酵母表面展示技術

關于酵母表面展示技術細胞表面是細胞內外的功能界面。一些表面蛋白橫穿過質膜，另一些以共價或非共價結構與細胞表面復合物結合一起。細胞能夠錨定特定的表面蛋白，并且能將其限制在細胞表面的特定區(qū)域。在生物技術中，細胞表面通常用于研究蛋白跨膜的機理。酵母細胞表面展示技術是近年來發(fā)展較快的一種真核蛋白表達系統(tǒng)，其基本原理是將外源靶蛋白基因(外源蛋白)與特定的載體基因序列融合后導入酵母細胞，利用酵母細胞內蛋白轉運到膜表面的機制使靶蛋白固定化表達在酵母細胞表面，在醫(yī)藥、食品、生物燃料等多個工業(yè)領域都有廣泛的應用前景。第2頁,共12頁，星期六，2024年，5月原理酵母是單細胞真核生物,根據交配型的差異分為兩種單倍體:MATα和MATa,其細胞表面分別表達α-凝集素和a-凝集素,它們可以介導細胞之間的交配融合。酵母表面展示系統(tǒng)應用的是釀酒酵母的a-凝集素,外源蛋白借助它在細胞表面得到展示。a-凝集素由核心亞單位(Aga1)和結合亞單位(Aga2)兩部分組成,Aga1共有725個氨基酸,它與酵母細胞壁的β-葡聚糖共價連接。Aga2共有69個氨基酸,它通過兩個二硫鍵與Aga1結合,表達于酵母細胞表面。Aga2的N端部分參與二硫鍵的形成,外源蛋白通過與Aga2的C端融合可展示于酵母細胞表面。第3頁,共12頁，星期六，2024年，5月

酵母表面展示系統(tǒng)基本組成宿主細胞釀酒酵母一直被認為是安全的模式生物（GRAS）而廣泛應用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)，也是目前常見的用于酵母表面展示的宿主細胞。除釀酒酵母外，近年來酵母展示平臺已被拓展至某些能利用甲醇作為單一碳源和能量來源的細胞株，如巴斯德畢赤酵母、漢遜酵母。與釀酒酵母相比，嗜甲醇酵母細胞株具有更優(yōu)越的發(fā)酵特性，如能夠在廉價的碳源中生長和更高的細胞培養(yǎng)密度，這些特性使其在需要大規(guī)模發(fā)酵的應用中更具優(yōu)勢，例如展示異源酶作為全細胞催化劑。另外，畢赤酵母對外源蛋白的O-糖基化程度更高，因而對展示的外源酶具有更好的穩(wěn)定效果。第4頁,共12頁，星期六，2024年，5月載體蛋白酵母細胞表面包被著一層堅硬的細胞壁，由內層的葡聚糖骨架和外層的甘露糖蛋白構成。甘露糖蛋白主要包括兩類蛋白質：一種以非共價方式松散地結合于細胞壁，可以用SDS抽提；另一類蛋白必需以β-1,3或β-1,6葡聚糖酶消化細胞壁后才能抽提，這類蛋白常含有GPI錨定區(qū)域。α-凝集素和絮凝素以及細胞壁蛋白如Cwp1p，Cwp2p，Tip1p等都屬于GPI家族蛋白，外源蛋白與它們融合后可被共價錨定于細胞表面，這些蛋白是常用的酵母表面展示載體蛋白。第5頁,共12頁，星期六，2024年，5月外源蛋白酵母表面展示系統(tǒng)適合展示各種真核蛋白，包括酶、細胞識別因子、受體、抗體、抗原等，被廣泛地應用于蛋白質工程、全細胞催化、生物轉化、細胞吸附、分子識別、生物治療、信號轉導、生物傳感器和疫苗等領域。外源蛋白與載體蛋白的融合方式有C末端融合、N末端融合、插入融合。對某些外源蛋白，選擇恰當?shù)娜诤戏绞娇梢悦黠@改善展示效果或蛋白的功能特性，如Aga2p蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以N末端或C末端兩種方式與其融合。