優(yōu)良菌種選育(原生質(zhì)體融合)

原生質(zhì)體融合自然突變選育：幾率低誘變選育：缺陷性，可獲得大量突變株雜交育種：也可獲得多數(shù)重組子，須親和性原生質(zhì)體融合：融合子，個(gè)數(shù)少基因工程技術(shù)：定向培養(yǎng)

優(yōu)良菌種選育——要點(diǎn)原生質(zhì)體(Protoplast)

大多數(shù)微生物細(xì)胞具有細(xì)胞壁。采用一定技術(shù)去掉細(xì)胞壁，剩下的細(xì)胞部分稱之為原生質(zhì)體。任何形狀的細(xì)胞去掉細(xì)胞壁后都呈球形。

原生質(zhì)體融合從動(dòng)植物細(xì)胞的研究發(fā)展起來(lái)，然后應(yīng)用于真菌，放線菌，細(xì)菌微生物有性重組局限性大，自然雜交現(xiàn)象少借助原生質(zhì)體融合技術(shù)實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的交換原生質(zhì)體融合的優(yōu)越性打破屬種的界限，擴(kuò)大重組范圍。受限制小，沒(méi)有供體受體之分，有利于不同種屬重組頻率高，放線菌10-2～10-1，真菌10-3～10-2，細(xì)菌10-6～10-5遺傳物質(zhì)傳遞更充分應(yīng)用于誘變：原生質(zhì)體對(duì)理化因子敏感（溫度，藥物，紫外線），誘變率更高。原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體純化原生質(zhì)體融合融合子檢出融合子鑒定原生質(zhì)體融合步驟超聲波處理菌體釋放原生質(zhì)體酶解細(xì)胞壁釋放原生質(zhì)體微生物原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體制備（酶法）微生物細(xì)胞壁組成不同，須采用不同的方法革蘭氏陽(yáng)性菌：甘氨酸，適當(dāng)青霉素添加培養(yǎng)，溶菌酶（Lysozyme）革蘭氏陰性菌：溶菌酶常用酶：溶菌酶，纖維素酶，蝸牛酶，在等滲溶液中制備，防止細(xì)胞破裂種類纖維素幾丁質(zhì)其它多糖疫霉屬25065毛霉屬0944酵母屬0160鐮刀菌屬03929裂褶菌屬0581鬼傘屬03350真菌的細(xì)胞壁成分幾丁質(zhì)酶Chitinase纖維素酶Cellulase

酵母裂解酶Zymolyaseβ1,3葡聚糖酶

蝸牛酶

商品酶

Novozyme234來(lái)自Trichodermaharzianum

Lywallzyme廣東微生物研究所溶壁酶

Glucuronidase葡聚糖苷酸酶

處理真菌用酶酶解時(shí)間：20min-7h左右，一般細(xì)菌酶解時(shí)間較短，真菌酶解時(shí)間較長(zhǎng)。pH值：細(xì)菌如枯草芽孢桿菌最適pH7.5-8.5，低于pH7對(duì)原生質(zhì)體的制備率影響較大。真菌如黃青霉菌最適pH為5.5，在pH值4.0-8.0范圍內(nèi)均可釋放原生質(zhì)體。預(yù)處理劑：青霉素，巰基乙醇，二硫蘇糖醇滲透壓穩(wěn)定劑：KCl，NaCl，CaCl2，MgSO4，蔗糖，甘露糖，山梨醇。一般絲狀真菌比較適宜以無(wú)機(jī)鹽為穩(wěn)壓劑，酵母菌則使用糖醇做穩(wěn)壓劑比較好。原生質(zhì)體釋放有關(guān)的因素

菌體培養(yǎng)：液體培養(yǎng),固體培養(yǎng)

收集菌體：過(guò)濾收集，離心收集,

洗滌菌體：等滲液沖洗，等滲液與酶液相同

酶解處理：保溫酶解，離心去酶

過(guò)濾分離：過(guò)濾去掉未分解菌絲體

差速離心：收集大小密度均一的原生質(zhì)體

低速離心棄沉淀物，高速離心棄上清液，得純化原生質(zhì)體。原生質(zhì)體制備程序

菌株A菌株B

液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)

