受體的放射配體結合分析法

第八章受體的放射配體結合分析法第一節(jié)概述受體（Receptor）

細胞膜上或細胞內的一些與生物活性物質相互作用并引起特異性生物效應的大分子。一、受體的分類及亞型在細胞內的定位可將受體分為膜受體、核受體（一）

膜受體（membranereceptors）由胞膜外、胞膜內及跨膜區(qū)三部分組成，配體在細胞外側同受體的胞外部分或跨膜部分上的特定結合位點結合后，受體的分子構型發(fā)生變化，通過膜內部分啟動相應的信息傳遞機制，引起細胞功能變化。根據(jù)受體的分子結構和受體后信息傳遞方式，膜受體又分為四種：圖8.1受體示意圖（二）核受體（nucleusreceptors）本類受體在細胞核上，與細胞核內特定的DNA結合，通過這種結合影響遺傳信息的轉錄。核受體都是分子量在80～100KD的可溶性蛋白，不含糖基，無酶活性，由一條氨基酸組成。分為四個功能區(qū)，A/B區(qū)、C區(qū)、D區(qū)和E區(qū)。A/B區(qū)在不同受體中差異最大，主要功能是選擇和激活基因轉錄。D區(qū)主要作用是受體在核內的定位，是與染色體DNA結合區(qū)，上面有一定的氨基酸序列，可以和靶基因上一定的核苷酸序列（反應原件，responseelement）相結合。E區(qū)為配體的結合區(qū)，并有轉錄激活作用通常按C區(qū)和染色體DNA結合的結構特征，將核受體分為三類：1、

糖皮質激素受體類包括糖皮質激素受體（GCR）、鹽皮質激素受體（MR）、孕激素受體（PR）及雄激素受體（AR）等。2、

甲狀腺激素受體類包括甲狀腺激素受體（TR）、維生素D3受體（VDR）、維甲酸受體（RAR）及維甲酸X受體（RXR）等。3、

雌激素受體類主要為雌激素（ER）。（三）

受體亞型受體亞型是指受體分子結構上既有部分相同，也存在一定差別，它們對同一配體具有不同的親和力，生物學上具有不同的效應。1、用藥理學方法可見到，同一種受體的幾種激動劑（拮抗劑）對各亞型都有作用，但作用有相對的選擇性。如，對于α腎上腺受體，哌唑嗪對血管平滑肌收縮的拮抗作用強（α1），對胃腸道平滑肌舒張的拮抗作用較弱（α2），而育亨賓則相反。2、用放射配體結合分析法可觀察到，同一種受體的某些激動劑（拮抗劑）對各亞型都有特異性結合能力，但是親和力不同。3、用分子生物學技術可觀察到，同一種受體的不同亞型的分子結構類似，但基因的編碼和氨基酸序列有一定的差異。受體與配體相互作用的基本特點1、

可飽和性（Saturabilty）--有限結合能力。2、

特異性（Specificity）受體對配體應具有特異性和立體特異性。配體可分為激動劑與拮抗劑3、

適度的親和力（Affinity）受體對它的配體的親和力，或配體占據(jù)受體的濃度范圍，應該相當于體內配體的生理濃度，通常是10-9mol/L。4、

可逆性（Reversibility）受體與配體的結合反應是可逆的?？赡嫘赃€表現(xiàn)在已經(jīng)結合的配體可被另一種與受體親和力更高的配體取代。

5、

識別能力（Recognition）和生物效應一致性受體與配體的特異性結合保證了受體對機體內成千上萬生物活性物質的高度識別能力。這種能力與配體引起的生理（藥理）效應相一致。表現(xiàn)在：（1）、在組織分布上的一致。（2）、在濃度上的一致。受體主要存在于相應配體發(fā)揮生理或藥理效應的器管，稱之為靶器管。有的配體生理或藥理效應廣泛，而另一些配體的作用則有明顯的器管專一性。配體和受體結合的有效濃度通常也應該和該配體發(fā)揮生理或藥理作用的濃度一致。6、

需具有內源性配體一般受體都有內源性配體，如果通過外源性配體發(fā)現(xiàn)某種蛋白分子具有類似受體的結合特性，但未能找到內源性配體，則稱之為孤兒受體（Orphanreceptor），還不能看做肯定是真正的受體。RBA（Radioligandbindingassayofreceptors）

