可見和紫外分光光度法

第十三章可見和紫外分光光度法本章教學(xué)要求本章教學(xué)要求生疏吸取光譜、透光率與吸光度了解分光光度法及其分類分光光度法(spectrophotometry)是一種現(xiàn)代儀器分析方法，它是利用物質(zhì)的為可見分光光度法；10nm~380nm為紫外分光光度法(200nm~380nm)；780nm~3105nm為紅外分光光度法?？梢?紫外分光光度法通過測(cè)定物質(zhì)對(duì)特定波長(zhǎng)光的吸取，求出物質(zhì)的含量10-3molL-1～10-6mol?L-1；相對(duì)誤差雖比滴定分析大，但對(duì)微量分析而言，確定誤差微小含量及爭(zhēng)論生化過程等。本章主要學(xué)習(xí)可見-紫外分光光度法根本原理和方法?！」庾V和朗伯－比耳定律一、吸取光譜的產(chǎn)生與吸取曲線〔一〕原子光譜和分子光譜12當(dāng)原子中的電子吸取或釋放肯定能量后將從一個(gè)能級(jí)(E)軌道躍遷到另一個(gè)能級(jí)(E)軌道上，吸取或釋放的能量可以是具有肯定波長(zhǎng)的光。產(chǎn)生的與躍遷前后兩個(gè)能級(jí)的能量差有關(guān)12 c hc hc hc

E

E E2 1h為普朗克常量；c為光速；為頻率。此類性質(zhì)的分析法稱為原子光譜法。eE、分子振動(dòng)能級(jí)的能量eEE。在每一電子能級(jí)上有很多間距較小的振動(dòng)能級(jí)，v rE約e區(qū)的分子吸取光譜的分析方法稱為可見-紫外分光光度法(visibleandultravioletspectrophotometry,VIS-UV)。由于可見-紫外吸取光譜主要產(chǎn)生于價(jià)電子在電子能級(jí)間的躍遷，所以也將其稱為電子光譜方法。振動(dòng)能級(jí)間的能量差E約為v0.05eV～1eV，相當(dāng)于紅外光的能量。而轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的能量差Er

eV～是帶狀光譜。測(cè)定。紅外光譜常用于爭(zhēng)論有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)?！捕澄」庾V將不同波長(zhǎng)的單色光依次通過被分析的物質(zhì)溶液，分別測(cè)得不同波長(zhǎng)下的吸取程度，吸光度(absorbance)A為橫即為吸取光譜(absorptionspectrum)13-1KMnO4的吸取光譜。吸取光譜中，吸光

