優(yōu)良菌種選育(原生質體融合)

原生質體融合自然突變選育：幾率低誘變選育：缺陷性，可獲得大量突變株雜交育種：也可獲得多數重組子，須親和性原生質體融合：融合子，個數少基因工程技術：定向培養(yǎng)

優(yōu)良菌種選育——要點原生質體(Protoplast)

大多數微生物細胞具有細胞壁。采用一定技術去掉細胞壁，剩下的細胞部分稱之為原生質體。任何形狀的細胞去掉細胞壁后都呈球形。

原生質體融合從動植物細胞的研究發(fā)展起來，然后應用于真菌，放線菌，細菌微生物有性重組局限性大，自然雜交現象少借助原生質體融合技術實現遺傳物質的交換原生質體融合的優(yōu)越性打破屬種的界限，擴大重組范圍。受限制小，沒有供體受體之分，有利于不同種屬重組頻率高，放線菌10-2～10-1，真菌10-3～10-2，細菌10-6～10-5遺傳物質傳遞更充分應用于誘變：原生質體對理化因子敏感（溫度，藥物，紫外線），誘變率更高。原生質體制備原生質體純化原生質體融合融合子檢出融合子鑒定原生質體融合步驟超聲波處理菌體釋放原生質體酶解細胞壁釋放原生質體微生物原生質體制備原生質體制備（酶法）微生物細胞壁組成不同，須采用不同的方法革蘭氏陽性菌：甘氨酸，適當青霉素添加培養(yǎng)，溶菌酶（Lysozyme）革蘭氏陰性菌：溶菌酶常用酶：溶菌酶，纖維素酶，蝸牛酶，在等滲溶液中制備，防止細胞破裂種類纖維素幾丁質其它多糖疫霉屬25065毛霉屬0944酵母屬0160鐮刀菌屬03929裂褶菌屬0581鬼傘屬03350真菌的細胞壁成分幾丁質酶Chitinase纖維素酶Cellulase

酵母裂解酶Zymolyaseβ1,3葡聚糖酶

蝸牛酶

商品酶

Novozyme234來自Trichodermaharzianum

Lywallzyme廣東微生物研究所溶壁酶

Glucuronidase葡聚糖苷酸酶

處理真菌用酶酶解時間：20min-7h左右，一般細菌酶解時間較短，真菌酶解時間較長。pH值：細菌如枯草芽孢桿菌最適pH7.5-8.5，低于pH7對原生質體的制備率影響較大。真菌如黃青霉菌最適pH為5.5，在pH值4.0-8.0范圍內均可釋放原生質體。預處理劑：青霉素，巰基乙醇，二硫蘇糖醇滲透壓穩(wěn)定劑：KCl，NaCl，CaCl2，MgSO4，蔗糖，甘露糖，山梨醇。一般絲狀真菌比較適宜以無機鹽為穩(wěn)壓劑，酵母菌則使用糖醇做穩(wěn)壓劑比較好。原生質體釋放有關的因素

菌體培養(yǎng)：液體培養(yǎng),固體培養(yǎng)

收集菌體：過濾收集，離心收集,

洗滌菌體：等滲液沖洗，等滲液與酶液相同

酶解處理：保溫酶解，離心去酶

過濾分離：過濾去掉未分解菌絲體

差速離心：收集大小密度均一的原生質體

低速離心棄沉淀物，高速離心棄上清液，得純化原生質體。原生質體制備程序

菌株A菌株B

液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)

收集菌體收集菌體

洗滌菌體洗滌菌體

酶解釋放原生質體酶解釋放原生質體

分離純化原生質體分離純化原生質體

AB原生質體等量混合

原生質體融合再生原生質體融合操作程序原生質體的融合方法

－16－原生質體融合方法自發(fā)融合誘導融合融合概率低，一般不推薦化學誘導融合電誘導融合激光誘導融合不需要儀器，操作簡單，但PEG對細胞有毒性，原生質體融合率低無毒無害，直觀操作，融合率較高，但需要在專門的電融合儀毒性小，損傷小，但由于其所需設備昂貴復雜，操作技術難度大，很難推廣應用電誘導融合PEG結合高Ca2+、pH誘導法化學誘導融合原理：原生質體表面帶有負電荷(-10mvto-30mv)，相互間有較強排斥作用，PEG是一種特殊脫水劑，可在原生質體膜間起中介作用，改變質膜流動性，降低原生質體質膜表面勢能，加入Ca2+時，改變膜表面分子分布，造成接觸處的質膜形成局部融合，構成原生質橋，成為細胞間通道并逐漸擴大，直到兩原生質體全部融合聚乙二醇(PEG)的選擇

分子量：一般以PEG1000-6000較為適用，不同種類微生物對PEG分子量的要求不盡相同放線菌適用分子量為1000-1500真菌一般采用4000-6000細菌用1500-6000濃度：PEG常用濃度為30%-50%，酵母菌常用濃度在20%-35%，真菌在30%左右，鏈霉菌適宜濃度為50%①親本的遺傳標記（營養(yǎng)缺陷型）：在基本培養(yǎng)基上選出融合子，使只有A+B+型融合子才可能再生出來，而同一種的融合子或未能融合的原生質體無法再生。

