水質(zhì) 阿維菌素B1a和阿維菌素B1b的測定 高效液相色譜法（征求意見稿）

目次

前言.................................................................................................................................................ii

1適用范圍.......................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件...........................................................................................................................1

3方法原理.......................................................................................................................................1

4干擾和消除...................................................................................................................................1

5試劑和材料...................................................................................................................................1

6儀器和設(shè)備...................................................................................................................................2

7樣品...............................................................................................................................................3

8分析步驟.......................................................................................................................................4

9結(jié)果計算與表示...........................................................................................................................4

10準(zhǔn)確度.........................................................................................................................................5

11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制.................................................................................................................6

12廢物處置.....................................................................................................................................6

13注意事項.....................................................................................................................................7

附錄A（資料性附錄）方法的準(zhǔn)確度.........................................................................................8

i

前言

為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)法》《中華人民共和國水污染防治法》，防治生態(tài)環(huán)境

污染，改善生態(tài)環(huán)境質(zhì)量，規(guī)范水中阿維菌素B1a和阿維菌素B1b的測定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定地表水、地下水、生活污水、工業(yè)廢水和海水中阿維菌素B1a和阿維

菌素B1b的高效液相色譜法。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。

本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部生態(tài)環(huán)境監(jiān)測司、法規(guī)與標(biāo)準(zhǔn)司組織制訂。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：江蘇省南京環(huán)境監(jiān)測中心。

本標(biāo)準(zhǔn)驗證單位：河北省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、江蘇省鎮(zhèn)江環(huán)境監(jiān)測中心、江蘇省揚(yáng)州環(huán)

境監(jiān)測中心、江蘇省泰州環(huán)境監(jiān)測中心、江蘇省蘇力環(huán)境科技有限責(zé)任公司和江蘇新銳環(huán)境

監(jiān)測有限公司。

本標(biāo)準(zhǔn)生態(tài)環(huán)境部202□年□□月□□日批準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)自202□年□□月□□日起實施。

本標(biāo)準(zhǔn)由生態(tài)環(huán)境部解釋。

ii

水質(zhì)阿維菌素B1a和阿維菌素B1b的測定高效液相色譜法

警告：實驗中使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和有機(jī)溶劑均具有一定的毒性，試劑配制和樣品前處理過

程應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，操作時應(yīng)按要求佩戴防護(hù)器具，避免直接接觸皮膚和衣物。

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中阿維菌素B1a和阿維菌素B1b的高效液相色譜法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水、工業(yè)廢水和海水中阿維菌素B1a和阿維菌素

B1b的測定。

當(dāng)取樣體積100ml，定容體積1ml，進(jìn)樣體積20μl時，阿維菌素B1a和阿維菌素B1b的

方法檢出限為0.03μg/L，測定下限為0.12μg/L。

2規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用

于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB17378.3海洋監(jiān)測規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運(yùn)輸

HJ91.1污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

HJ91.2地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

HJ164地下水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

HJ442.3近岸海域環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范第三部分近岸海域水質(zhì)監(jiān)測

3方法原理

水樣中阿維菌素B1a和阿維菌素B1b經(jīng)二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶劑萃取，提取液經(jīng)凈化

后濃縮至干，在N-甲基咪唑存在下與三氟乙酸酐衍生化反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，經(jīng)高效液相色譜