收集菌體收集菌體

洗滌菌體洗滌菌體

酶解釋放原生質(zhì)體酶解釋放原生質(zhì)體

分離純化原生質(zhì)體分離純化原生質(zhì)體

AB原生質(zhì)體等量混合

原生質(zhì)體融合再生原生質(zhì)體融合操作程序原生質(zhì)體的融合方法

－16－原生質(zhì)體融合方法自發(fā)融合誘導(dǎo)融合融合概率低，一般不推薦化學(xué)誘導(dǎo)融合電誘導(dǎo)融合激光誘導(dǎo)融合不需要儀器，操作簡(jiǎn)單，但PEG對(duì)細(xì)胞有毒性，原生質(zhì)體融合率低無(wú)毒無(wú)害，直觀操作，融合率較高，但需要在專門的電融合儀毒性小，損傷小，但由于其所需設(shè)備昂貴復(fù)雜，操作技術(shù)難度大，很難推廣應(yīng)用電誘導(dǎo)融合PEG結(jié)合高Ca2+、pH誘導(dǎo)法化學(xué)誘導(dǎo)融合原理：原生質(zhì)體表面帶有負(fù)電荷(-10mvto-30mv)，相互間有較強(qiáng)排斥作用，PEG是一種特殊脫水劑，可在原生質(zhì)體膜間起中介作用，改變質(zhì)膜流動(dòng)性，降低原生質(zhì)體質(zhì)膜表面勢(shì)能，加入Ca2+時(shí)，改變膜表面分子分布，造成接觸處的質(zhì)膜形成局部融合，構(gòu)成原生質(zhì)橋，成為細(xì)胞間通道并逐漸擴(kuò)大，直到兩原生質(zhì)體全部融合聚乙二醇(PEG)的選擇

分子量：一般以PEG1000-6000較為適用，不同種類微生物對(duì)PEG分子量的要求不盡相同放線菌適用分子量為1000-1500真菌一般采用4000-6000細(xì)菌用1500-6000濃度：PEG常用濃度為30%-50%，酵母菌常用濃度在20%-35%，真菌在30%左右，鏈霉菌適宜濃度為50%①親本的遺傳標(biāo)記（營(yíng)養(yǎng)缺陷型）：在基本培養(yǎng)基上選出融合子，使只有A+B+型融合子才可能再生出來(lái)，而同一種的融合子或未能融合的原生質(zhì)體無(wú)法再生。

融合子檢出策略②原生質(zhì)體滅活：

誘變形的遺傳標(biāo)記往往也會(huì)使一些優(yōu)良性狀喪失。

采用碘代乙酰胺和焦磷酸二乙酯分別滅活處理真菌原生質(zhì)體，使處理后的原生質(zhì)體失去再生能力，而又對(duì)遺傳物質(zhì)無(wú)損傷，當(dāng)兩種采用不同滅活劑處理的原生質(zhì)體融合后，可以完成代謝互補(bǔ)，使融合子恢復(fù)再生能力。融合子檢出策略③熒光染色：在獲得原生質(zhì)體后，分別用不同的熒光素染色親本原生質(zhì)體，隨后融合，融合后于紫外光顯微鏡下挑取融合子。融合子發(fā)出兩種親本混有的顏色。融合子檢出策略熒光染色對(duì)篩選出的融合子必須進(jìn)行鑒定，以確定其融合子特性細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平:單核→雙核，特殊結(jié)構(gòu)形成遺傳本質(zhì)：特定基因序列的檢出，PCR生長(zhǎng)發(fā)育特性：個(gè)體形態(tài)特性融合子的鑒定菌體的生長(zhǎng)時(shí)期：菌體旺盛生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。菌體預(yù)處理：在棒壯桿菌處理時(shí)加入氨芐青霉素有利與原生質(zhì)體釋放，巴氏梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)加1.5％乳糖可提高再生率滲透壓穩(wěn)定劑：Ca2+、Mg2+，蔗糖可保持原生質(zhì)體穩(wěn)定利于再生酶解條件：

時(shí)間：隨酶解時(shí)間的增加原生質(zhì)體的釋放量增大

濃度：到達(dá)一定濃度后，原生質(zhì)體的再生率下降

溫度：菌體最適生長(zhǎng)溫度稍微偏下。影響原生質(zhì)體活性的因素細(xì)菌易再生：可達(dá)90％甚至100％

放線菌：50％

絲狀真菌“產(chǎn)黃青霉”：40~60％影響原生質(zhì)體存活的遺傳因素較低溫度可以有效的保持原生質(zhì)體的活性

細(xì)菌4℃48小時(shí)

放線菌4℃24小時(shí)