圖13-1max表示〔13-1max525n。圖525nm。溶液濃度愈大，吸取光譜的峰值愈高，兩者成正比關(guān)系。假設(shè)承受最大吸取波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，則靈敏度最高〔響應(yīng)值隨濃度的變化幅度最大，所以一般定量測(cè)定時(shí)選擇max波長(zhǎng)作為入射波長(zhǎng)。吸取光譜表達(dá)了物質(zhì)的特性，是進(jìn)展定性、定量分析的根底。二、透光率和吸光度0at s I的單色光通過溶液時(shí)，一局部能量被吸取I，一局部透過溶液樣品混濁或輻射熒光，則透射光中還包括樣品的散射光〔I〕和熒光〔I，見圖0at s 和參比溶液分別置于兩個(gè)同樣材料和厚度圖sr I和散Isr 0 a I=I +I 0 a 透射光強(qiáng)度I〔transmissionintensity〕與入射光強(qiáng)度I(incidentintensity)之比t oT表示T=It (13-2)I0多。AAA=-lgT=lgI0 (13-3)It吸光度與溶質(zhì)、溶劑、波長(zhǎng)、溫度、濃度及液層厚度等因素有關(guān)。三、朗伯－比耳定律1729年法國(guó)科學(xué)家布給(P.Bouguer)1760年德國(guó)科學(xué)家朗伯(J.Lambert)時(shí)，其吸光度與光通過的液層厚度成正比，即1A=kb (13-4)11溶液濃度及溫度有關(guān)。朗伯定律對(duì)全部的均勻介質(zhì)都是適用的。1德國(guó)科學(xué)家比耳(A.Beer)于1852年依據(jù)一系列的試驗(yàn)證明：當(dāng)肯定波長(zhǎng)的單色光通過溶液時(shí)，假設(shè)液層厚度肯定，則吸光度與溶液濃度成正比，即：2A=kc (13-5)22c為物質(zhì)的量濃度(或質(zhì)量濃度)，k是與吸光物質(zhì)種類、溶劑、入射光波長(zhǎng)、液層厚度和溶液溫度有關(guān)的常數(shù)。比耳定律僅適用于單色光。2(13-4)和式(13-5)，得：A=κbc (13-6)式中b的單位為cm，c(molL-1)為摩爾吸光系數(shù)(molar[”kp]Lmol-1cm-1。(gL-1)表示溶液的組成標(biāo)度，則朗伯－比耳定律可表示為：A=abρ (13-7)(massabsorptivity)Lg-1cm-1。a和κ可通過下式相互換算：Bκ=aM (13-8)BBM表示被測(cè)物質(zhì)的摩爾質(zhì)量。B吸光系數(shù)κ(a)隨不同的物質(zhì)、波長(zhǎng)、溶劑及溫度而異，所以它可以表示愈大，max測(cè)定。通常所說的吸光系數(shù)也指的是在吸取光譜中max

時(shí)的κ。)之間為正比關(guān)系，而透光率與溶液濃度(或液層厚度)之間為指數(shù)函數(shù)關(guān)系：-lgT=κbcT=10-κbc (13-9)在化合物組成不明的狀況下，物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量無從知道，物質(zhì)的量濃度100mL溶液中含被測(cè)物質(zhì)1g，液層厚度b1cm時(shí)的吸光度E1%1cm

表示，它與a的關(guān)系為：a0.1E1%1cm

(13-10)14-1】朗伯－比耳定律計(jì)算Fe2+1.810-5molL-1Fe2+顯色*2.0cm508nm處測(cè)得A=0.38，計(jì)算摩爾吸光系數(shù)?！窘狻喀?A=

0.38

=1.1104Lmol-1cm-1bc 2.0cm1.8105molL1κ，測(cè)定的靈敏度就愈高。κ與溶液的濃度及液層厚度無關(guān)。其次節(jié)可見-紫外分光光度法一、可見及紫外分光光度計(jì)(13-3)。圖〔一〕輻射光源(lightsource)在所需光譜區(qū)域內(nèi)能放射連續(xù)的具有足夠強(qiáng)度和穩(wěn)定的輻射光，并且輻射能隨波長(zhǎng)的變化盡可能小，使用壽命長(zhǎng)。320nm~2500nm。165nm~350nm范圍內(nèi)發(fā)出連續(xù)光200nm~350nm?！捕硢紊?monochromator)是從光源輻射的復(fù)合光中分出單色光的裝置。最常用的色散元件有棱鏡和光柵。光區(qū)。光柵的區(qū)分率在整個(gè)光譜范圍內(nèi)是均勻的，使用起來更便利。〔三〕吸取池可見及紫外分光光度法中，將被測(cè)液體放在分光光度計(jì)光束通過的液體池中，用來盛放溶液的容器稱為吸取池(absorptioncell)?？梢姽鈪^(qū)的吸取池用一般10-2cm~10cm或更厚，0.5cm、1cm、2cm，視分析需要選用?！菜摹彻饷魴z測(cè)器分光光度計(jì)中的光敏檢測(cè)器(photosensitive detector)一般用光電管(photoelectriccell)，當(dāng)光照耀到陰極時(shí)，外表金屬放射電子，流向電位較高的陽生光電流。光愈強(qiáng)，陰極外表放射的電子愈多，產(chǎn)生的光電流也愈大。光電管因敏感的光譜范圍不同而分為藍(lán)敏和紅敏光電管兩種前者可用波長(zhǎng)范圍為210nm~625nm，而后者可用范圍為625nm~1000nm。譜的精細(xì)構(gòu)造有較好的區(qū)分力量。強(qiáng)度呈線性響應(yīng)，響應(yīng)快，高穩(wěn)定和低“噪音”水平。二、測(cè)定方法及應(yīng)用測(cè)物質(zhì)含量。(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線法的方法：取標(biāo)準(zhǔn)品配成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定波特長(zhǎng)(通常為max)，圖13-4在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。承受空白溶液(blanksolution)作比照。在可見光區(qū)常用的空白溶液有以下三種：液。試劑空白假設(shè)顯色劑有色，試樣溶液在測(cè)定條件下無吸取或吸取很小時(shí)，(不加被測(cè)試樣溶液)后所得溶液，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線法中濃度為“0”的標(biāo)準(zhǔn)溶液。試樣空白當(dāng)試樣基體有色如試樣溶液中混有其它有色離子不加顯色劑但按顯色反響一樣條件進(jìn)展操作的試樣溶液。(二)標(biāo)準(zhǔn)比照法s x s (c表示)處測(cè)AAs x s cxAxcAs s