用放射性核素標記的配體與相應受體進行特異性結合反應，從而對受體進行定性和定量，即稱為受體的放射配體結合分析法。RBA定量RBA在已知配體—受體反應的基礎之上，通過結合反應得知一定量的組織或細胞能與該放射性配體結合的受體數(shù)（又叫結合位點數(shù)，Numberofbindingsite）和親和力（以解離常數(shù)KD表示）。定性RBA通過反應量效關系，某些參數(shù)的變化等判斷受體的類型，單位點和多位點系統(tǒng)，受體與配體相互作用的特點等。第二節(jié)、單位點系統(tǒng)RBA的基本原理一、受體與配體相互作用的基本特點二、簡單單位點系統(tǒng)受體配體相互作用的基本規(guī)律二、簡單單位點系統(tǒng)受體配體相互作用的基本規(guī)律

簡單單位點系統(tǒng):受體與配體結合的系統(tǒng)只存在一種結合位點.1.質量作用定律:受體與配體的結合反應最基本的性質是服從可逆反應的質量作用定律.

[R]+[L][RL]v1

---復合物形成速率k1_---復合物形成速率常數(shù)v2

---復合物解離速率k2_---復合物解離速率常數(shù)v1=K1[R][L]v2=K2[RL]反應平衡時v1=v2k1v1k2v2反應平衡時v1=v2平衡解離常數(shù)KD==

KD=1/KA，單位為：mol/LKD越大，親和力越低設受體和配體的初始濃度分別為[RT]、[LT]

則[R]=[RT]-[RL]

[L]=[LT]-[RL]

代入：

KD=

整理后得：[RL]2-[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0因為[RT]、KD為定值所以[RL]僅隨[LT]而變化，兩者呈雙曲線函數(shù)關系2.飽和曲線:簡單單位點系統(tǒng)RBA具有典型的飽和曲線--------------以[RL]為縱坐標[LT]為橫坐標,得到的得到一條曲線(Saturationcurve).圖8-2KD對飽和曲線的影響圖8-3[RT]對飽和曲線影響

3.Scatchard作圖

簡單單位點系統(tǒng)在Scatchard

作圖中呈一直線整理后得:以[RL]/[L]對[RL]作圖--------------Scatchard

作圖斜率=-1/KD[RT]=直線與橫坐標的交點

圖8.4簡單單位點系統(tǒng)受體結合分析的Scatchard作圖KD相同[RT]不同時[RT]相同KD不同時圖8.54.Hill作圖

得到一條斜率為1的直線重排并取對數(shù)以lg([RL]/[RT-RL])-----------------------縱坐標lg[L]--------------------------------------橫坐標如果一個受體能和兩個或更多(n個)分子的配體結合(KD相同)

KD=[RT-RL][L]n/[RL]

lg([RL]/[RT-RL])=-lgKD+nlg[L]斜率為n,Hill系數(shù).-lgKDlgKDLg[L]三、非特異結合放射性配體除與受體特異結合外，與其他的結合統(tǒng)稱為NSB特點：1）結合容量大，親和力小2）無飽和現(xiàn)象3）結合量與所用配體量呈線性關系RBA時，當分離特異結合的復合物測量放射性時，這部分NSB的放射性混在一起，測得的是總放射性（totalbinding，TB），必需先去減去NSB，才能得到特異結合（specificbinding，SB）。最基本的方法是做一系列平行管，所有的條件都與TB管相同，僅是多加了200～1000倍量非標記配體，將SB完全取代，這時測得的放射性計數(shù)為NSB。因NSB與放射性配體呈線性，多點飽和法實驗中常常只做3、4點，再用直線回歸法求出其余各點。

圖8-73H-組胺與組胺受體特異結合的飽和曲線（○表示NSB,●表示TB，x表示SB=TB-NSB）

四、正協(xié)同及副協(xié)同現(xiàn)象某些情況下，一部分受體與配體結合后可使相臨的受體分子親和力降低------------副協(xié)同（Negativecooperativity）反之，親和力逐步增高，斜率加大，曲線向上凸--------------------------------------------正協(xié)同（positivecooperativity）圖8.8Scatchard作圖中的正負協(xié)同作用（1）無協(xié)同作用；（2）負協(xié)同作用；（3）正協(xié)同作用第三節(jié)離體RBA的條件和基本方法條件：1.適用的標記配體2.待測受體標本3.適合的緩沖液4.較好的F與B的分離方法RBA的基本方法

制備待測受體的離體標本加放射性配體溫育一定時間終止反應、分離結合與游離部分測定結合部分的放射性數(shù)據(jù)處理、求有關參數(shù)一、標記配體要求：高度親和力，特異標記配體的濃度〈受體-配體KD常用的放射性配體：

