生物堿類成分分析2

生物堿類成分分析熟悉生物堿類成分結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)※掌握生物堿類制劑定性鑒別常用方法※掌握生物堿類制劑定量分析常用方法§概述定義：生物堿是生物界除生物體必須的含氮化合物（如氨基酸、蛋白質(zhì)和B族微生素等）之外的所有含氮有機(jī)化合物，因其結(jié)構(gòu)中氮原子上的未共享電子對(duì)而大多具有堿性。

絕大多數(shù)具有顯著的生理活性中藥材中生物堿多以有機(jī)酸鹽的狀態(tài)存在§結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)結(jié)構(gòu)特征：大多含有C、H、O、N理化性質(zhì)：物理性狀：結(jié)晶性固體；液體、小分子固體（揮發(fā)性、升華性），多無色

溶解性：多樣化

沉淀反應(yīng)：生物堿沉淀試劑，定性（蛋白質(zhì)、多肽、鞣質(zhì)，避免假陽性）顯色反應(yīng)：用于純品，少用于制劑中生物堿分析堿性：多呈堿性，堿性強(qiáng)成鹽，弱游離，供試品制備及分析方法建立及條件

選擇的依據(jù)紫外光譜：共軛體系，紫外吸收§定性鑒別一般理化鑒別沉淀反應(yīng)：酸性條件下或酸性稀醇下，生物堿能與一些試劑生成沉淀。（注意多肽，鞣質(zhì)，蛋白質(zhì)等假陽性）色譜鑒別TLC—吸附劑：硅膠，氧化鋁（不能用酸性）展開劑：氯仿，苯等及一些相應(yīng)極性的調(diào)節(jié)劑顯色劑：改良的碘化鉍鉀，碘蒸汽等

此外還可用某些生物堿的特殊顏色反應(yīng)，如麻黃堿與印三酮

PC—正相色譜，BAW系統(tǒng)展開劑，固定相為濾紙中的水，不能用含硫酸的做顯色劑。在堿性系統(tǒng)或堿性環(huán)境下展開注意

HPLC—高效液相色譜法對(duì)結(jié)構(gòu)十分相似的生物堿有很好的分離效果，在恒定的高效液相色譜條件下，各生物堿有一定的保留時(shí)間，可作為定性鑒別的參數(shù)。

優(yōu)點(diǎn)：快速，靈敏，微量等§總生物堿含量測定化學(xué)分析法：樣品供試品溶液中總生物堿成分純度較高，常用與處方藥味較少，內(nèi)含成分較簡單的中藥制劑。分光光度法：多用單波長光度法，要求干擾成分在測定波長基本無吸收。樣品分離、凈化（化學(xué)法、柱色譜法、TLC、PC法等）

化學(xué)分析法酸堿滴定法（主要使用）

（1）游離生物堿：多不溶于水，可先將生物堿溶于過量標(biāo)準(zhǔn)酸溶液中,再用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液回滴；

（2）生物堿鹽:在水或乙醇介質(zhì)中，用強(qiáng)酸溶液滴定。一般使其溶于90％乙醇溶液中，可用標(biāo)準(zhǔn)酸乙醇液滴定，用酚酞作指示劑。

酸堿滴定法測定中藥制劑中生物堿的含量，因中藥復(fù)方制劑中成分復(fù)雜，樣品溶液需進(jìn)行凈化處理。（氧化鋁）注意按操作方法分類（1）（2）操作方法將生物堿從中藥制劑中提取，用適宜的方法使其生成沉淀，干燥后直接稱重。加入某些試劑，使生物堿生成不溶性鹽沉淀，稱量沉淀，計(jì)算生物堿含量。優(yōu)點(diǎn)計(jì)算簡便，不用換算因數(shù)，也不必考慮生物堿的分子量。取樣量少，靈敏度高缺點(diǎn)①揮發(fā)性生物堿②蒸發(fā)提取溶劑或加熱、干燥時(shí)能分解破壞以及加堿使生物堿游離時(shí)可發(fā)生水解的不宜使用③取樣量大、操作時(shí)易乳化、費(fèi)時(shí)。計(jì)算方法復(fù)雜，繁瑣，影響因素較多，干擾多（沉淀試劑、PH、T、以及與試劑生成沉淀的非生物堿成分）表一兩種重量分析法異同比較表