分離，用熒光檢測器檢測。根據(jù)保留時間定性，外標(biāo)法定量。

4干擾和消除

多環(huán)芳烴類化合物對測定有干擾，可通過凈化柱消除。

5試劑和材料

除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實驗用水為不含目標(biāo)化合物

的二次蒸餾水或用純水設(shè)備制備的水。

5.1乙酸乙酯（C4H8O2）：色譜純。

1

5.2甲醇（CH3OH）：色譜純。

5.3二氯甲烷（CH2Cl2）：色譜純。

5.4乙腈（CH3CN）：色譜純。

5.5鹽酸（HCl）：ρ=1.18g/ml，w∈[36.0%，38.0%]。

5.6鹽酸溶液。

用鹽酸（5.5）和水按1:1的體積比混合。

5.7氫氧化鈉（NaOH）。

5.8氫氧化鈉溶液：ρ(NaOH)＝0.4g/ml。

稱取40g氫氧化鈉（5.7）溶于100ml實驗用水中。

5.9氯化鈉（NaCl）。

在400℃下烘烤4h，冷卻至室溫，貯于磨口玻璃瓶中密封保存。

5.10無水硫酸鈉（Na2SO4）。

在400℃下烘烤4h，冷卻至室溫，貯于磨口玻璃瓶中密封保存。

5.11N-甲基咪唑（C4H6N2）。

5.12三氟乙酸酐（C4F6O3）。

5.13阿維菌素B1a（C48H72O14）：純度≥98%。

5.14阿維菌素B1b（C47H70O14）：純度≥90%。

5.15二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶劑。

用二氯甲烷（5.3）和乙酸乙酯（5.1）按3:1的體積比混合。

5.16衍生化試劑I：用N-甲基咪唑（5.11）和乙腈（5.4）按1:1的體積比混合，臨用現(xiàn)

配。

5.17衍生化試劑II：用三氟乙酸酐（5.12）和乙腈（5.4）按1:2的體積比混合，臨用現(xiàn)

配。

5.18阿維菌素B1a和阿維菌素B1b標(biāo)準(zhǔn)貯備液：ρ=1000mg/L。

準(zhǔn)確稱取1mg阿維菌素B1a（5.13）和1mg阿維菌素B1b（5.14），用乙腈（5.4）溶解定

容至1ml容量瓶，-18℃避光保存，保存期1a?？蓡为毰渲?，也可配成混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液或購

買市售阿維菌素B1a、阿維菌素B1b有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照產(chǎn)品說明書保存。

5.19阿維菌素B1a和阿維菌素B1b標(biāo)準(zhǔn)使用液：ρ=10.0mg/L。

準(zhǔn)確移取50μl阿維菌素B1a和阿維菌素B1b（5.18）標(biāo)準(zhǔn)貯備液至5ml容量瓶中，用乙

腈（5.4）稀釋定容至刻度，-18℃避光保存，保存期1a。

5.20凈化柱：500mg/6ml，填料為石墨化碳黑，或其他等效凈化柱。

5.21濾膜：孔徑0.45μm，聚四氟乙烯或其他等效材質(zhì)。

6儀器和設(shè)備

6.1采樣瓶：500ml具塞磨口棕色玻璃瓶。

6.2高效液相色譜儀：具熒光檢測器。

6.3色譜柱：填料粒徑為5μm，柱長15cm，內(nèi)徑4.6mm的C18反相色譜柱，或其他等效色譜

2

柱。

6.4濃縮裝置：氮吹濃縮儀或其他性能相當(dāng)?shù)臐饪s裝置。

6.5渦旋混合器。

6.6分液漏斗：250ml，玻璃材質(zhì)。

6.7離心管：尖底具塞玻璃離心管，5ml。

6.8一般實驗室常用儀器和設(shè)備。

7樣品

7.1樣品采集和保存

按照GB17378.3、HJ91.1、HJ91.2、HJ164和HJ442.3的相關(guān)規(guī)定采集和運(yùn)輸樣品。使

用采樣瓶（6.1）采集樣品，用鹽酸溶液（5.6）或氫氧化鈉溶液（5.8）調(diào)節(jié)pH值至5～9，于

4℃以下冷藏、避光保存，4d內(nèi)完成萃取。若衍生化反應(yīng)后不能及時分析，應(yīng)于-18℃冷凍

保存，3d內(nèi)完成分析。

每批次樣品應(yīng)至少采集1個全程序空白樣品，將1份實驗用水放入采樣瓶（6.1）中，帶

到采樣現(xiàn)場，與盛裝樣品的采樣瓶同時開蓋和密封，隨樣品一起保存運(yùn)回實驗室。

7.2試樣的制備

7.2.1萃取

搖勻水樣，量取100ml（視水樣實際情況，取樣量可適當(dāng)減少）于250ml分液漏斗

（6.6）中，加入6g氯化鈉（5.9），待氯化鈉溶解后，加入20ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶

劑（5.15），充分振搖，注意放氣，靜置分層。提取液經(jīng)無水硫酸鈉（5.10）脫水后收集于

濃縮管中，若提取液顏色較深或有多環(huán)芳烴存在，用濃縮裝置（6.4）將提取液濃縮至約2

ml，按7.2.2步驟凈化。

注：海水可不加氯化鈉。

7.2.2凈化

用6ml甲醇（5.2）活化凈化柱（5.20），再用6ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶劑（5.15）

沖洗，棄去有機(jī)相，待凈化柱（5.20）填料暴露于空氣前，將樣品提取液（7.2.1）轉(zhuǎn)移至凈

化柱（5.20）上，自然流出，收集流出液，用5ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶劑（5.15）淋洗

凈化柱，合并所有流出液待濃縮。

7.2.3濃縮

將7.2.1的提取液或7.2.2凈化收集的溶液用濃縮裝置（6.4）濃縮至1ml左右，轉(zhuǎn)移至離心

管（6.7）中，再用2ml二氯甲烷（5.3）蕩洗濃縮瓶，合并全部有機(jī)相至離心管（6.7）中，

60℃以下濃縮至干，待衍生化。

注：如濃縮管具塞，則提取液或凈化收集的溶液可直接濃縮至干后直接衍生，無需轉(zhuǎn)移至離心管。

7.2.4衍生化

3

向離心管（6.7）中加入100μl衍生化試劑I（5.16），于渦旋混合器（6.5）上渦旋30s，

再加入150μl衍生化試劑II（5.17），加蓋于渦旋混合器（6.5）上渦旋10s，靜置反應(yīng)20

min，加入750μl甲醇（5.2），渦旋混合10s，靜置30min以上，用濾膜（5.21）過濾，待

測。

7.3空白試樣的制備

用實驗用水代替樣品，按照與試樣制備（7.2）相同的步驟制備實驗室空白試樣。

8分析步驟

8.1儀器參考條件

流動相：甲醇（5.2）：水體積比9:1混合；柱溫：40℃；流速：1.0ml/min；熒光檢測

器：激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長475nm；進(jìn)樣體積：20μl，可根據(jù)儀器靈敏度調(diào)整。

8.2校準(zhǔn)曲線的建立

移取一定量的阿維菌素B1a和阿維菌素B1b標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.19），于離心管（6.7）中60℃以

下濃縮至干，按照7.2.4進(jìn)行衍生化，制備至少5個濃度點的標(biāo)準(zhǔn)系列，目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃

度分別為20.0μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L（此為參考濃度），按照儀器

參考條件（8.1），由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，以目標(biāo)化合物濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積（或

峰高）為縱坐標(biāo)，建立校準(zhǔn)曲線。

8.3試樣的測定

將制備好的試樣（7.2），按照與繪制校準(zhǔn)曲線相同的條件（8.2）測定。當(dāng)試樣濃度超出

校準(zhǔn)曲線濃度范圍時，適當(dāng)稀釋后測定。

8.4空白試樣的測定

按照與試樣的測定（8.3）相同的步驟，測定空白試樣（7.3）。

9結(jié)果計算與表示

9.1目標(biāo)化合物的定性

根據(jù)樣品中目標(biāo)化合物與校準(zhǔn)系列中目標(biāo)化合物的保留時間定性。在本標(biāo)準(zhǔn)推薦的儀器

參考條件下，目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖見圖1。

4

1——阿維菌素B1b；2——阿維菌素B1a。

圖1阿維菌素B1a和阿維菌素B1b標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖（ρ=100μg/L）

