(高清版)GBT 40170-2021 質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則

GB/T40170—2021國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40170—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC387)提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院生物研究所、通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司、深圳市分析測(cè)省商業(yè)科技研究所有限公司。1GB/T40170—2021質(zhì)粒抽提及檢測(cè)通則1范圍及廢棄物處理。本文件適用于質(zhì)粒的抽提及檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件GB4789.3食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)通用要求和定義GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)GB/T34265Sanger法測(cè)序技術(shù)指南GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測(cè)紫外分光光度法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1質(zhì)粒plasmid細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體(或擬核)以外的一個(gè)或多個(gè)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子。3.2核糖核酸酶ARNaseA一種催化水解核糖核酸的核糖部分3'和5'磷酸二酯鍵，形成具有2',3'-環(huán)一磷酸衍生物寡聚核苷酸的核酸酶。3.3細(xì)菌內(nèi)毒素bacterialendotoxin由親水性的雜多糖和一個(gè)共價(jià)結(jié)合的類脂A組成的復(fù)合物。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)2GB/T40170—2021DNase:脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease)HPLC:高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)5一般性原則質(zhì)粒作為基因工程重組技術(shù)的常用載體，質(zhì)粒的質(zhì)量(濃度、構(gòu)型、純度、內(nèi)毒素含量)是蛋白表達(dá)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。獲得高純度的質(zhì)粒，需要實(shí)驗(yàn)者理解質(zhì)粒提取原理，針對(duì)不同菌種、不同性質(zhì)和大小的質(zhì)粒，選用恰當(dāng)?shù)姆椒?，有效地控制提取過程中的各種影響因素。6抽提原理因組DNA等雜質(zhì)，經(jīng)異丙醇或乙醇沉淀DNA,最終得到純化質(zhì)粒。7抽提方法7.1抽提方法的選擇質(zhì)粒抽提時(shí)應(yīng)結(jié)合菌種以及含有的質(zhì)粒的特性、實(shí)際應(yīng)用等綜合選擇抽提方法和試劑，可考慮包括但不限于以下因素：——大質(zhì)粒在抽提過程中容易受損，宜用溫和裂解法，操作輕柔，最大程度緩沖高滲透壓的細(xì)菌質(zhì)粒釋放時(shí)的壓力；——小分子質(zhì)量質(zhì)?？梢赃x用相對(duì)較劇烈的方法來分離；——一些菌株用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放較多的糖類，這類菌株制備質(zhì)粒時(shí)，需注意裂解溫度；-—具有限制性核酸內(nèi)切酶A的菌株建議采用酚-氯仿進(jìn)行抽提；——在細(xì)菌繁殖的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期加入氯霉素可以增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。7.1.2抽提方法分類及特點(diǎn)根據(jù)抽提原理，可將質(zhì)粒抽提方法分為四類，即硅膠柱法、磁珠法、酚-氯仿法和離子交換法?；驹砑疤攸c(diǎn)見表1。表1幾種質(zhì)粒抽提原理及特點(diǎn)方法原理特點(diǎn)硅膠柱法高鹽條件下，硅膠與DNA分子有高親和力，低鹽或雙蒸適用于高通量質(zhì)粒小量抽提磁珠法采用一種納米磁珠微珠材料，該磁珠經(jīng)硅羥基修飾后，DNA分子可與之發(fā)生特異性結(jié)合適用于微量樣品的提取，效率高，便于自動(dòng)化操作酚-氯仿法酚使蛋白質(zhì)變性并抑制DNase活性，氯仿去除過量酚、利于有機(jī)相與液相分層，異丙醇具有強(qiáng)疏水作用，用于質(zhì)粒三級(jí)結(jié)構(gòu)完整，適用于高質(zhì)量質(zhì)粒抽提3GB/T40170—2021表1(續(xù))方法原理特點(diǎn)離子交換法低鹽低pH條件下，DNA與離子交換劑結(jié)合，高鹽高pH條件下洗脫DNA適用于大規(guī)模質(zhì)粒抽提，超螺旋比例高7.2操作步驟硅膠柱法抽提操作步驟按照商業(yè)吸附柱抽提試劑盒說明書進(jìn)行。磁珠吸附法抽提操作步驟按照商業(yè)磁珠法抽提試劑盒說明書進(jìn)行。