GB/T 18639-2023 狂犬病診斷技術(shù)（正式版）

狂犬病診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforrabies2023-11-27發(fā)布國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì) I 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4縮略語(yǔ) 5臨床診斷 26樣品采集、保存和運(yùn)輸 27直接免疫熒光檢測(cè)(DFA) 38直接快速免疫組化檢測(cè)(dRIT) 3 510實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè) 611實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)檢測(cè) 712細(xì)胞培養(yǎng)物病毒分離檢測(cè) 813小鼠腦內(nèi)接種病毒分離檢測(cè) 14綜合判定 附錄A(規(guī)范性)狂犬病診斷檢測(cè)的生物安全措施 附錄B(規(guī)范性)試劑配制 附錄C(資料性)狂犬病病毒陽(yáng)性和陰性腦組織制備 附錄D(資料性)狂犬病病毒實(shí)時(shí)熒光RT-RPA檢測(cè)及結(jié)果判定參照?qǐng)D I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替GB/T18639—2002《狂犬病診斷技術(shù)》,與GB/T18639—2002相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：——更改了本文件所列各項(xiàng)診斷方法的適用范圍(見(jiàn)第1章，2002年版的第1章);——增加了縮略語(yǔ)(見(jiàn)第4章);——增加了臨床診斷(見(jiàn)第5章);——?jiǎng)h除了“內(nèi)基氏小體檢查”(見(jiàn)2002年版的第2章);——增加了直接快速免疫組化檢測(cè)(見(jiàn)第8章)、巢式RT-PCR檢測(cè)(見(jiàn)第9章)、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)(見(jiàn)第10章)和實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)檢測(cè)(見(jiàn)第11章)4種檢測(cè)方法；——將檢測(cè)操作細(xì)化為細(xì)胞培養(yǎng)物病毒分離檢測(cè)和小鼠腦內(nèi)接種病毒分離檢測(cè)(見(jiàn)第12章、第13章，2002年版的第4章); 增加了綜合判定(見(jiàn)第14章);——增加了狂犬病診斷檢測(cè)的生物安全措施(見(jiàn)附錄A)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。本文件起草單位：軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2002年首次發(fā)布為GB/T18639—2002?！敬螢榈谝淮涡抻啞＂蜃鳛椴∷缆蕩缀?00%的病毒性傳染病，狂犬病的最終確診依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。自GB/T18639—2002首次頒布以來(lái)，狂犬病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)不斷發(fā)展?；谥苯用庖邿晒鈾z測(cè)(DFA)的抗原檢測(cè)方法被世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)確定為“金標(biāo)準(zhǔn)”;通過(guò)對(duì)病毒核酸進(jìn)行特異性擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)感染診斷的RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)得到廣泛應(yīng)用；檢測(cè)神經(jīng)組織內(nèi)病毒抗原的快速免疫組化檢測(cè)(dRIT)獲得WHO推薦；基于等溫?cái)U(kuò)增的重組酶-聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)也在近幾年獲得大量應(yīng)用。上述檢測(cè)方法與GB/T18639—2002規(guī)定的病毒分離技術(shù)共同成為當(dāng)前狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷的常用和可靠方法，并在WOAH《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》和WHO《狂犬病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》中列舉和推薦。同時(shí)，GB/T18639—2002第2章中基于組織病理學(xué)技術(shù)的內(nèi)基氏小體(negribodies)檢查，因敏感性不高逐漸被淘汰。我國(guó)衛(wèi)生疾控、動(dòng)物疫控、動(dòng)物檢疫和科研機(jī)構(gòu)同步開(kāi)展了上述狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究，目前已被廣泛應(yīng)用，相關(guān)設(shè)備和配套檢測(cè)試劑均有穩(wěn)定供應(yīng)?