9.2結(jié)果計算

根據(jù)目標(biāo)化合物的峰面積（或峰高），采用外標(biāo)法定量。

樣品中目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度，按照公式（1）計算。

V

11D（1）

V

式中：——樣品中目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度，μg/L；

由校準(zhǔn)曲線計算所得的目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度，；

1——μg/L

試樣的定容體積，；

V1——ml

V——取樣體積，ml；

D——試樣的稀釋倍數(shù)。

9.3結(jié)果表示

測定結(jié)果最多保留3位有效數(shù)字，小數(shù)點后位數(shù)最多與方法檢出限一致。

10準(zhǔn)確度

10.1精密度

6家實驗室對阿維菌素B1a和阿維菌素B1b加標(biāo)濃度分別為0.20μg/L、0.20μg/L和1.00

μg/L的地表水、地下水、生活污水實際樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范

圍分別為：3.9%～12%、3.6%～14%和3.6%～15%。

6家實驗室對阿維菌素B1a和阿維菌素B1b測定濃度范圍為0.02μg/L～2.03μg/L，加標(biāo)濃

度分別為2.00μg/L、6.00μg/L的工業(yè)廢水實際樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)

偏差范圍分別為：2.2%～11%、4.0%～17%。

6家實驗室對阿維菌素B1a和阿維菌素B1b加標(biāo)濃度為1.00μg/L的海水統(tǒng)一實際樣品進(jìn)行

了6次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2.0%～15%；實驗室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為

4.1%～4.3%；重復(fù)性限為0.21μg/L～0.22μg/L，再現(xiàn)性限為0.28μg/L～0.29μg/L。

5

精密度結(jié)果參見附錄A中表A.1。

10.2正確度

6家實驗室對阿維菌素B1a和阿維菌素B1b加標(biāo)濃度分別為0.20μg/L、0.20μg/L和1.00

μg/L的地表水、地下水、生活污水實際樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，加標(biāo)回收率范圍分別為：

72.5%～105%、78.5%～97.0%和69.6%～117%。

6家實驗室對阿維菌素B1a和阿維菌素B1b測定濃度范圍為0.02μg/L～2.03μg/L，加標(biāo)濃

度分別為2.00μg/L、6.00μg/L的工業(yè)廢水實際樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測定，加標(biāo)回收率范圍分

別為：74.5%～99.6%、71.0%～104%。

6家實驗室對阿維菌素B1a和阿維菌素B1b加標(biāo)濃度為1.00μg/L的海水統(tǒng)一實際樣品進(jìn)行

了6次重復(fù)測定：加標(biāo)回收率為79.6%～102%；加標(biāo)回收率最終值為88.6%±15.0%～

90.2%±13.6%。

正確度結(jié)果參見附錄A中表A.2。

11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

11.1空白試驗

每20個樣品或每批次樣品（少于20個）應(yīng)至少測定1個實驗室空白和全程序空白樣

品，測定結(jié)果應(yīng)低于方法檢出限。

11.2校準(zhǔn)

每批樣品繪制校準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.995，否則應(yīng)查找原因，重新繪制校準(zhǔn)

曲線。

每20個樣品或每批次樣品（少于20個）應(yīng)測定1個校準(zhǔn)曲線中間濃度點，其測定結(jié)果

與校準(zhǔn)曲線該點濃度的相對誤差應(yīng)在±20%以內(nèi)，否則應(yīng)重新繪制校準(zhǔn)曲線。

11.3平行樣

每20個樣品或每批次樣品（少于20個）應(yīng)至少測定1個平行樣。平行樣測定結(jié)果的相

對偏差應(yīng)在±30%以內(nèi)。

11.4基體加標(biāo)