酚-氯仿法抽提操作步驟按照附錄A進(jìn)行。離子交換法抽提操作步驟按照附錄B進(jìn)行。8檢測(cè)8.1檢測(cè)項(xiàng)目質(zhì)粒的檢測(cè)包括液體外觀、序列驗(yàn)證、濃度測(cè)定、純度檢測(cè)、超螺旋比例檢測(cè)、殘余RNA和殘余基因組DNA檢測(cè)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)、限制酶酶切分析、細(xì)菌檢測(cè)等項(xiàng)目，根據(jù)不同的項(xiàng)目采用不同的檢測(cè)方法。8.2檢測(cè)項(xiàng)目的選擇酶切分析。用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)(哺乳動(dòng)物細(xì)胞)、病毒傳導(dǎo)、CAR-T等細(xì)胞治療相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)制備、基因疫苗和基因治療研究、抗體或蛋白生產(chǎn)、動(dòng)物學(xué)研究等宜增加內(nèi)毒素檢測(cè)和細(xì)菌檢測(cè)試驗(yàn)。8.3檢測(cè)方法肉眼觀察，參考結(jié)果見附錄C。按照GB/T34265執(zhí)行，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，參考結(jié)果見附錄C。按照GB/T34796執(zhí)行，參考結(jié)果見附錄C。4GB/T40170—2021按照GB/T34796執(zhí)行，OD??o/OD?80在1.8至2.0之間，OD?6o/OD?30在2.0至2.5之間，瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)無其他雜帶，肉眼可見，可用于后續(xù)試驗(yàn)。參考結(jié)果見附錄C。采用高效液相色譜法檢測(cè)質(zhì)粒超螺旋比例，利用超螺旋質(zhì)粒和RNA,基因組DNA碎片的疏水性質(zhì)的差異，將待測(cè)樣超螺旋質(zhì)粒和其余DNA、RNA分離。方法、設(shè)備運(yùn)行參數(shù)按照附錄D執(zhí)行，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算目標(biāo)峰面積占所有峰面積的比值。參考結(jié)果見附錄C。8.3.6殘余RNA、殘余基因組DNA的檢測(cè)采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)殘余RNA、殘余基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，肉眼可見，且限制酶酶切分析后不消失。參考結(jié)果見附錄C。采用鱟試劑檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，檢測(cè)方法見中華人民共和國(guó)藥典：2020年版.四部，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。參考結(jié)果見附錄C。8.3.8限制酶酶切分析質(zhì)粒用限制性酶酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，參考結(jié)果見附錄C。按照GB4789.3中的大腸菌群計(jì)數(shù)-平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行，同時(shí)以涂布生理鹽水平板為對(duì)照，無菌落生長(zhǎng)。參考結(jié)果見附錄C。9質(zhì)量控制9.1人員質(zhì)粒抽提和檢測(cè)技術(shù)人員應(yīng)由具備分子生物學(xué)、微生物學(xué)及相關(guān)教育背景的人員擔(dān)任。涉及質(zhì)粒抽提及檢測(cè)的技術(shù)人員應(yīng)該完全了解菌種培養(yǎng)的相關(guān)工作，應(yīng)掌握質(zhì)粒檢測(cè)等相關(guān)理論知識(shí)和相關(guān)試驗(yàn)基礎(chǔ)。檢測(cè)人員應(yīng)該接受適當(dāng)?shù)膬?nèi)部或者外部培訓(xùn)，培訓(xùn)的內(nèi)容應(yīng)該包括但是不限于：——菌種培養(yǎng)技術(shù)，包括無菌實(shí)驗(yàn)室操作技能；——掌握質(zhì)粒分子生物學(xué)特性；—-—定期進(jìn)行人員的測(cè)量能力考核。9.2儀器設(shè)備檢測(cè)儀器應(yīng)符合預(yù)期要求的性能參數(shù)和規(guī)格。儀器設(shè)備的使用應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行操作。主要分析設(shè)備的操作規(guī)程應(yīng)制定得詳細(xì)、清楚。定期對(duì)儀器設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)或校準(zhǔn)。5GB/T40170—2021質(zhì)粒抽提及檢測(cè)涉及的相關(guān)試劑需從具備專業(yè)資質(zhì)并經(jīng)過驗(yàn)證核實(shí)的供應(yīng)商處采購(gòu)，且具備檢驗(yàn)檢測(cè)試劑應(yīng)嚴(yán)格按照使用方法正確使用。實(shí)驗(yàn)室DNA污染一般來源于氣溶膠。因此，質(zhì)粒抽提和檢測(cè)以及實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域的組織及良好——嚴(yán)格的工作流程；10樣品保存質(zhì)粒抽提后應(yīng)附抽提和檢測(cè)報(bào)告單或等同的指導(dǎo)性文件，格式見附錄E。