2024胎兒彎曲桿菌的分離鑒定方法

胎兒彎曲桿菌的分離鑒定方法PAGEPAGE10胎兒彎曲桿菌的分離鑒定方法范圍本文件規(guī)定了胎兒彎曲桿菌（Campylobacterfetus）的分離鑒定方法。（GB/T6682GB19489 本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義?？s略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）實(shí)時(shí)熒光PCR：實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timepolymerasechainreaction）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）rRNA：核糖體核糖核酸（Ribosomalribonucleicacid）Ct值：循環(huán)閾值（CycleThresholdvalue）PCRPCR（412000g以上。5.6天平0.01g.0001。5.7冰箱（2℃~8-20。（0.2μL~2μL、1μL~10、10μL~100、20μL~200、100μL~1000μL，并配。（5%10%85%氮?dú)狻?.12（10×~100×）（MALDI-TOFMS）5.1836℃±11005.19要求GB/T6682GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。培養(yǎng)基按附錄A（tanspotenrchentedu,TEMA的1Skirrow血瓊脂：按照附錄AA.2哥倫比亞血瓊脂：按照附錄AA.3AA.4氧化酶溶液：按照附錄AA.53%過(guò)氧化氫溶液：按照附錄AA.6疏基乙酸鹽肉湯：按照附錄AA.7馬尿酸鈉水解試劑：按照附錄AA.85%PBS。PCR-氰-（AC胎兒彎曲桿菌胎兒亞種ATCC27374或胎兒彎曲菌性病亞種ATCC19438。材料細(xì)菌DNA（。2mL520樣品樣品TEMTEM增菌運(yùn)輸培養(yǎng)基36℃±1℃ 3d接種于接種于Skirrow培養(yǎng)基36℃±1℃ 質(zhì)譜鑒定生化鑒定3636℃±1℃ 質(zhì)譜鑒定生化鑒定可疑菌落接種于哥倫比亞血瓊脂 可疑菌落提取可疑菌落接種于哥倫比亞血瓊脂可疑菌落提取DNA四選一四選一實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定PCR鑒定胎兒彎曲桿菌5%mL5%20mL~30mLPBS15s~20s5%PBS5%AI3mL5%AI20mL~30mLPBS4~5無(wú)菌采集流產(chǎn)胎兒的肝、肺和胃內(nèi)容物及胎盤(pán)，置于無(wú)菌塑封袋或其它密閉容器中。低溫（4℃~8℃保存，避免直接接觸冰塊）微需氧環(huán)境下保存樣品，盡快送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。若樣品不能在采樣當(dāng)天送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，可將樣品液靜置1min-2min，用滅菌注射器吸取上清液1mL，注入增菌運(yùn)送培養(yǎng)基（TEM）中送檢。分離300Skirrow36℃±13d~5d。3500g500μLPBS36℃±13d~5d。SkirrowSkirrowPBSSkirrow36℃±13d~5d。36℃±1200μLSkirrow36℃±13d~5d。純化Skirrow1~336℃±1℃培養(yǎng)3d~5d（不少于3個(gè)）進(jìn)行后續(xù)鑒定。挑取純化菌落，革蘭氏染色、鏡檢。胎兒彎曲桿菌為革蘭氏染色陰性，呈螺旋狀或“S”狀，一些老齡培養(yǎng)物可出現(xiàn)球狀或球桿狀，不形成芽胞和莢膜，在菌體的一端或兩端有鞭毛。挑取純化菌落，懸浮于1mL布氏肉湯中，用相差顯微鏡觀察，胎兒彎曲桿菌呈螺旋狀運(yùn)動(dòng)。用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒挑取純化菌落至氧化酶試劑潤(rùn)濕的濾紙上，如果在10s內(nèi)出現(xiàn)紫紅色、紫羅蘭或深藍(lán)色為陽(yáng)性。3%30s（H2S）試驗(yàn)20×6mm61℃72h，如見(jiàn)濾紙變黑即為產(chǎn)生H2S8.4.6254225℃±142℃±13d1%3.5%3d，0.4mLl%20.2mL茚三,20min注：上述生化實(shí)驗(yàn)也可使用商品化生化鑒定試劑盒、生化鑒定卡、微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行。1表1胎兒彎曲桿菌生化反應(yīng)菌名氧化酶試驗(yàn)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)硫化氫試驗(yàn)生長(zhǎng)試驗(yàn)馬尿酸鈉水解試驗(yàn)25℃42℃1%甘氨酸3.5%氯化鈉胎兒彎曲桿菌胎兒亞C.fetussubsp.fetus+++VVb+--胎兒彎曲桿菌性病亞種C.fetussubsp.venerealis+V-VVb空腸彎曲桿菌C.jejuni+Va+-VcV-+豚腸彎曲桿菌C.hyointestinalis++n.d.-+V-n.d.唾液彎曲桿菌C.sputorum+Vn.d.