腺病毒的幾種凍干技術(shù)-李戰(zhàn)

1.腺病毒（載體）應用

在基因治療和疫苗研究學領(lǐng)域，腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移的載體，被廣泛地使用。其中，重組腺病毒載體能夠誘導較強的細胞和體液免疫反應。較易生產(chǎn)，成本較低，對人致病性小且不誘導癌變，繁殖滴度高，裝載容量大，成為近年來病毒載體研究熱點。2.腺病毒（載體）在臨床應用的局限性通常保存于含10%甘油的緩沖液中，并于-80℃儲存。運輸以及臨床使用時須在干冰上進行。使用前需要大量稀釋以減輕甘油的毒性和肌肉注射時的疼痛感。對溫度也較為敏感，給運輸、保存帶來較大困難。迫切需要發(fā)展在冷藏條件下能使腺病毒穩(wěn)定的新的復合物一、腺病毒（載體）概述是指把藥品溶液在低溫下預先凍結(jié)成固體，然后在低溫、真空條件下使水蒸汽直接從固體中升華出來，除去自由水后再進行二次干燥，除去部分吸附于固體晶格間隙中的結(jié)合水的干燥方法。低溫下進行，避免藥物受熱分解，特別適用熱敏性的物質(zhì)低壓下干燥，基本隔絕了空氣，藥品不易氧化變質(zhì)，缺氧環(huán)境能抑制某些細菌的活性藥品可形成“骨架”，能較好地保存其原料的組織結(jié)構(gòu)和外觀形態(tài)復水性好，凍干藥品可迅速吸水還原成凍干前的狀態(tài)脫水徹底，適合長途運輸和長期保存二、冷凍干燥技術(shù)機械效應：溫應力、凍結(jié)應力、干燥應力溶質(zhì)效應電解質(zhì)濃度增加，pH值改變病毒結(jié)構(gòu)改變或核酸受損機械性能穩(wěn)定的凍干機合理的凍干曲線組方合理、效果優(yōu)秀的穩(wěn)定保護劑根據(jù)凍干后性狀、效價及安全性檢驗等不斷調(diào)整配方及凍干曲線，以達到理想的效果蔗糖明膠海藻糖無免疫原性，無毒性冷凍升華時不起泡，凍干后易溶解在凍干和保存過程中有保護作用有利于生物活性的保持與蛋白質(zhì)不發(fā)生化學反應，不影響凍干制品的檢測；首先應了解其結(jié)構(gòu)與特點，測定其共晶點溫度根據(jù)產(chǎn)品在預凍干過程中電阻變化率來確定采用熱分析法通過繪制冷卻曲線來確定根據(jù)共晶溫度判斷是否需要加入添加劑（包括賦形劑、穩(wěn)定劑等）判定何種物質(zhì)和加入量凍干后，進行外觀、水分等項目觀察與測定，逐漸修改處方和重復試驗，至指標相似或相同為止三、冷凍干燥的程序外觀活性測定水分測定樣品測共晶點加賦形劑加穩(wěn)定劑凍干樣品處方修改重復試驗凍干樣品留樣觀察穩(wěn)定性考察加速試驗確定工藝圖1.凍干工藝確定流程圖2.1預凍產(chǎn)品必須全部凍結(jié)后才能在真空下進行升華，否則真空干燥時會造成收縮、變形以及凍干制品表面硬化現(xiàn)象。產(chǎn)品在升華開始時必須要冷到共晶點以下的溫度，使凍干產(chǎn)品真正全部凍結(jié)。預凍成功的關(guān)鍵：共晶點測定準確合適的保護劑配方最佳預凍速度適宜的凍結(jié)時間2.2干燥階段升華干燥：合理控制升華速度，一般為較緩慢的升溫解析干燥：盡可能高的溫度盡可能低的真空度時間應根據(jù)樣品的熱穩(wěn)定性而定2.3封口保存真空壓塞充氣壓塞2.4復水凍干藥品可在室溫下避光長期保存。需要使用時，加蒸餾水或生理鹽水制成懸浮液使用。2.5凍干曲線在凍干過程中，把產(chǎn)品和板層的溫度、冷凝器溫度和真空度對照時間劃成曲線，叫做凍干曲線溫度為縱坐標，時間為橫坐標不同的產(chǎn)品，不同的凍干機應用不同的凍干曲線必需通過反復試驗來確定凍干曲線以保證產(chǎn)品質(zhì)量和縮短生產(chǎn)周期一、凍干重組人三突變型低氧誘導因子－1α腺病毒的制備來源：南方醫(yī)科大學2008級博士學位論文