每20個樣品或每批次樣品（少于20個）應(yīng)測定1個基體加標(biāo)樣，基體加標(biāo)回收率應(yīng)在

60%～130%之間。

12廢物處置

實驗中產(chǎn)生的廢物應(yīng)集中收集，分類保存，并做好相應(yīng)的標(biāo)識，依法處置。

6

13注意事項

三氟乙酸酐（5.12）容易吸水失效，開瓶后注意密閉保存。

7

附錄A

（資料性附錄）

方法的準(zhǔn)確度

方法的精密度和正確度匯總數(shù)據(jù)見表A.1～表A.2。

表A.1精密度匯總表

實驗室內(nèi)實驗室間

目標(biāo)化合加標(biāo)濃度重復(fù)性限再現(xiàn)性限

樣品類型相對標(biāo)準(zhǔn)偏差相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

物名稱（μg/L）（μg/L）（μg/L）

（%）（%）

地表水0.204.2～11.4////

地下水0.204.2～13.2///

阿維菌素海水1.002.0～12.44.10.210.29

B1a生活污水1.004.0～14.9///

工業(yè)廢水2.002.6～8.6///

工業(yè)廢水6.004.0～9.7///

地表水0.203.9～6.5///

地下水0.203.6～9.9///

阿維菌素海水1.002.2～14.14.30.220.28

B1b生活污水1.003.6～11.5///

工業(yè)廢水2.002.2～10.6///

工業(yè)廢水6.005.5～16.4///

表A.2正確度匯總表

目標(biāo)化合物加標(biāo)濃度加標(biāo)回收率范圍

樣品類型S（%）P±2S（%）

名稱（μg/L）（%）PP

～

地表水0.2073.5105//

～

地下水0.2078.597.0//

～

海水1.0079.61017.588.6±15.0

阿維菌素B1a

～

生活污水1.0075.2117//

～

工業(yè)廢水2.0081.999.6//

工業(yè)廢水6.0071.0～94.8//

地表水0.2072.5～105//

～

地下水0.2083.593.7//

～±

海水1.0084.91026.890.213.6

阿維菌素B1b

～

生活污水1.0069.6115//

～

工業(yè)廢水2.0074.596.9//

～

工業(yè)廢水6.0086.5104//

8

中華人民共和國國家生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)

HJ□□□-202□

水質(zhì)阿維菌素B1a和阿維菌素B1b的測

定高效液相色譜法

Waterquality—DeterminationofAvermectinB1aandAvermectinB1b—High

performanceliquidchromatography

（征求意見稿）

水質(zhì)阿維菌素B1a和阿維菌素B1b的測定高效液相色譜法

警告：實驗中使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和有機(jī)溶劑均具有一定的毒性，試劑配制和樣品前處理過

程應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，操作時應(yīng)按要求佩戴防護(hù)器具，避免直接接觸皮膚和衣物。

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中阿維菌素B1a和阿維菌素B1b的高效液相色譜法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水、工業(yè)廢水和海水中阿維菌素B1a和阿維菌素

B1b的測定。

當(dāng)取樣體積100ml，定容體積1ml，進(jìn)樣體積20μl時，阿維菌素B1a和阿維菌素B1b的

方法檢出限為0.03μg/L，測定下限為0.12μg/L。

2規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用

于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB17378.3海洋監(jiān)測規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運(yùn)輸

HJ91.1污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

HJ91.2地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

HJ164地下水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

HJ442.3近岸海域環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范第三部分近岸海域水質(zhì)監(jiān)測

3方法原理

水樣中阿維菌素B1a和阿維菌素B1b經(jīng)二氯甲烷和乙酸乙酯混合溶劑萃取，提取液經(jīng)凈化

后濃縮至干，在N-甲基咪唑存在下與三氟乙酸酐衍生化反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，經(jīng)高效液相色譜