研究表明抗CD3ε單鏈抗體融合于Aga2p蛋白C末端時，其親和力較天然蛋白降低30～100倍[5]，而融合于N末端時活性得以恢復。第6頁,共12頁，星期六，2024年，5月酵母表面展示系統(tǒng)的類型最常見的酵母表面展示表達系統(tǒng)包括:凝集素展示表達和絮凝素展示表達凝集素展示表達系統(tǒng)是將外源基因與酵母編碼凝集素C端編碼序列(含GPI錨定信號序列)連接后插入質粒載體的信號肽下游，融合蛋白誘導表達后，信號肽引導嵌合蛋白向細胞外分泌，由于融合蛋白C末端存在含GPI錨定信號的凝集素多肽序列，可將蛋白錨定在酵母細胞壁中，從而將蛋白分子展示表達在酵母細胞表面。第7頁,共12頁，星期六，2024年，5月絮凝素展示表達系統(tǒng)利用絮凝素基因與外源蛋白融合，并將融合蛋白展露表達在細胞表面，此系統(tǒng)又包括兩個子系統(tǒng):GPI錨定系統(tǒng)和絮凝結構域錨定系統(tǒng)。GPI錨定系統(tǒng)是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信號錨定外源蛋白，此系統(tǒng)與凝集素展示相似;絮凝結構域錨定系統(tǒng)是利用Flo1p的中間絮凝功能結構域與外源蛋白融合，通過絮凝功能結構域識別酵母細胞壁中的甘露聚糖鏈并以非共價作用誘導細胞粘附、聚集成可逆性絮狀物第8頁,共12頁，星期六，2024年，5月酵母表面展示系統(tǒng)的應用酵母表面展示與酒精發(fā)酵傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵是以淀粉質谷物或糖蜜為原料。隨著燃料酒精需求的日益增長，以天然纖維素類資源生產酒精的研究也日益受到人們重視。由于纖維素類物質是自然界中一種潛在的可再生資源，對解決未來能源問題有著巨大的潛力，因此，天然纖維素酒精發(fā)酵具有重要意義。Fujita等成功地將三種纖維素水解酶同時展示在釀酒酵母表面，從而構建了能夠增效和按順序降解纖維素的全細胞生物催化劑。第9頁,共12頁，星期六，2024年，5月酵母表面展示系統(tǒng)與新藥篩選將未知功能的目的基因產物或特定病理過程相關蛋白產物展示在酵母表面，對cDNA表達文庫或突變體庫進行篩選，能發(fā)現(xiàn)與這些未知功能的基因產物或病理過程相關產物發(fā)生相互作用的物質，有助于對未知基因功能的研究，并能發(fā)現(xiàn)一些藥物作用的新靶點，或篩選到治療疾病的新藥先導化合物。Visintin等將酵母表面展示技術與酵母雙雜交技術相結合，將抗體的單鏈（scFv）片斷連接到轉錄因子VP16的激活結構域(AD)上，將抗原連接到酵母LexA的結合結構域(DB)上，以His3和LacZ為報告基因，建立抗原抗體相互作用的展示方法。當抗原-抗體發(fā)生相互作用時，AD和DB的結合將啟動報告基因的表達，可通過營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進行檢測。這種方法從scFv突變體展示庫中將有可能篩選到抗原特異的抗體，為疫苗及抗體類藥物的研制提供良好的平臺。第10頁,共12頁，星期六，2024年，5月酵母細胞表面展示與生物吸附環(huán)境污染物的生物修復是以酶促降解或生物吸附為基礎的，例如微生物對重金屬的吸附就包括兩種途徑:(1)與細胞表面復合物結合，(2)逐漸吸收在細胞內進行消化。然而通過胞內消化降解有毒物質必須使細胞內酶，蛋白質或污染物跨越細胞膜這一屏障，比較緩慢及效率低而且不可重復利用。利用表