真菌0~4℃保存48小時(shí)原生質(zhì)體貯存條件再生培養(yǎng)基：保護(hù)又支持營(yíng)養(yǎng)的功能再生培養(yǎng)溫度：找出菌種的最適生長(zhǎng)溫度。過(guò)高溫度對(duì)原生質(zhì)體再生有抑制作用，當(dāng)再生溫度略低于菌株培養(yǎng)溫度時(shí)，有利于原生質(zhì)體的再生。操作方式：涂布培養(yǎng)法，注意涂布時(shí)對(duì)原生質(zhì)體有損固體培養(yǎng)：一般認(rèn)為固體培養(yǎng)優(yōu)于液體培養(yǎng)

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)注意事項(xiàng)用MgSO4、甘露醇、山梨糖、蔗糖為滲透劑，不同的微生物種類應(yīng)選擇不同的再生培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)因子，酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖類原生質(zhì)體保護(hù)劑擴(kuò)張劑：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、明膠等對(duì)原生質(zhì)體具有保護(hù)作用，同時(shí)起到原生質(zhì)體擴(kuò)張劑作用，刺激原生質(zhì)體再生。加入再生細(xì)胞壁誘導(dǎo)物與前體物質(zhì)：在培養(yǎng)基中加明膠、細(xì)胞壁殘片甚至纖維素都有刺激原生質(zhì)體再生的功能再生培養(yǎng)基固體培養(yǎng)：一般認(rèn)為固體培養(yǎng)優(yōu)于液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞壁可溶性物質(zhì)很容易擴(kuò)散（如酵母在液體再生液中很難再生）固體培養(yǎng)基限制有效分子的擴(kuò)散。但先在液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2~3小時(shí)有利于提高再生率。培養(yǎng)方法對(duì)原生質(zhì)體再生的影響３.原生質(zhì)體融合技術(shù)

在微生物育種中的應(yīng)用選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株 釀酒酵母——葡萄糖→釀酒 糖化酵母——淀粉和糊精→葡萄糖 ↓原生質(zhì)體融合

融合子——淀粉和糊精→葡萄糖→釀酒選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株地衣芽孢桿菌——蛋白酶，容易被噬菌體感染

抗噬菌體菌株——抗噬菌體↓原生質(zhì)體融合融合子——蛋白酶+抗噬菌體產(chǎn)生新的產(chǎn)物

代謝途徑融合，方向改變

慶豐霉素產(chǎn)生菌

井岡霉素產(chǎn)生菌

↓

融合子

聚醚類抗生素+環(huán)狀多肽類1．多細(xì)胞菌體的單細(xì)胞化作用

2．真菌雙核體單核化作用

3．菌體脫壁再生優(yōu)良菌株原生質(zhì)體

4．原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化《原生質(zhì)的其他用途》1．多細(xì)胞菌體的單細(xì)胞化作用

許多真菌營(yíng)養(yǎng)體是多細(xì)胞的，當(dāng)進(jìn)行誘變處理時(shí)，首先應(yīng)進(jìn)行單細(xì)胞化，采用脫壁形成的原生質(zhì)體，可以用于誘變處理。2．真菌雙核體單核化作用

許多高等單子菌的次生菌絲是雙核體，通過(guò)原生質(zhì)體釋放再生過(guò)程可以單核化，可以用于誘變處理。脫壁再生的菌株具有很大的差異性，從生長(zhǎng)速度、代謝活性上面都表現(xiàn)出差異，通過(guò)原生質(zhì)體釋放再生出來(lái)的某些菌種可提高產(chǎn)量。

原因 1.突變率提高

2.對(duì)菌體細(xì)胞刺激作用3菌體脫壁再生篩選優(yōu)良菌株

原生質(zhì)體更易吸收外源DNA完成轉(zhuǎn)化過(guò)程，原生質(zhì)體作為“感受態(tài)”細(xì)胞與待轉(zhuǎn)化DNA混合在一定濃度CaCl2作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。4原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化1970用硝酸鈉誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合1972用硝酸鈉進(jìn)行了煙草種間原生質(zhì)體融合1972以白地霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型為材料經(jīng)原生質(zhì)體融合首次完成異核體形成1974發(fā)現(xiàn)PEG是一種良好的融合劑用于原生質(zhì)體融合1976以曲霉，青霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型為材料經(jīng)原生質(zhì)體融合首次完成異核體形成1976巨大芽孢桿菌內(nèi)株間原生質(zhì)體融合成功1977鏈霉菌原生質(zhì)融合并獲融合重組子1978用PEG+高pH-C