3H-標記物：穩(wěn)定、生物活性不變、T1/2長、高放射性比活度、專門合成

125I-標記物：易標記、高放射性比活度、T1/2短、結構可能變化、比活度不易確定

標記配體的基本要求：1.高比活度RBA中受體數(shù)目一般很低（0.01～1pmol/mg蛋白），必須用高比活度的標記配體才能得到理想的實驗結果。而且比活度高，可減少標記配體的用量。一般要求在3.7×1011Bq（10Ci）/mmol以上。2.親和力高高親和力的配體可減少用量，從而降低NSB；且可使標記配體與受體的復合物解離變慢，便于結合與游離配體的分離，易獲得準確的實驗數(shù)據(jù)。3.特異性強標記配體應與其他受體的交叉反應少，與研究的受體有選擇性結合。理想的標記配體應只與一種受體或受體的一種亞型結合。因此應選擇對某一受體或其中一種亞型高親和力的標記配體。4.放射化學純度高RBA的計算是以標記配體的用量及比活度為依據(jù)，放射性雜質多進可導致計算不準確，一般要求放射化學純度在95%以上

（一）

標記配體的用量標記配體的用量要根據(jù)實驗方案通過預實驗進行確定。（1）單點法。通常選一個使受體基本飽和的標記配體量。該方法操作簡便，標本量少，標記配體用量少，但只能給出受體的最大結合容量Bmax，且略小于飽和曲線法。（2）多點飽和曲線。每一受體標本做6～8個點（雙位點需要更多），標記配體的用量應覆蓋受體的不飽和區(qū)和飽和區(qū)，以得到典型的飽和曲線。此方法能得到RT、KD、反映實驗誤差大小的平均誤差等，可信度高，但工作量也大。二、非標記配體的選擇非標記配體----與放射性配體競爭結合同一受體----特異性、親和力要高----用量=100-10000倍標記配體使絕大部分受體都被非標記配體所占據(jù)而不再與標記配體結合

三、待測受體標本的制備用于離體RBA的標本大體可分為：組織切片、完整細胞懸液，經(jīng)初步分離的細胞組分以及經(jīng)增溶或進一步純化的受體蛋白等。

1.完整細胞懸液的制備2.細胞組成的分離細胞核、漿、膜3.受體的增溶和進一步純化圖8.10分離細胞組分的一般方法沉淀：完整細胞、核受體四、溫育條件緩沖液通過多次預實驗確定某個受體的最適離子強度和pH時間與溫度最適的時間為完全平衡時間溫度根據(jù)目的不同而不同（0—37OC）

第四節(jié)定量RBA的數(shù)據(jù)處理目的：求受體的RT和KD及其他參數(shù)通過測得的樣品數(shù)據(jù)+放射性配體的量、放射性比活度+數(shù)學模型的運算一、單位點實驗的數(shù)據(jù)處理TB-NSB=RL（特異結合的CPM）CPM/儀器效率=DPM（RL）DPM/S（比活度）=濃度（mol/L）R：L=1：1------RL的mol數(shù)=結合位點數(shù)定量蛋白、細胞-------RTmol數(shù)1mol=6.02×1023分子數(shù)的受體通常是計算飽和區(qū)[RT]，即最大結合容量Rmax（maximumbindingcapacity）。單位換算公式為：

二、單位點系統(tǒng)多點法的數(shù)據(jù)處理一系列的不同濃度的LT與R結合后得到TBn-NSB=RLn（CPM）以RLn對LT作圖=飽和曲線-----不同的模型得到RT和KD1.目測漸進線法2.直線化方法3.直接曲線擬合直線化方法

ScatchardModel[R]/[L]的濃度比值=B/F放射性比值B/F

=[RT]/KD-[RL]/KD以B/F-----------縱坐標[RL]----------橫坐標斜率=-1/KD與橫坐標的交點=[RT]與縱坐標的交點=[RT]/KDWoolfModel

F/B=KD/[RT]+[L]/[RT]F/B-----------縱坐標[L]-------------橫坐標斜率=-1/[RT]與橫坐標的交點=-KD與縱坐標的交點=KD/[RT]LinewearBurkModel1/[RL]=1/[RT]+KD/[RT][L]1/[RL]-----------縱坐標1/[L]-------------橫坐標斜率=KD/[RT]與橫坐標的交點=-1/KD與縱坐標的交點=1/[RT]問題1.橫坐標為實驗測得的值存在誤差2.直線轉換所致不均勻性3.均用F，由T-B所得有一定誤差