分離，用熒光檢測器檢測。根據(jù)保留時間定性，外標(biāo)法定量。

4干擾和消除

多環(huán)芳烴類化合物對測定有干擾，可通過凈化柱消除。

5試劑和材料

除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實驗用水為不含目標(biāo)化合物

的二次蒸餾水或用純水設(shè)備制備的水。

5.1乙酸乙酯（C4H8O2）：色譜純。

1

5.2甲醇（CH3OH）：色譜純。

5.3二氯甲烷（CH2Cl2）：色譜純。

5.4乙腈（CH3CN）：色譜純。

5.5鹽酸（HCl）：ρ=1.18g/ml，w∈[36.0%，38.0%]。

5.6鹽酸溶液。

用鹽酸（5.5）和水按1:1的體積比混合。

5.7氫氧化鈉（NaOH）。

5.8氫氧化鈉溶液：ρ(NaOH)＝0.4g/ml。

稱取40g氫氧化鈉（5.7）溶于100ml實驗用水中。

5.9氯化鈉（NaCl）。

在400℃下烘烤4h，冷卻至室溫，貯于磨口玻璃瓶中密封保存。

5.10無水硫酸鈉（Na2SO4）。

在400℃下烘烤4h，冷卻至室溫，貯于磨口玻璃瓶中密封保存。

5.11N-甲基咪唑（C4H6N2）。

5.12三氟乙酸酐（C4F6O3）。

5.13阿維菌素B1a（C48H72O14）：純度≥98%。

5.14阿維菌素B1b（C47H70O14）：純度≥90%。

5.15二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶劑。

用二氯甲烷（5.3）和乙酸乙酯（5.1）按3:1的體積比混合。

5.16衍生化試劑I：用N-甲基咪唑（5.11）和乙腈（5.4）按1:1的體積比混合，臨用現(xiàn)

配。

5.17衍生化試劑II：用三氟乙酸酐（5.12）和乙腈（5.4）按1:2的體積比混合，臨用現(xiàn)

配。

5.18阿維菌素B1a和阿維菌素B1b標(biāo)準(zhǔn)貯備液：ρ=1000mg/L。

準(zhǔn)確稱取1mg阿維菌素B1a（5.13）和1mg阿維菌素B1b（5.14），用乙腈（5.4）溶解定

容至1ml容量瓶，-18℃避光保存，保存期1a?？蓡为毰渲疲部膳涑苫旌蠘?biāo)準(zhǔn)貯備液或購

買市售阿維菌素B1a、阿維菌素B1b有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照產(chǎn)品說明書保存。

5.19阿維菌素B1a和阿維菌素B1b標(biāo)準(zhǔn)使用液：ρ=10.0mg/L。

準(zhǔn)確移取50μl阿維菌素B1a和阿維菌素B1b（5.18）標(biāo)準(zhǔn)貯備液至5ml容量瓶中，用乙

腈（5.4）稀釋定容至刻度，-18℃避光保存，保存期1a。

5.20凈化柱：500mg/6ml，填料為石墨化碳黑，或其他等效凈化柱。

5.21濾膜：孔徑0.45μm，聚四氟乙烯或其他等效材質(zhì)。

6儀器和設(shè)備

6.1采樣瓶：500ml具塞磨口棕色玻璃瓶。

6.2高效液相色譜儀：具熒光檢測器。

6.3色譜柱：填料粒徑為5μm，柱長15cm，內(nèi)徑4.6mm的C18反相色譜柱，或其他等效色譜

2

柱。

6.4濃縮裝置：氮吹濃縮儀或其他性能相當(dāng)?shù)臐饪s裝置。

6.5渦旋混合器。

6.6分液漏斗：250ml，玻璃材質(zhì)。

6.7離心管：尖底具塞玻璃離心管，5ml。

6.8一般實驗室常用儀器和設(shè)備。

7樣品

7.1樣品采集和保存

按照GB17378.3、HJ91.1、HJ91.2、HJ164和HJ442.3的相關(guān)規(guī)定采集和運(yùn)輸樣品。使

用采樣瓶（6.1）采集樣品，用鹽酸溶液（5.6）或氫氧化鈉溶液（5.8）調(diào)節(jié)pH值至5～9，于

4℃以下冷藏、避光保存，4d內(nèi)完成萃取。若衍生化反應(yīng)后不能及時分析，應(yīng)于-18℃冷凍

保存，3d內(nèi)完成分析。

每批次樣品應(yīng)至少采集1個全程序空白樣品，將1份實驗用水放入采樣瓶（6.1）中，帶

到采樣現(xiàn)場，與盛裝樣品的采樣瓶同時開蓋和密封，隨樣品一起保存運(yùn)回實驗室。

7.2試樣的制備

7.2.1萃取

搖勻水樣，量取100ml（視水樣實際情況，取樣量可適當(dāng)減少）于250ml分液漏斗

（6.6）中，加入6g氯化鈉（5.9），待氯化鈉溶解后，加入20ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶

劑（5.15），充分振搖，注意放氣，靜置分層。提取液經(jīng)無水硫酸鈉（5.10）脫水后收集于

濃縮管中，若提取液顏色較深或有多環(huán)芳烴存在，用濃縮裝置（6.4）將提取液濃縮至約2

ml，按7.2.2步驟凈化。

注：海水可不加氯化鈉。

7.2.2凈化

用6ml甲醇（5.2）活化凈化柱（5.20），再用6ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶劑（5.15）

沖洗，棄去有機(jī)相，待凈化柱（5.20）填料暴露于空氣前，將樣品提取液（7.2.1）轉(zhuǎn)移至凈

化柱（5.20）上，自然流出，收集流出液，用5ml二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶劑（5.15）淋洗

凈化柱，合并所有流出液待濃縮。

7.2.3濃縮

將7.2.1的提取液或7.2.2凈化收集的溶液用濃縮裝置（6.4）濃縮至1ml左右，轉(zhuǎn)移至離心

管（6.7）中，再用2ml二氯甲烷（5.3）蕩洗濃縮瓶，合并全部有機(jī)相至離心管（6.7）中，

60℃以下濃縮至干，待衍生化。

注：如濃縮管具塞，則提取液或凈化收集的溶液可直接濃縮至干后直接衍生，無需轉(zhuǎn)移至離心管。

7.2.4衍生化

3

向離心管（6.7）中加入100μl衍生化試劑I（5.16），于渦旋混合器（6.5）上渦旋30s，

再加入150μl衍生化試劑II（5.17），加蓋于渦旋混合器（6.5）上渦旋10s，靜置反應(yīng)20

min，加入750μl甲醇（5.2），渦旋混合10s，靜置30min以上，用濾膜（5.21）過濾，待

測。

7.3空白試樣的制備

用實驗用水代替樣品，按照與試樣制備（7.2）相同的步驟制備實驗室空白試樣。

8分析步驟

8.1儀器參考條件

流動相：甲醇（5.2）：水體積比9:1混合；柱溫：40℃；流速：1.0ml/min；熒光檢測

器：激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長475nm；進(jìn)樣體積：20μl，可根據(jù)儀器靈敏度調(diào)整。

8.2校準(zhǔn)曲線的建立

移取一定量的阿維菌素B1a和阿維菌素B1b標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.19），于離心管（6.7）中60℃以

下濃縮至干，按照7.2.4進(jìn)行衍生化，制備至少5個濃度點的標(biāo)準(zhǔn)系列，目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃

度分別為20.0μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L（此為參考濃度），按照儀器

參考條件（8.1），由低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，以目標(biāo)化合物濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積（或

峰高）為縱坐標(biāo)，建立校準(zhǔn)曲線。

8.3試樣的測定

將制備好的試樣（7.2），按照與繪制校準(zhǔn)曲線相同的條件（8.2）測定。當(dāng)試樣濃度超出

校準(zhǔn)曲線濃度范圍時，適當(dāng)稀釋后測定。

8.4空白試樣的測定

按照與試樣的測定（8.3）相同的步驟，測定空白試樣（7.3）。

9結(jié)果計算與表示

9.1目標(biāo)化合物的定性

根據(jù)樣品中目標(biāo)化合物與校準(zhǔn)系列中目標(biāo)化合物的保留時間定性。在本標(biāo)準(zhǔn)推薦的儀器

參考條件下，目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜圖見圖1。

4

1——阿維菌素B1b；2——阿維菌素B1a。

圖1阿維菌素B1a和阿維菌素B1b標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖（ρ=100μg/L）

9.2結(jié)果計算

根據(jù)目標(biāo)化合物的峰面積（或峰高），采用外標(biāo)法定量。

樣品中目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度，按照公式（1）計算。

V

11D（1）