-+++n.d.”——陽(yáng)性反應(yīng)；“-”——陰性反應(yīng)；“V”反應(yīng)不定；“n.d.”未確定；空腸彎曲桿菌空腸亞種陽(yáng)性,;42°C生長(zhǎng);空腸彎曲桿菌空腸亞種陽(yáng)性，空腸彎曲桿菌德萊亞種陰性。PCRDNA從哥倫比亞血瓊脂上挑取4~5個(gè)胎兒彎曲桿菌疑似單菌落于500μL無(wú)菌水中混勻，放置于干式恒溫金屬浴中10min，冷卻后，12000g離心2min，上清液即為DNA模板。獲得的DNA模板立即使用或放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。也可使用等效的商品化?xì)菌DNA提取試劑盒并按其說(shuō)明書(shū)制備DNA模板。PCR胎兒彎曲桿菌引物信息見(jiàn)表2。2PCR檢測(cè)用引物探針信息組分名稱(chēng)序列目的基因片段長(zhǎng)度MG3FGGTAGCCGCAGCTGCTAAGATcstA764bpMG4RTAGCTACAATAACGACAACT檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。使用胎兒彎曲桿菌胎兒亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27374或胎兒彎曲菌性病亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19438為陽(yáng)性對(duì)照，使用除胎兒彎曲桿菌之外的其他彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陰性對(duì)照，以無(wú)菌雙蒸水為空白對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。PCR胎兒彎曲桿菌PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系見(jiàn)表3。表3胎兒彎曲桿菌PCR反應(yīng)體系組分名稱(chēng)體積（μL）PCR預(yù)混液（2×）12.5上游引物（10μmol/L）1.0下游引物（10μmol/L）1.0DNA模板（20ng/μL）2.0無(wú)菌雙蒸水8.5總量25.0PCR95330s54℃退火30110。電泳取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析。（764陽(yáng)性結(jié)果：在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下，待測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大?。?64bp）的擴(kuò)增條帶，且經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為目標(biāo)條帶，判定PCR結(jié)果為陽(yáng)性，該菌株是胎兒彎曲桿菌。陰性結(jié)果：在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下，待測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大小（764bp）的擴(kuò)增條帶，且經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為非目標(biāo)條帶，判定PCR結(jié)果為陰性，該菌株不是胎兒彎曲桿菌。（764PCRPCR產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)附錄B的B.1，片段測(cè)序結(jié)果見(jiàn)附錄B的B.2。PCRDNA同8.5.1.PCR胎兒彎曲桿菌的引物探針信息見(jiàn)表4。4PCR組分名稱(chēng)序列目的基因片段長(zhǎng)度16SFw5′-GCACCTGTCTCAACTTTC-3′16SrRNA78bp16SRv5′-CCTTACCTGGGCTTGAT-3′16SPb5′-VIC-ATCTCTAAGAGATTAGTTG-MGB/NFQ-3′同8.5.2.2。PCR胎兒彎曲桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表5。表5胎兒彎曲桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系組分名稱(chēng)體積（μL）PCR（2×）10.0上游引物（10μmol/L）0.4下游引物（10μmol/L）0.4探針（10μmol/L）0.2DNA模板（20ng/μL）4.0無(wú)菌雙蒸水5.0總量20.0PCR955min，9510305min（60PCRPCR。CtCt值陽(yáng)性結(jié)果：SCtPCR結(jié)果陽(yáng)性，該菌株是胎兒彎曲桿菌。S35<Ct40C3，PCR陰性結(jié)果：在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下，被檢樣品無(wú)特異性S型擴(kuò)增曲線(xiàn)，判定為實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果陰性，該菌株不是胎兒彎曲桿菌。