3.直接曲線擬合（COMPUTER）

測得TB、NSBTBn-NSB=Tn（CPM）--------[RL]（濃度）[RL]對[LT]曲線擬合[RL]2-[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0橫坐標為[LT]，近于實際公式[RL]2-[RL][RT+LT+KD]+[RT][LT]=0為飽和曲線的直接表達式，可用最小二乘法或穩(wěn)健回歸法。橫坐標是[LT]（自變量），縱坐標是[RL]（因變量），[RT]和KD是固定值。比直線化有一定的優(yōu)勢，其精密度和準確度均優(yōu)于直線化法。四、雙位點或多位點系統(tǒng)RBA飽和曲線的數(shù)據(jù)處理原因：有些配體的特異性相對低，能和兩種或兩種以上的受體（或不同亞型）發(fā)生特異結合結果：[RL]是兩種或兩種以上特異結合的和飽和曲線是兩種或更多曲線的和第七節(jié)受體與疾病一、疾病的發(fā)病機制的研究二、受體異常疾病的診斷三、指導治療四、預后指標五、藥物藥效研究一、受體調節(jié)過度引起的疾病受體的調節(jié)是指某種細胞上的某種受體由于一些因素改變而發(fā)生變化。受體的調節(jié)可以是受體數(shù)量（密度）的增加或減少，也可以是受體與配體親和力的升高或降低。如果調節(jié)作用是受體本身和特異性配體發(fā)生結合反應的結果，則稱為同系調節(jié)（homologousregulation）。若調節(jié)作用是其他受體甚至與受體無關的因素引起的，則稱之為異系調節(jié)（heterologousregulation）。

生理條件下，受體的調節(jié)是使機體更好地適應內外環(huán)境的變化，可是一旦調節(jié)過度，則會引起病理性的后果。如，甲狀腺激素能使多種組織的β腎上腺素受體密度上升，使組織的糖元分解加速，適應甲狀腺激素促進細胞能量代謝的需要。但當甲狀腺功能亢進時β腎上腺素受體密度的過度增多則可導致心動過速或心律失常。

二、受體基因突變所引起的疾病由于遺傳基因的突變而使受體異常，導致疾病產生。主要表現(xiàn)為細胞產生的受體與內源性配體的親和力發(fā)生變化，大多數(shù)是親和力下降。

已知的由于受體基因突變引起的疾病如：ACTH受體發(fā)生突變，腎上腺對ACTH的反應性下降，臨床表現(xiàn)為家族性糖皮質激素缺乏癥；胰島素受體β亞單位發(fā)生突變，使機體對胰島素的反應性下降，臨床表現(xiàn)為A型抗胰島素糖尿?。ǔ赡昱裕?；LH受體Ⅵ跨膜區(qū)突變，導致LHR與LH反應下降，臨床表現(xiàn)為家族男性早熟。此外還有一些疾病如抗甲狀腺激素型甲減、家族性糖皮質激素缺乏癥、原發(fā)性抗皮質醇癥、I型假型醛固酮缺乏癥等都與受體基因突變有關

三、受體抗體引起的疾病受體是機體本身的蛋白質，正常情況下機體不會產生針對受體的抗體，因而也不會形成受體與其自身特異性抗體的免疫復合物。但是在某些病理情況下，機體產生了針對某一受體蛋白的特異性抗體，并發(fā)生抗原抗體結合反應，導致受體功能異常，引起疾病。常見的有：Graves病患者機體產生抗促甲狀腺激素受體（TSHR）抗體

四、受體與腫瘤有些病人的癌細胞存在相應的受體，有些沒有。激素療法對有受體的腫瘤有效，對沒有受體的腫瘤則無效。如乳腺癌ER和PR陽性患者激素治療有效，而陰性則治療效果差。此外，檢測腫瘤組織中的有關受體對決定治療方案和預后判斷都后重要，已成為常規(guī)。如174例急性淋巴細胞白血病患者骨髓中糖皮質激素受體（GCR）的檢查結果表明：凡是GCR水平低下者，即使經(jīng)治療有所緩解，也往往容易復發(fā)。雌激素受體陰性的乳腺癌患者，預后多不良。五、受體的變化是一些疾病的中間環(huán)節(jié)受體的變化是某些疾病的重要中間環(huán)節(jié)，有時表現(xiàn)為一對作用相反的受體向相反方向變化，使受體間失平衡，治療上常開發(fā)針對受體特異性的藥物。如過敏性哮喘時β腎上腺素受體密度降低，M膽堿受體密度增加，可用β腎上腺素受體激動劑減輕癥狀。

六、受體研究是篩選藥物和觀察藥物毒副作用的重要工具

（一）、在藥物作用機制中的作用

應用放射配體結合分析法研究受體，可了解：（1）藥物作用的特異性是由于特異性受體的存在；（2）受體與藥物的反應決定了藥理作用的量效關系；（3）不僅激動劑（Agonist）的藥理作用是通過和受體反應而產生的，而拮抗劑（Antagonist）也是如此。用以上概念可解釋各種藥理作用，這就是很多藥物藥理作用的起初反應。因此，可把通