作者：陶宇四、國內(nèi)外幾種腺病毒（載體）的凍干方法前期工作：1.將低氧誘導因子－1（hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1）聯(lián)合突變，成功構(gòu)建了重組人三突變型HIF-1α腺病毒（Ad-HIF-1α-564／402／803），獲得在常氧條件下可穩(wěn)定表達且生物活性高的HIF-1α。2.重組腺病毒的大量擴增、純化腺病毒以MOI≥5感染已長至70％匯合度的HEK293A細胞，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待大部分（＞90％）細胞出現(xiàn)病變效應——處理——收集病毒液。方法與步驟：1.試驗分組A組，10％海藻糖、0．5％明膠、3％山梨醇B組，10％蔗糖、0．5％明膠、3％山梨醇C組，5％海藻糖、5％蔗糖、0．5％明膠、3％山梨醇對照組（不加保護劑）

按照百分比要求，加入到磷酸鹽緩沖液（KPBS）中，用孔徑0．22μm濾膜過濾除菌。2.腺病毒分裝將重組人三突變型HIF-1α腺病毒原液按1∶1比例分別加入到上述含有冷凍干燥保護劑的溶液中混合，0．5mL／西林瓶，待凍干。3.凍干曲線應用德國Christ真空冷凍干燥機－40℃預凍3h－33℃抽真空干燥12h25℃抽真空干燥6h4.凍干重組人三突變型HIF-1α腺病毒的DNA提取和鑒定凍干復溶后，采用北京天為時代公司病毒基因組提取試劑盒提取病毒DNA，通過PCR和基因測序鑒定病毒。5.病毒滴度測定6.熱穩(wěn)定性試驗以A組保護劑制備的凍干產(chǎn)品進行37℃加速熱穩(wěn)定性試驗，定期檢測病毒滴度。對照組為液體腺病毒。

結(jié)果及分析：1.凍干腺病毒物理性狀

3組保護劑的凍干腺病毒外觀呈白色餅塊狀，殘余水分含量＜3％，溶解度合格，對照組略呈固縮狀。

方法：PCR及基因測序鑒定結(jié)果：

PCR檢測HIF-1α基因得到預期的380、460、214bp的目的片段。

b.測序后與GenBank的HIF-1αcDNA序列比對顯示：402位密碼子由CCA誘變?yōu)镚CA（下劃線處）；564位密碼子由CCC誘變?yōu)镚CC（下劃線處）；803位密碼子由AAT誘變?yōu)镚CT（下劃線處）。(與原始突變一致）結(jié)論：凍干腺病毒所攜帶的目的基因信息無丟失或變異3.凍干后腺病毒滴度比較

A組凍干保護劑制成的凍干腺病毒穩(wěn)定性較好。優(yōu)于B、C以及對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表1。用A組保護劑制成的凍干腺病毒37℃放置3周后，仍維持良好外觀，病毒滴度下降不明顯，對照組病毒滴度則顯著下降。兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表2。

結(jié)語：以10%海藻糖、0.5%明膠、3%山梨醇等成分配制的保護劑效果較好。本試驗結(jié)果表明，相比蔗糖，海藻糖顯示了更好的保護效果，明膠、山梨醇作為常用的賦形劑、填充劑協(xié)同海藻糖發(fā)揮了良好的保護作用。原因可能為：（1）海藻糖不具有還原性，穩(wěn)定性較好；（2）水合作用較強；（3）海藻糖比其他糖類不容易形成冰晶；（4）海藻糖具有良好的抗高溫潮濕作用；（5）海藻糖具有較高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，容易以玻璃態(tài)形式存在。二、HIV

重組腺病毒載體疫苗凍干制劑及其制備工藝的研究來源：吉林大學2006級博士學位論文

作者：張一折前期工作：1.將腺病毒載體疫苗Ad-gagpol的擴增hEK293細胞2.重組腺病毒的大量擴增、純化不連續(xù)CsCl密度梯度獲得液體重組腺病毒載體疫苗Ad-gagpol方法與步驟：1.試驗分組I組：0.3%人血白蛋白、2%海藻糖、1%甘露醇、2%右旋糖苷和2%蔗糖II組：0.3%人血白蛋白、2%海藻糖、3%甘露醇、2%右旋糖苷和2%蔗糖對照組（不加保護劑）

