(高清版)GBT 40254-2021 輪枝菌屬實時熒光PCR檢疫鑒定方法

ICSCCS65.020.01GB/T40254—2021輪枝菌屬實時熒光PCR檢疫鑒定方法DetectionandidentificationofVerticilliumNeesusingreal-timePCR國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T40254—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國植物檢疫標準化技術委員會(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國寧波海關、中國科學院微生物研究所、西寧市蔬菜技術服務中心、中國檢驗檢疫科學研究院、中華人民共和國烏魯木齊海關。1GB/T40254—2021輪枝菌屬實時熒光PCR檢疫鑒定方法1范圍本文件描述了植物病原真菌輪枝菌屬實時熒光聚合酶鏈式反應(PCR)檢疫鑒定方法。本文件適用于攜帶輪枝菌屬病菌的土壤、植物及其產品中輪枝菌屬病菌的檢測篩查。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN/T2589植物病原真菌檢測規(guī)范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4基本信息輪枝菌屬隸屬于真菌界(Fungi),子囊菌門(Ascomycota),盤菌亞門(Pezizomycotina),糞殼菌綱(Sordariomycetes)中的小不整球殼科(Plectosphaerellaceae)。5鑒定原理根據(jù)輪枝菌屬病菌的DNA序列特征及實時熒光PCR原理，應用所設計引物或探針對輪枝菌屬病菌進行檢測鑒定。6儀器設備和器具、試劑和培養(yǎng)基6.1儀器設備和器具2GB/T40254—20216.2試劑除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。次氯酸鈉、液氮、超純水、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris·HClpH8.0)、Tris飽和酚、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、70%乙6.3培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):將200g馬鈴薯去皮，切小塊，沸水煮20min后過濾，棄去濾渣，在濾液中加入葡萄糖和瓊脂粉各20g,加蒸餾水定容至1L。配成溶液后121℃下滅菌20min。7檢疫鑒定7.1樣品的采集與處理樣品的采集、分離、純化和培養(yǎng)按照SN/T2589植物病原真菌檢疫鑒定方法進行。7.2核酸的制備采用基因組提取試劑盒制備DNA,或采用改良的CTAB提取法，CTAB提取法應符合附錄A。7.3DNA純度與濃度的測定用微量紫外分光光度計測定DNA的純度與濃度，分別取得260nm和280nm處的吸收值，計算核DNA濃度=50×OD?60μg/mL用于實時熒光PCR檢測的DNA溶液的OD?60/OD?s0比值應為1.7～1.9。7.4實時熒光PCR檢測實時熒光PCR檢測方法應符合附錄B。8結果判定以疑似分離物或樣品的實時熒光PCR檢測結果作為鑒定依據(jù)。疑似分離物：陽性對照和空白對照正常，出現(xiàn)典型擴增曲線判定為陽性；無典型擴增曲線判定為陰性。增加DNA用量2倍～10倍再次測試，出現(xiàn)典型擴增曲線，且Ct值≤35,判定為陽性；其余情況判定為陰性。9樣品保存與復核9.1樣品保存與結果記錄保存植物樣品應置于2℃~8℃冰箱妥善保存，對檢出輪枝菌屬病菌的樣品應至少保存6個月，以GB/T40254—2021分離到的輪枝菌屬病菌應接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中妥善保存。要有檢測陽性結果照片。由指定的單位或人員負責，主要考察試驗原始數(shù)據(jù)記錄及實時熒光PCR檢測結果等資料的完整性34GB/T40254—2021(規(guī)范性)DNA提取方法碾碎。A.4加入1/2體積(300μL)的Tris飽和酚及1/2體積(300μL)的三氯甲烷：異戊醇(24:1),顛倒混A.512000r/min離心10min,取上清液至另一離心管中。A.6可重復A.4至A.5步驟2次～3次，視兩相界面處雜質的多少而定。A.7加入等體積三氯甲烷：異戊醇(24:1),輕輕顛倒混勻。A.812000r/min離心10min,取上清液至另一離心管中。A.9向上清液中加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混合均勻后于4℃或-20℃冰箱沉淀1h。