考文獻(xiàn)[1]TADEPALLIS,WANGZ,SLOCIKJ,NAIKRR,SINGAMANENIS.Effectofsizeandcurvatureontheenzymeactivityofbionanoconjugates.Nanoscale.2017,9,pp.15666–15672[2]RAMIREZ-ALVARADOM,KELLYJW,DOBSONCM.ProteinMisfoldingDiseases:CurrentandEmergingPrinciplesandTherapies.Wiley,2010[3]RAHMANM,LAURENTS,TAWILN,YAHIAL,MAHMOUDIM.Protein-nanoparticleinteractions.Springer,2013[4]GREENFIELDNJ.Usingcirculardichroismspectratoestimateproteinsecondarystructure.NatureProtocols.2006,1,pp.2876–2890[5]FASMANGD.Circulardichroismandtheconformationalanalysisofbiomolecules:SpringerScience&BusinessMedia,2013[6]HERRONJN,JISKOOTW,CROMMELINDJ.Physicalmethodstocharacterizepharmaceuticalproteins.SpringerScience&BusinessMedia,2013[7]WALLACEBA,JANESRW.Synchrotronradiationcirculardichroismspectroscopyofproteins:secondarystructure,foldrecognitionandstructuralgenomics.CurrentOpinioninChemicalBiology2001,5,pp.567–571[8]NGUYENVH,LEEBJ.Proteincorona:anewapproachfornanomedicinedesign.IntJNanomedicine2017,12,pp.3137–3151[9]ZEINABADHA,KACHOOEIE,SABOURYAA,KOSTOVAI,ATTARF,VAEZZADEHM,FALAHATIM.Thermodynamicandconformationalchangesofproteintowardinteractionwithnanoparticles:aspectroscopicoverview.RSCAdvances2016,6,pp.105903–105919[10]TREUELL,MALISSEKM,GEBAUERJS,ZELLNERR.TheInfluenceofSurfaceCompositionofNanoparticlesontheirInteractionswithSerumAlbumin.ChemPhysChem2010,11,pp.3093–3099[11]CHENR,CHOUDHARYP,SCHURRRN,BHATTACHARYAP,BROWNJM,CHUNKP.Interactionoflipidvesiclewithsilvernanoparticle-serumalbuminproteincorona.ApplPhysLett2012,100,pp.13703–137034[12]LAERAS,CECCONEG,ROSSIF,GILLILANDD,HUSSAINR,SILIGARDIG,CALZOLAIL.Measuringproteinstructureandstabilityofprotein–nanoparticlesystemswithsynchrotronradiationcirculardichroism.NanoLetters2011,11,pp.4480–4484[13]HUSSAINR,SILIGARDIG.CharacterisationofConformationalandLigandBindingPropertiesofMembraneProteinsUsingSynchrotronRadiationCircularDichroism(SRCD).In:MoraesIed,TheNextGenerationinMembraneProteinStructureDetermination.Cham:SpringerInternationalPublishing,2016,pp.43–59[14]DENGZJ,LIANGM,MONTEIROM,TOTHI,MINCHINRF.Nanoparticle-inducedunfoldingoffibrinogenpromotesMac-1receptoractivationandinflammation.NatNano2011,6,pp.39–44[15]TREUELL,MALISSEKM.Interactionsofnanoparticleswithproteins:Determinationofequilibriumconstants.In:CellularandSubcellularNanotechnology.Springer,2013,pp.225–235[16]ISO22412,Particlesizeanalysis—Dynamiclightscattering(DLS)[17]WHITMOREL,WOOLLETTB,MILESAJ,KLOSEDP,JANESRW,WALLACEBA.PCDDB:theproteincirculardichroismdatabank,arepositoryforcirculardichroismspectralandmetadata.NucleicAcidsRes2011,39,pp.D480–D486[18]SREERAMAN.CDPro,2017./sreeram/CDPro/GB/ZXXXXX—XXXX/ISO/TS23459:2021[19]WOOLLETTB,WHITMOREL,JANESRW,WALLACEBA.ValiDichro:awebsiteforvalidatingandqualitycontrolofproteincirculardichroismspectra.NucleicAcidRes2013,41,pp.W417–W421[20]OMICtools.Circulardichroism(CD)spectroscopydataanalysissoftwaretools,2017[21]MICSONAIA,WIENF,KERNYAL,LEEY-H,GOTOY,RéFRéGIERSM,KARDOSJ.Accuratesecondarystructurepredictionandfoldrecognitionforcirculardichroismspectroscopy.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2015,112,pp.E3095–E3103[22]MICSONAIA,WIENF,BULYAKIE,KUNJ,MOUSSONGE,LEEYH,GOTOY,REFREGIERSM,KARDOSJ.BeStSel:awebserverforaccurateproteinsecondarystructurepredictionandfoldrecognitionfromthecirculardichroismspectra.NucleicAcidsRes2018,46,pp.W315–W322[23]LICH,NGUYENX,NARHIL,CHEMMALILL,TOWERSE,MUZAMMILS,GABRIELSONJ,JIANGY.Applicationsofcirculardichroism(CD)forstructuralanalysisofproteins:qualificationofnear‐andfar‐UVCDforproteinhigherorderstructuralanalysis.JPharmSci2011,100,pp.4642–4654[24]RAVIJ,RAKOWSKAPD,GARFAGNINIT,BARONB,CHARLETP,JONESC,MILEVS,LORENZJD,PLUSQUELLICD,WIENF.Internationalcomparabilityinspectroscopicmeasurementsofproteinstructurebycirculardichroism:CCQM-P59.1.Metrologia2010,47,pp.631[25]VERTEGELAA,SIEGELRW,DORDICKJS.Silicananoparticlesizeinfluencesthestructureandenzymaticactivityofadsorbedlysozyme.Langmuir2004,20,pp.6800–6807[26]SHANGW,NUFFERJH,MU?IZ‐PAPANDREAVA,COLONW,SIEGELRW,DORDICKJS.Cytochromeconsilicananoparticles:influenceofnanoparticlesizeonproteinstructure,stability,andactivity.Small2009,5,pp.470–476[27]JIANGX,JIANGJ,JINY,WANGE,DONGS.EffectofColloidalGoldSizeontheConformatio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