按照百分比要求，加入到磷酸鹽緩沖液（KPBS）中，用孔徑0．22μm濾膜過濾除菌。2.腺病毒分裝將液體腺病毒疫苗濃縮液按1：1比例，分別加入到上述含有冷凍干燥保護劑的溶液中混合，調(diào)整PH至7.4～7.6，無菌分裝到0.5ml/西林瓶后，開始進行真空冷凍干燥。3.凍干曲線將疫苗液于-35～-40℃預冷凍3～4h在擱板溫度-32℃，真空度10Pa下，干燥9h待制品完全成型后，使擱板溫度逐漸升至32℃真空度10Pa下再干燥3h4.殘余水分測定5.病毒滴度測定6.熱穩(wěn)定性試驗7.凍干重組腺病毒疫苗的抗原性研究感染293細胞，收毒樣品經(jīng)SDS電泳，轉(zhuǎn)膜8.小鼠免疫試驗

結(jié)果及分析：1.物理性狀外觀：37℃放置21d后，I組保護劑外形未見明顯變化，II組保護劑出現(xiàn)萎縮。且I組凍干制品37℃放置2個月后，仍能保持良好外觀而沒有萎縮現(xiàn)象。水溶性：兩組凍干苗用0.1ml蒸餾水溶解時，發(fā)現(xiàn)I組溶解迅速，II組溶解較慢。2.I組疫苗凍干前后感染性滴度的變化

I組保護劑制成的凍干苗穩(wěn)定性較好，凍干前后的滴度下降幅度小，僅為0.17Log。

3.I組凍干苗37℃加速熱穩(wěn)定性試驗無保護劑的液體疫苗對照組感染性滴度下降較快，37℃放置1周后下降近Log10TCID50/ml左右I組保護劑制成的凍干苗37℃放置3周后，滴度下降不超過Log10TCID50/ml

圖1.37℃時凍干和液體制劑的穩(wěn)定性對比曲線4.37℃時I組凍干制劑的感染性與放置時間的回歸分析凍干苗呈現(xiàn)下降的趨勢，但不如液體苗下降顯著（P<0.05）凍干苗的半衰期是11.07天，明顯優(yōu)于液體苗（1.03天）表1.37℃時Ad-gagpol凍干制劑的感染性與放置時間的回歸分析5.復溶后的凍干苗的熱穩(wěn)定性二種稀釋劑：蒸餾水（ddH2O）、生理鹽水(0.9%NaCl)復溶后，分別在37℃放置0h，24h，再進行毒價測定。表2.不同稀釋劑對凍干Ad-Gagpol疫苗復溶后的穩(wěn)定性的影響5.凍干重組Ad-Gagpol疫苗的抗原性用凍干和液體的重組Ad-Gagpol疫苗分別以10M.O.I感染同等量的人HEK293細胞?；虮磉_水平非常相近，即凍干疫苗沒有發(fā)生抗原性的改變。圖2.凍干和液體Ad-gagpol疫苗感染293細胞后的Westernblot分析Lane1：mockcellcontrol；

Lane2:lyophilizedAd-gagpolvaccine；Lane3:liquidAd-gagpolvaccine；

Lane4:proteinprestainedmarker6.凍干重組Ad-Gagpol疫苗誘導小鼠體液免疫的能力用凍干和液體的重組Ad-Gagpol疫苗分別同等量免疫小鼠兩組產(chǎn)生的抗體水平相近圖3.小鼠接種Ad-gagpol疫苗后的血清抗體的Westernblot檢測Lane1:PBSnegativecontrolmice；

Lane2:lyophilizedAd-gagpolvaccine；Lane3:liquidAd-gagpolvaccine；

Lane4:miceP24Abpositivecontrol7.凍干重組Ad-Gagpol疫苗誘導小鼠細胞免疫的能力以免疫后的小鼠脾細胞為靶細胞，加入Balb/C小鼠MHC-I類分子特異性的短肽（P7G）作為刺激劑，未加P7G作對照凍干疫苗組和液體疫苗組脾細胞分泌INF-γ的淋巴細胞的能力無明顯區(qū)別圖4.ELISPOT檢測細胞免疫水平圖A為ELISPOT實驗結(jié)果掃描，圖B為根據(jù)A圖（效應細胞為1X106）陽性細胞點數(shù)所作的柱形圖。1：lyophilizedAd-gagpolvaccine；2：liquidAd-gagpolvaccine；3：PBScontrol結(jié)語：表面吸附、反復凍融和自由基氧化被認為是腺病毒失活的主要途徑