文件內(nèi)容應(yīng)至少包括以e)OD?o/OD?80;f)OD??0/OD230;i)基因組DNA殘留；j)細(xì)菌檢測(cè)；k)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)；m)限制酶酶切分析；o)保存條件及期限。廢棄物處理按照GB/T27403和GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。6GB/T40170—2021(規(guī)范性)酚-氯仿法A.1.1葡萄糖(Glucose,C?H?2O?)。A.1.2三羥甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM,Tris,C?H??NO?]。A.1.3鹽酸(Hydrochloricacid,HCl)。A.1.4乙二胺四乙酸二鈉(Ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt,Na?EDTA,C??H?N?Na?O?)。A.1.5核糖核酸酶A(RNaseA)。A.1.6氫氧化鈉(Sodiumhydroxide,NaOH)。A.1.7十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfate,SDS,C??H?5SO?Na)。A.1.8醋酸鉀(Potassiumacetate,CH?COOK)。A.1.9冰醋酸(AceticAcid,CH?COOH)。A.1.10鹽酸胍(GuanidineHydrochloride,Gu-HCl,CH?ClN?)。A.1.11乙醇(Ethanol,C?H?O)。A.1.12異丙醇(Isopropanol,C?H?O)。A.1.13苯酚(Phenol,C?H?OH)。A.1.14三氯甲烷(Trichloromethane,氯仿，CHCl?)。A.1.15異戊醇(Isoamylalcohol,3-甲基丁醇，C?H?2O)。A.1.16磁珠懸浮液(內(nèi)含特異性吸附質(zhì)粒的磁珠)。A.1.17溶液1(pH8.0):50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl,10mmol/LEDTA,100pg/mLRNaseA。A.1.18溶液2:200mmol/LNaOH,1%SDS。A.1.19溶液3(pH5.5):3mol/L醋酸鉀。A.1.20BufferW2:20mmol/LTris-Cl,75%乙醇。A.1.21TE溶液(pH8.0):10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA。A.1.2275%乙醇溶液(C?H?OH)。A.2操作步驟A.2.2向離心管中加入250μL溶液1(已加入RNaseA),渦旋振蕩使細(xì)胞重懸。A.2.3向離心管中加入250μL溶液2,溫和翻轉(zhuǎn)離心管6次～10次，使菌體充分裂解，液體變得澄清。A.2.4向離心管中加入350μL溶液3,溫和翻轉(zhuǎn)離心管6次～10次，此時(shí)可觀察到管內(nèi)出現(xiàn)白色絮狀物，12000r/min室溫離心10min。A.2.5取上清于新的2.0mLEP管中，并記錄體積。7A.2.7重復(fù)A.2.6。8(規(guī)范性)B.1試驗(yàn)試劑B.1.5核糖核酸酶A(RNaseA)。B.1.9冰醋酸(AceticAcid,CH?COOH)。B.1.10鹽酸胍(GuanidineHydrochloride,Gu-HCI,CH?ClN?)。B.1.12氯化鈉(Sodiumchloride,NaCl)。B.1.133-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS,C?H??NO?S)。B.1.16BufferP1(pH8.0):50mmol/LTris-Cl,10mmol/LEDTA,100μg/mLRNaseA。B.1.17BufferP2:200mmol/LNaOH,1%SDS。B.1.18BufferP3(pH5.5)B.2.6加入30mL預(yù)冷的BufferP3,立即顛倒混勻6次～8次(動(dòng)作要輕柔),在冰上孵育10min,B.2.7在層析柱的頂端加濾紙，沿濾紙邊緣緩慢加入20mL的BufferQBT(平衡層析柱)。B.2.8將B.2.6中的上清小心移到層析柱中(不可將沉淀繞動(dòng)),讓液體自由流下。9B.2.9加入20mLBufferQC清B.2.10加入20mLBufferQF洗脫DNA,準(zhǔn)備對(duì)應(yīng)的50mL的離心管分別收集洗脫液。B.2.15重復(fù)B.2.14。GB/T40170—2021(資料性)質(zhì)粒檢測(cè)參數(shù)及參考結(jié)果質(zhì)粒檢測(cè)參數(shù)及參考結(jié)果見表C.1。表C.1質(zhì)粒檢測(cè)參數(shù)及參考結(jié)果一覽表檢測(cè)項(xiàng)目參考結(jié)果液體外觀肉眼觀察清澈、透明序列驗(yàn)證與目標(biāo)序列一致，100%正確濃度檢測(cè)純度檢測(cè)OD?60/OD?302.0～2.5有無其他雜帶無超螺旋比例大于或等于80%瓊脂糖凝膠電泳不可見殘余基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳不可見細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)胞轉(zhuǎn)染用，<0.1EU/μgDNA限制酶酶切分析可見目的條帶細(xì)菌檢測(cè)無菌落生長(zhǎng)GB/T40170—2021(規(guī)范性)——將疏水層析柱Source15PHE