(13-11)此方法適用于格外常性的分析工作。(三)比吸光系數(shù)比較法E1%1cm

值進(jìn)展定量測(cè)定的，我國(guó)藥典(2023年版)中規(guī)定某些藥物的測(cè)定一般承受此法。馬上樣品的比吸光系數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比吸光系數(shù)(可從手冊(cè)上查得)比較，計(jì)算出樣品含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)或體積分?jǐn)?shù))。例如：廣譜抗菌藥呋喃妥因的E1%1cm

(367nm)=746，在一樣條件下，測(cè)定呋喃妥因樣品的E1%1cm

(367nm)=738，因此，該樣品中呋喃妥因的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7380.9893。746(四)差示分光光度法(differentialspectrophotometry)1希斯金(Hiskey)提出：用濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液c〔應(yīng)與它的待測(cè)樣品濃度相近〕作參比112溶液調(diào)零，然后測(cè)定同種未知濃度c2樣品的吸光度，可以削減相對(duì)誤差。差示法測(cè)定的是兩者濃度之差2-1，假設(shè)測(cè)定誤差為%，差示法所測(cè)得結(jié)果是2-c，非c2c·x%，明顯差示法相對(duì)誤差較小。12AAxAs的差值：x s x A=(A-A)=b(c-c)=bx s x 式(13-12)A與c成正比，據(jù)此，即可計(jì)算試樣溶液的濃度。在實(shí)際操作中配置一度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。最終從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出待測(cè)樣品的濃度。設(shè)按一般分光光度法測(cè)得的某標(biāo)準(zhǔn)溶液的透光率為10=1，其待測(cè)樣品溶液的透光率為5A=1.3此時(shí)試樣溶液的透光率亦被擴(kuò)展為50A=0.，從而提高了測(cè)量的準(zhǔn)確度。實(shí)際上差示法是將量程范圍擴(kuò)展，因此也稱為擴(kuò)展量程光度法〔expandedscalespectrophotometry。但差示吸取光度法也不是無限度的應(yīng)用，它還受到儀器本身靈敏度及測(cè)量噪音的限制。三、測(cè)定誤差的分析源不穩(wěn)定及讀數(shù)不準(zhǔn)等因素引起的。它使測(cè)得的透光率T與真實(shí)值相差T，從c。由朗伯－比耳定律可推導(dǎo)得出濃度的相對(duì)誤差與溶液透光率的關(guān)系式為：