胎兒彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)見(jiàn)附錄C的C.1。1檢測(cè)樣品前，應(yīng)對(duì)微生物質(zhì)譜儀進(jìn)行校準(zhǔn)。測(cè)定取制備好的樣品靶板置質(zhì)譜儀靶板槽中。編輯樣品信息后，進(jìn)行譜圖數(shù)據(jù)采集。DD.1。生化鑒定、PCR鑒定、實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定和質(zhì)譜鑒定四種方法任選其一。實(shí)驗(yàn)室設(shè)施設(shè)備、人員防護(hù)及實(shí)驗(yàn)的安全操作、實(shí)驗(yàn)廢棄物和菌種的處理應(yīng)符合GB19489的要求。附錄A（）(transportenrichmentmedium,TEM)成分5-1000mL0.3g0.13多粘菌B100000IU1%煌綠5mLA.1.2制法A.1.120mL的玻82min--3min(無(wú)壓力)氧氣(O2)10%(CO2),85%氮?dú)?N2)]TEM44個(gè)月。Skirrow（Skirrowbloodagar）蛋白胨 15.0g胰蛋胨 2.5g酵母膏 5.0g氯化鈉 5.0g瓊脂 15.0g蒸餾水 1000.0mL將A.2.1.1中各成分溶于蒸餾水中，121℃滅菌15min，備用。FBP溶液丙酮鈉 0.25g焦亞酸鈉 0.25g硫酸鐵 0.25g蒸餾水 100.0mL將A.2.2.10.22FBP-70℃儲(chǔ)存不超過(guò)-20萬(wàn)古素（vancomycin） 0.0075g三甲芐氨啶（trimethoprim） 0.0038g多粘素B（polymyxinB） 1900IU放線(xiàn)酮（actidione） 0.0375g兩性素B（amphotericinB） 5.0g乙醇/滅水（50/50，體積數(shù)） 5.0mL將A.2.3.1中各成分溶解于乙醇/滅菌水混合溶液中。10基礎(chǔ)養(yǎng)基 1000.0mLFBP溶液 5.0mL抗生溶液 5.0mL無(wú)菌纖綿血 50.0mL當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度約為45℃左右時(shí)，加入FBP溶液、抗生素溶液與凍融的無(wú)菌脫纖維綿羊血，混勻。校正pH至7.4±0.2（25℃）。傾注15mL于無(wú)菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。預(yù)先制備的平板未干燥時(shí)在室溫放置不得超過(guò)4h，或在4℃左右冷藏不得超過(guò)7d。動(dòng)物織解物 15.0g淀粉 1.0g氯化鈉 5.0g瓊脂 8.0~18.0g蒸餾水 1000.0mL將A.3.1.1中各成分溶于蒸餾水中，121℃滅菌15min，備用。10基礎(chǔ)養(yǎng)基 1000.0mL無(wú)菌纖綿血 50.0mL當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度為45℃左右時(shí)，無(wú)菌加入綿羊血，混勻。校正pH至7.3±0.2（25℃）。傾注15mL完全培養(yǎng)基于無(wú)菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。制備的平板未干燥時(shí)在室溫放置不得超過(guò)4h，或在4℃左右冷藏不得超過(guò)7d。酪蛋白酶解物動(dòng)物組織酶解物10.0g10.0g葡萄糖1.0g酵母浸膏2.0g氯化鈉5.0g亞硫酸氫鈉0.1g蒸餾水1000.0mL將.4.11H至7.002（25℃1215i，備用。1%3（H2O2）30%H2O2 10mL蒸餾水 90mL裝于棕色瓶中，有效期為一周。成分胱氨酸 0.5mg氯化鈉 2.5mg右旋糖 5.5g酵母膏 5.0g（PancreaticDigestofCasein）15.0g巰基酸鈉 0.5g蒸餾水 1000.0mL制法A.6.1pH7.2±0.2,5mLkPa151%馬尿鈉 1g蒸餾水 100mL茚三酮 3.5g丙酮 50mL丁酮 50mL附錄B（資料性）胎兒彎曲桿菌PCR產(chǎn)物大小和測(cè)序結(jié)果對(duì)照cstAPCR見(jiàn)圖B.1。圖B.1 兒曲標(biāo)菌菌cstAPCR物圖M：DL2000DNAMarker；1：胎兒彎曲桿菌ATCC27374cstAtatttatattaaccgcggttgatgccggtactagaacaggacgatttatggtacaagatatactaggtaacgttcataaaccaataggtgatacaaaaaactggttttggggtattatagctactataatatgcgttactggctggggatacctactatatagcggtgttactgaccctatgggaggtatattcacactttggcctctatttggcgcggcaaatCaaatgctagccggcatcgctcttatgcttggaaccgtagtattatttaaaatgggaaaagcaaaatactcatgggttactatagctcctcttgtttgggtgcttataactacaatgtatgcagcatatcaaaaacttcttccggcaaatggagagagagttcatgacgccgtaagtcacatagctactgct