A.12加50μL無菌水或TE緩沖液(10mmol/LTris·HCl,1mol/LEDTApH8.0)溶解沉淀，—20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?GB/T40254—2021(規(guī)范性)實時熒光PCR方法B.1引物及探針序列正向引物VF:5'-CTGTCCGAGCGTCGTTTCA-3';反向引物VR:5'-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3';探針VP:5'-FAM-TGGCCCGGTGTTGG-MGB-3',探針5'端含有FAM報告熒光染料，3'端含有不發(fā)熒光的淬滅基團并具有MGB分子。B.2擴增體系探針VP0.2μmol/L。反應總體積為25μL。將反應體系混合均勻后置于熒光PCR儀中進行反應。以輪枝菌屬病菌DNA作陽性對照、不含輪枝菌屬病菌的DNA作陰性對照、以無菌蒸餾水作空白對照，每個樣品設置3個重復。B.3擴增反應條件注：DNA模板的取量根據(jù)DNA的提取濃度純度而調節(jié)。不同儀器可根據(jù)儀器要求將反應參數(shù)作適當調整。6GB/T40254—2021[1]段維軍，郭立新，顧建鋒，等.基于COI基因分析的植物病原性輪枝菌條形碼評價[J].植物檢疫，2013,27(6):41-45.[2]段維軍，郭立新，張慧麗，等.進境臺灣芹菜上一株變黑輪枝菌的鑒定[J].植物檢疫，2012,26(4):30-34.[3]段維軍，郭立新，張祥林，等.檢疫性輪枝菌及其近似種的鑒定[J].植物病理學報，2013,43(3):274-285.[4]段維軍，張慧麗，郭立新，等.ITS片段作為輪枝菌DNA條形碼的評價研究[J].植物保護，2013,39(4):72-77.[5]BarbaraDJ,ClewesE.PlantpathogenicVerticilliumspecies:howmanyofthemarethere?[J].MolecularPlantPathology,2003,4:297-305.[6]CameleI,MarconeC,CaponeroA,etal.FirstreportofVerticilliumdahliaecausingver-ticilliumwiltofSolanumaethiopicuminItaly[J].PlantPathology,2006,55(4):581-581.[7]CollinsA,OkoliCAN,MortonA,etal.IsolatesofVerticilliumdahliaepathogenictocru-cifersareofatleastthreedistinctmoleculartypes[J].Phytopathology,2003,93:364-376.[8]DebodeJ,VanPouckeK,FrancaSC,etal.DetectionofmultipleVerticilliumSpesoilusingdensityflotationandreal-timepolymerasechainreaction[J].PlantDisease,2011,95(12):1571-1580.[9]InderbitzinP,DavisRM,BostockRM,etal.TheascomyceteVerticilliumlongisporumisahybridandaplantpathogenwithanexpandedhostrange[J].PLoSONE,2011,6(3):18260.[10]GiraldoA,CrousPW.InsidePlectosphaerellaceae[J].StudiesinMycology,2018,92:227-286.[11]KirkPM,CannonPF,MinterDW,etal.Dictionaryofthefungi[M].Wallingford:CA-BI,2008:724.[12]KlostermanSJ,AtallahZK,ValladGE,etal.Diversity,pathogenicity,andmanagementofVerticilliumSpecies[J].AnnualReviewofPhytopathology,2009,47:39-62.[13]NeesvonE,GottfriedC.DasSystemderPilzeundSchwamme[M].Würtzburg,Germa-ny:StahelschenBuchhandlung,1817.[14]PramateftakiPV,AntoniouPP,TypasMA.ThecompleteDNAsequenceofthenuclearribosomalRNAgenecomplexofVerticilliumdahliae:intraspecificheterogeneitywithintheintergenicspacerregion[J].Fungalgeneticsandbiology,2000,29(2):19-27.[15]QinQM,ValladGE,WuBM,etal.PhylogeneticanalysesofphytopathogenicisolatesofVerticilliumspp.[J].Phytopathology2006,96(6):582-592.[16]ZareR,GamsW,Starink-WillemseM,SummerbellRC.Gibellulopsis,asuitablegenusforVerticilliumnigrescens,an