DB14T 3007-2024 化妝品用原料 重組人源化膠原蛋白的鑒定

ICS11.120.20CCSC30地 方 標 準DB143007—2024化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定Identificationprocessofrecombinanthumanizedcollagen（報批稿）在提交反饋意見時，請將您知道的相關專利連同支持性文件一并附上。2024-05-29發(fā)布 2024-08-28實施??發(fā)布DB143007DB143007—2024II前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司提出。本文件由山西省化妝品標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司，山西省檢驗檢測中心（山西省標準計量技術研究院）。本文件主要起草人：王建、于玉鳳、盧彥宏、孫丹丹、何振瑞、李喜梅、張朝敏、張永健、劉欣。DB143007DB143007—2024PAGEPAGE1化妝品用原料 重組人源化膠原蛋白的鑒定范圍本文件適用于化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定。本文件規(guī)定了化妝品用原料重組人源化膠原蛋白的鑒定項目、材料和設備、鑒定方法、結果判定等。規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。YY/T1888-2023重組人源化膠原蛋白中華人民共和國藥典（2020年版）術語和定義YY/T1888-2023界定的以及下列術語和定義適用于本文件。肽段覆蓋率（氨基酸序列覆蓋度）Peptidecoverage肽段覆蓋率（氨基酸序列覆蓋度）是指檢測到的肽段的氨基酸數(shù)量占該蛋白質總氨基酸數(shù)量的比例。蛋白質經過酶切后，采用LC-MS進行檢測，鑒定到的酶切后肽段占理論序列氨基酸數(shù)量的比例。末端氨基酸序列Terminalaminoacidsequence末端氨基酸序列是指蛋白質序列中N端和C端的一段序列。原理選用適宜的蛋白酶對重組人源化膠原蛋白進行酶解，酶解后的肽段采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀檢測肽段覆蓋率和氨基酸序列。依據(jù)樣品氨基酸序列與人膠原蛋白某亞型序列匹配度判斷是否為重組人源化膠原蛋白。材料和設備試劑和材料水：GB/T6682，一級；碳酸氫銨：純度99.5；鹽酸胍：純度99%；二硫蘇糖醇（DTT）：純度99%；碘乙酰胺（IAM）純度≥99；甲酸：質譜級；乙腈：質譜級；超濾管；胰蛋白酶（Trypsin）：測序級。注：根據(jù)不同蛋白序列選擇適合的酶進行酶切，可采用多種酶切綜合鑒定，常用的蛋白內切酶還有賴氨酸蛋白酶（Lys-C）、谷氨酰蛋白內切酶（Glu-C）、天冬氨酸蛋白酶（Asp-N）等。試劑配制碳酸氫銨溶液（50mmol/L）0.395g100mL水中，混勻。鹽酸胍溶液（6mol/L）28.66g50mL的碳酸氫銨溶液（5.2.1）中，混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。DDT溶液（1mol/L）0.154g二硫蘇糖醇溶于鹽酸胍溶液（5.2.2）中，混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。IAM溶液（1mol/L）0.185gIAM1mL鹽酸胍溶液（5.2.2）中，混勻后避光放置（現(xiàn)用現(xiàn)配）。Trypsin溶液（0.2μg/μL）20μgTrypsin100μL水中，混勻。0.11mL1000mL,混勻。0.1500μL500mL乙腈中，混勻。儀器設備高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質譜儀:配有電噴霧離子源（ESI）。12000r/min。0.0001g。水浴鍋：溫度均勻度0.3℃。渦旋振蕩器。鑒定方法樣品處理1) 取100μL重組人源化膠原蛋白溶液(1μg/μL)置于超濾管接收管中，12000r/min離心15min；2) 性加入100μL酸溶（5.2.；2μLDT溶液（5.23421；烷基化處理：超濾管接收管中加入5μLAM溶液（5.2.4，渦旋震蕩使蛋白均勻分布于溶液30min，14000g15min；100μL5.2.，1200rmn15mn酶切：將接收管取出置于新的超濾管中，再加入碳酸氫銨溶液（5.2.1）100μL，0.2Trypsin溶液（5.2.5）15μL，旋渦震蕩，使蛋白溶液均勻分布；3718小時；將超濾管倒置離心，收集溶液。儀器條件高效液相色譜參考條件a) 色譜柱：C18150*2.1mm（內徑）1.6μm，或相當者；b) A：0.1甲酸水溶液（5.2.6）；c) B：0.1甲酸乙腈溶液（5.2.7）；d) 流速：0.2mL/min；e) 柱溫：40℃；進樣體積：4μL；1。表1 色譜分離梯度時間（min）A（%）B（%）09821982177030205545215952559525.198230982質譜參考條件離子源：ESI；檢測方式：正離子模式；MS2002000m/z；MS/MS502500m/z。數(shù)據(jù)分析產生的原始數(shù)據(jù)及圖譜由數(shù)據(jù)分析軟件識別標峰并導出對應圖譜，通過質譜數(shù)據(jù)和相關質譜鑒定圖譜進行數(shù)據(jù)庫匹配，得出肽段覆蓋率及末端氨基酸序列鑒定結果（具體示例見附錄A中A.1及A.2）。結果判定樣品檢測出的氨基酸序列需與理論氨基酸序列一致，肽段覆蓋率需達到100%。將氨基酸序列檢測結果和人膠原蛋白某亞型序列進行比對，判斷樣品是否為重組人源化膠原蛋白(具體比對示例見附錄A中A.3）。100%，為“A型重組人源化膠原蛋白”；匹配度大于等于80%100%，為“B型重組人源化膠原蛋白”；匹配度小于80%，則該樣品不屬于重組人源化膠原蛋白。DB143007DB143007—202400附錄 A（資料性）一種重組人源化膠原蛋白質譜鑒定結果肽段覆蓋率鑒定結果示例。A.1Trypsin（TIC）A.1TrypsinPeptideRTMassCalc.MassAdductStatesGPAGER2.0585.284585.287M+2H:M+HGER2.2360.173360.176M+HGAPGER2.2585.284585.287M+2H:M+HGAPGFR6.85603.309603.313M+2H:M+H8.451092.551092.56M+3H:M+2H:M+H8.811093.541093.54M+3H:M+2H:M+H9.051093.541093.54M+3H:M+2H:M+HDB143007DB143007—2024PAGEPAGE1圖A.2重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解肽段覆蓋率末端序列鑒定結果示例。圖A.3重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產物C末端肽段序列圖A.4重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產物C末端肽段二級譜圖圖A.5重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產物N末端肽段序列圖A.6重組人源化膠原蛋白Lys-C酶解產物N末端肽段二級譜圖氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫比對檢測得到氨基酸序列為（GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAP）16，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫（https:///Blast.cgi），點擊“ProteinBLAST”，進入blastpsuite界面，在E