融合子檢出策略②原生質體滅活：

誘變形的遺傳標記往往也會使一些優(yōu)良性狀喪失。

采用碘代乙酰胺和焦磷酸二乙酯分別滅活處理真菌原生質體，使處理后的原生質體失去再生能力，而又對遺傳物質無損傷，當兩種采用不同滅活劑處理的原生質體融合后，可以完成代謝互補，使融合子恢復再生能力。融合子檢出策略③熒光染色：在獲得原生質體后，分別用不同的熒光素染色親本原生質體，隨后融合，融合后于紫外光顯微鏡下挑取融合子。融合子發(fā)出兩種親本混有的顏色。融合子檢出策略熒光染色對篩選出的融合子必須進行鑒定，以確定其融合子特性細胞結構水平:單核→雙核，特殊結構形成遺傳本質：特定基因序列的檢出，PCR生長發(fā)育特性：個體形態(tài)特性融合子的鑒定菌體的生長時期：菌體旺盛生長期，對數生長期。菌體預處理：在棒壯桿菌處理時加入氨芐青霉素有利與原生質體釋放，巴氏梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)時加1.5％乳糖可提高再生率滲透壓穩(wěn)定劑：Ca2+、Mg2+，蔗糖可保持原生質體穩(wěn)定利于再生酶解條件：

時間：隨酶解時間的增加原生質體的釋放量增大

濃度：到達一定濃度后，原生質體的再生率下降

溫度：菌體最適生長溫度稍微偏下。影響原生質體活性的因素細菌易再生：可達90％甚至100％

放線菌：50％

絲狀真菌“產黃青霉”：40~60％影響原生質體存活的遺傳因素較低溫度可以有效的保持原生質體的活性

細菌4℃48小時

放線菌4℃24小時

真菌0~4℃保存48小時原生質體貯存條件再生培養(yǎng)基：保護又支持營養(yǎng)的功能再生培養(yǎng)溫度：找出菌種的最適生長溫度。過高溫度對原生質體再生有抑制作用，當再生溫度略低于菌株培養(yǎng)溫度時，有利于原生質體的再生。操作方式：涂布培養(yǎng)法，注意涂布時對原生質體有損固體培養(yǎng)：一般認為固體培養(yǎng)優(yōu)于液體培養(yǎng)

原生質體再生培養(yǎng)注意事項用MgSO4、甘露醇、山梨糖、蔗糖為滲透劑，不同的微生物種類應選擇不同的再生培養(yǎng)基。營養(yǎng)因子，酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖類原生質體保護劑擴張劑：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、明膠等對原生質體具有保護作用，同時起到原生質體擴張劑作用，刺激原生質體再生。加入再生細胞壁誘導物與前體物質：在培養(yǎng)基中加明膠、細胞壁殘片甚至纖維素都有刺激原生質體再生的功能再生培養(yǎng)基固體培養(yǎng)：一般認為固體培養(yǎng)優(yōu)于液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)時細胞壁可溶性物質很容易擴散（如酵母在液體再生液中很難再生）固體培養(yǎng)基限制有效分子的擴散。但先在液體培養(yǎng)基中預培養(yǎng)2~3小時有利于提高再生率。培養(yǎng)方法對原生質體再生的影響３.原生質體融合技術

在微生物育種中的應用選育高產優(yōu)質菌株 釀酒酵母——葡萄糖→釀酒 糖化酵母——淀粉和糊精→葡萄糖 ↓原生質體融合

融合子——淀粉和糊精→葡萄糖→釀酒選育高產優(yōu)質菌株地衣芽孢桿菌——蛋白酶，容易被噬菌體感染

抗噬菌體菌株——抗噬菌體↓原生質體融合融合子——蛋白酶+抗噬菌體產生新的產物

代謝途徑融合，方向改變

慶豐霉素產生菌

井岡霉素產生菌

↓

融合子

聚醚類抗生素+環(huán)狀多肽類1．多細胞菌體的單細胞化作用

2．真菌雙核體單核化作用

3．菌體脫壁再生優(yōu)良菌株原生質體

4．原生質體轉化《原生質的其他用途》1．多細胞菌體的單細胞化作用

許多真菌營養(yǎng)體是多細胞的，當進行誘變處理時，首先應進行單細胞化，采用脫壁形成的原生質體，可以用于誘變處理。2．真菌雙核體單核化作用

許多高等單子菌的次生菌絲是雙核體，通過原生質體釋放再生過程可以單核化，可以用于誘變處理。脫壁再生的菌株具有很大的差異性，從生長速度、代謝活性上面都表現出差異，通過原生質體釋放再生出來的某些菌種可提高產量。

原因 1.突變率提高

2.對菌體細胞刺激作用3菌體脫壁再生篩選優(yōu)良菌株

原生質體更易吸收外源DNA完成轉化過程，原生質體作為“感受態(tài)”細胞與待轉化DNA混合在一定濃度CaCl2作用下進行轉化。4原生質體轉化1970用硝酸鈉誘導植物原生質體融合1972用硝酸鈉進行了煙草種間原生質體融合1972以白地霉營養(yǎng)缺陷型為材料經原生質體融合首次完成異核體形成1974發(fā)現PEG是一種良好的融合劑用于原生質體融合1976以曲霉，青霉營養(yǎng)缺陷型為材料經原生質體融合首次完成異核體形成1976巨大芽孢桿菌內株間原生質體融合成功1977鏈霉菌原生質融合并獲融合重組子1978用PEG+高pH-C