人血白蛋白由于能抑制病毒聚集而使病毒穩(wěn)定。

糖、多元醇等通過影響水分子構(gòu)象而加強與蛋白質(zhì)的疏水相互作用以抵抗熱變性，使溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象得以穩(wěn)定。經(jīng)過多次試驗，篩選出以人血白蛋白、海藻糖、甘露醇、右旋糖苷和蔗糖等按比例、配伍而成的保護劑，對腺病毒載體疫苗顯示了較好的保護性。本組方已申請專利：【無權(quán)—視為撤回】

專利名稱：重組腺病毒的凍干制劑及其制備方法申請人：吉林大學發(fā)明人：孔維;張一折;姜春來;滕宏剛;呂帥然專利代理機構(gòu)：吉林長春新紀元專利代理有限責任公司專利摘要：本發(fā)明涉及一種重組腺病毒的凍干制劑及其制備方法，屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域。包括：重組腺病毒2×1012TCID50，人血白蛋白0.2～1克，海藻糖2～4克，甘露醇1～3克，右旋糖苷1～2克，蔗糖1～3克，磷酸鹽生理氯化鈉溶液，pH值為7.0～8.0，定容100毫升。本發(fā)明的重組腺病毒在凍干狀態(tài)下得到更好的保護，制劑安全性和穩(wěn)定性能好，費用低，容易進行生產(chǎn)和使用。克服了液體疫苗低溫凍結(jié)保存及運輸過程中嚴格冷鏈，有效期短的缺點，為采用重組腺病毒作為載體的基因治療的臨床實驗提供良好的應用前景。三、編碼人血管內(nèi)皮抑制素的重組腺病毒凍干制劑的配方和制備研究來源：IntJPharm.2012May10作者：上海交大藥學院網(wǎng)址：但是無法獲取全文···專利1：【有權(quán)】申請日期：2004.01.17公開(公告)日：2005.07.20

專利名稱：重組腺病毒凍干制劑及制備方法申請人：上海三維生物技術(shù)有限公司發(fā)明人：顧菁;童涌;梁旻專利代理機構(gòu)：上海新天專利代理有限公司五、其他專利專利摘要：本發(fā)明涉及重組腺病毒凍干制劑及制備方法。本發(fā)明公開的重組腺病毒凍干制劑是由體積比為重組腺病毒∶保護劑＝1∶(0.8-1.2)配制成的水溶液經(jīng)冷凍干燥后獲得的制劑，其中保護劑包含動物膠、糖、無機鹽及pH為7.2-8.0氨基酸培養(yǎng)平衡鹽。

本發(fā)明解決了現(xiàn)有重組腺病毒制劑的穩(wěn)定性問題，提供了一種安全、高效、穩(wěn)定性好、有效期長的冷凍干燥重組腺病毒制劑。專利2：【審中—公開】申請?zhí)枺?01110219379.1申請日期：2011-08-02公開日：2013-02-06

專利名稱：一種重組腺病毒制劑的制備方法申請人：天津澤世德生物醫(yī)藥有限公司發(fā)明人：沈麗麗專利摘要：本發(fā)明公開了一種重組腺病毒制劑的制備方法。涉及領(lǐng)域為凍干制劑及其制備方法。本發(fā)明的目的是提供一種重組腺病毒制劑。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種重組腺病毒制劑，包括重組腺病毒原液及冷凍干燥添加劑，所述冷凍干燥添加劑基本上由人血白蛋白和羥乙基淀粉組成。

生產(chǎn)上述重組腺病毒制劑的方法，包括以下步驟：(1)將病毒原液及冷凍干燥添加劑混勻，無菌過濾，分裝于西林瓶中；(2)將西林瓶放入冷凍干燥器內(nèi)，分別在5℃、0℃、-6℃各平衡1小時；(3)快速凍結(jié)，將制品溫度降至-30℃～-40℃維持3小時；(4)真空干燥；(5)加熱干燥，在制品溫度達到0℃～-35℃℃條件下持續(xù)3～5小時；(6)加塞，封口。注：以上三個專利雖然都已申請，但法