分光光度法直接測定法：

不經(jīng)化學(xué)反應(yīng)，利用生物堿物質(zhì)自身的光吸收直接進(jìn)行比色測定的方法。

適用：一般用于藥味較少，內(nèi)含成分簡單，干擾不大的中藥制劑中總生物堿的含量測定。（戊己丸、駐車丸）

戊己丸和駐車丸

分光光度法離子對(duì)萃取比色法：在一定的PH介質(zhì)中，有機(jī)堿與一些酸性染料或磺酸類、酸類的陰離子，定量結(jié)合為有色離子對(duì)，定量地溶于某些有機(jī)溶劑中，然后在一定波長下，測定有機(jī)溶劑或經(jīng)堿化后釋放出來的染料的吸收度，按分光光度法計(jì)算含量。

適用：中藥制劑中微量生物堿成分的含量測定。

分光光度法離子對(duì)萃取比色法：酸性染料比色法：

B+H+BH+HInH++In-

BH++In-BH+In-本法測定的關(guān)鍵在于：介質(zhì)的pH值，酸性染料的性質(zhì)，有機(jī)溶劑的性質(zhì)。

分光光度法離子對(duì)萃取比色法：雷氏銨鹽比色法：

BH++[Cr(NH3)2(SCN)]2[Cr(NH3)2(SCN)]2

將沉淀分離，溶于丙酮，于520～526nm波長處比色測定吸收度，換算生物堿的含量。

分光光度法離子對(duì)萃取比色法：異羥污酸鐵比色法：含有酸酯鍵結(jié)構(gòu)的生物堿，在介質(zhì)中加熱，酯鍵水解，產(chǎn)生羧基與羥胺生成異羥污酸，與Fe3+JDS生成紫紅色配合物，在一定濃度下符合Beer定律，比色法進(jìn)行含量測定。

供試品溶液中必須不存在其他酯類成分

注意！§單體生物堿的含量測定TLC：簡便、快速

樣品需純化，吸附劑、展開劑及顯色與鑒別相似，要求更嚴(yán)格HPLC:適用于單體生物堿成分的含量測定

液—液分配色譜，液—固分配色譜，離子交換色譜GC：只適用于有揮發(fā)性，遇熱不分解的生物堿類。如麻黃堿、檳榔堿、苦參堿、顛茄類生物堿等（??！生物堿鹽在急速加熱器中產(chǎn)生的酸對(duì)色譜柱和檢測器不利）HPLC色譜柱中的硅醇基酸性較大，使保留時(shí)間延長，峰行變寬，拖尾。改進(jìn)流動(dòng)相：

①加入硅醇基抑制劑，競爭或部分阻斷硅醇劑的影響，最常用硅醇基抑制劑是二乙胺、三乙胺（TEA)等。

②合適的pH下，加入低濃度離子對(duì)試劑，通過與生物堿類成分生成離子對(duì)而掩蔽其堿性基團(tuán)。常用離子對(duì)試劑：辛烷磺酸鈉或十二烷基磺酸鈉。注意：清洗柱子，避免過夜，保證色譜柱的壽命。③加入季銨鹽試劑，掩蔽固定相表面的硅醇基，如在水－甲醇中加入0.01mol/L的溴化四甲基胺。

④加入電解質(zhì)緩沖鹽，通過改變流動(dòng)相離子強(qiáng)度，穩(wěn)定pH值及促進(jìn)離子對(duì)相互作用，起到改善峰形及分離效果的作用。改進(jìn)固定相：封尾技術(shù)，即鍵合反應(yīng)結(jié)束后，用三甲