0.434T

(13-13)c TlgT一般分光光度計(jì)由于讀數(shù)區(qū)分率引起的透光率測(cè)量誤差T一般約為0.01~。假設(shè)T0.01T值代(13-5)。圖13-520%~65%(A為：0.2~0.7)時(shí)，所產(chǎn)生的濃度相對(duì)誤差36.8%(A=0.434)時(shí)所產(chǎn)生的濃度相對(duì)誤差最小。在實(shí)際工20%~65%0.2~0.7之間。需要特別說明的是濃度測(cè)量誤差既依靠透光率T的讀數(shù)區(qū)分率，又依靠其它多T2.00.02廠家，以增加試驗(yàn)數(shù)據(jù)的牢靠性。*閱讀資料：第三節(jié)原子吸取分光光度法一、原子吸取分析進(jìn)展史在1802年烏拉斯頓(Wollaston)觀看到太陽光譜中存在著很多暗線，但是不能解釋暗線的本質(zhì)。直到1859年克希霍夫〔Kichoff〕和本生(Bunsen)在爭(zhēng)論火焰中的光譜時(shí)，確定了2030測(cè)汞困難大，所以人們利用原子吸取光譜的原理設(shè)計(jì)了測(cè)汞儀。瓦爾什〔Walsh〕提出了原子吸取光譜作為一般分析方法廣泛應(yīng)用的可能性，并爭(zhēng)論了吸光度與原子濃度之間的關(guān)系。此后，原子吸取光譜(atomicabsorptionspectrometry)作為一種分析方法才進(jìn)展起來。20世紀(jì)60年月后，進(jìn)展了非火焰原子吸取—石墨爐，使原子吸取分析的元素范圍和靈敏度到達(dá)了階段。二、原子吸取分析工作原理〔空心陰極燈II，透過0T=I/I，II符合朗伯-比耳定律：0 0=I IeKNL=0KN為自由原子總數(shù)〔近似于基態(tài)原子數(shù)L為吸取層厚度。A=-lgT=lgI0=0.4343KNLI此式說明，AN成正比。在實(shí)際分析過程中，當(dāng)試驗(yàn)條件肯定時(shí)，Nc。因此，以標(biāo)準(zhǔn)系列做出工作曲線后，即可依據(jù)吸光度的大小，求得待測(cè)元素的含量。三、原子吸取分光光度計(jì)圖原子吸取分光光度計(jì)由光源、原子化器、單色器、檢測(cè)器四個(gè)主要局部組成〔13-6所示。光源：使用廣泛的是空心陰極燈hollow-cathodelam，它是一種陰極呈空心圓柱性氣體〔氖或氬，在兩極間加100-400V的線光譜，光束強(qiáng)度大。原子化器(atomizer)射光束在這里被基態(tài)原子吸取。因此，它可視為“吸取池火焰原子化器(flameatomizer)：是將液體試樣經(jīng)噴霧器形成霧滴，這些霧滴在霧花室中與氣體〔燃?xì)夂椭細(xì)狻尘鶆蚧旌?，再進(jìn)入燃燒器形成火焰。此時(shí)，試液便在火焰中產(chǎn)生原子蒸氣。非火焰原子化器：廣泛應(yīng)用的是石墨爐(graphitefurnace)。單色器單色器(monochromator)的作用是將燈放射的被測(cè)元素的共振線與其它波長(zhǎng)輻射分開。檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)器(detector)。溝通放大，讀數(shù)裝面積積分法進(jìn)展測(cè)定。四、定量分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：配制一系列適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，由低到高濃度依次噴入火焰，分別A,A為縱坐標(biāo)，被測(cè)元素濃度〔或含量〕c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在一樣條件下，噴入被測(cè)樣品，測(cè)定其吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得樣品中被測(cè)元素的濃度或含量。標(biāo)準(zhǔn)參加法：當(dāng)樣品基體影響較大，又沒有純潔的基體空白或測(cè)定純物質(zhì)中極微量的元素時(shí)，可以承受此方法。分別