；谏鲜鲞M(jìn)展，參考WHO和WOAH推薦技術(shù)，結(jié)合我國(guó)實(shí)際情況和相關(guān)研究成果對(duì)GB/T18639—2002進(jìn)行修訂，旨在規(guī)范我國(guó)動(dòng)物狂犬病診斷和檢疫方法，提高檢測(cè)水平，以有效指導(dǎo)防控措施的實(shí)施，保證人畜健康和安全，并為我國(guó)逐步實(shí)現(xiàn)犬傳播的狂犬病消除發(fā)揮積極作用。本文件所列核酸擴(kuò)增引物和探針序列均為通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)狂犬病流行毒株序列的綜合分析設(shè)計(jì)獲得，并經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)驗(yàn)證，其檢測(cè)敏感度和特異性均不低于國(guó)際組織推薦的引物和探針序列。另外，狂犬病中和抗體檢測(cè)是動(dòng)物免疫效果評(píng)估的重要手段，通常不用于動(dòng)物狂犬病診斷，因此未列入本文件。1狂犬病診斷技術(shù)1范圍本文件描述了動(dòng)物狂犬病診斷的臨床診斷、樣品采集、保存和運(yùn)輸、直接免疫熒光檢測(cè)(DFA)、直接快速免疫組化檢測(cè)(dRIT)、巢式RT-PCR檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)物病毒分離檢測(cè)、小鼠腦內(nèi)接種病毒分離檢測(cè)和綜合判定的方法。本文件適用于動(dòng)物檢疫、疫病監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查時(shí)的狂犬病診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T34740—2017動(dòng)物狂犬病直接免疫熒光診斷方法3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。AEC:3-氨基-9-乙基咔唑(3-Amino-9-Ethylcarbazole)BHQ-dT:黑洞淬滅熒光標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸(Deoxythymidinenucleosidecarryingablack-DFA:直接免疫熒光檢測(cè)(Directimmunofluorescenceassay)DMEM:Dulbecco's改良eagle培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedeaglemedium)DMF:N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide)dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleosidetriphosphate)dRIT:直接快速免疫組化檢測(cè)(Directrapidimmunohistochemicaltest)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)FAM:羧基熒光素(Carboxyfluorescein)FAM-dT:羧基熒光素標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸(DeoxythymidinenucleosidederivatedwiththefluorophoreFAM)FITC:異硫腈酸熒光素(Fluoresceinisothiocyanate)HRP:辣根過(guò)氧化物酶(Horseradishperoxidase)2PBS:磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffersaline)PBST:磷酸鹽吐溫緩沖液(Phosphatetweenbuffersaline)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(Ribonucleicacid)RPA:重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinasepolymeraseamplification)RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction)TAE:Tris-乙酸-EDTA電泳緩沖液(Tris-aceticacid-EDTA)THF:四氫呋喃(Tetrahydrofuran)5臨床診斷處于狂犬病流行區(qū)、無(wú)狂犬病疫苗免疫史或雖經(jīng)免疫而未產(chǎn)生保護(hù)水平中和抗體的所有溫血?jiǎng)游锩芮械募倚髸r(shí)有散發(fā)或暴發(fā)。發(fā)病動(dòng)物多有明確的咬傷或抓傷史，但發(fā)病無(wú)明顯季節(jié)性。潛伏期平均6個(gè)月，短于10d或長(zhǎng)于1年者罕見(jiàn)?；疾?dòng)物主要表現(xiàn)為狂躁不安或精神沉郁；行為異常尤其具有攻擊性；唾液分泌過(guò)多；叫聲異常；異嗜等。病程一般2d～8d,不超過(guò)10d,最終死亡。具有5.1流行病學(xué)特點(diǎn)和5.2臨床癥狀，最終發(fā)病死亡的易感動(dòng)物，判定為疑似狂犬病，確診需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷應(yīng)采集包括腦干、小腦及海馬回在內(nèi)的新鮮腦組織樣本用于檢測(cè)。采集方法按照GB/T34740—2017中第7章規(guī)定的方法進(jìn)行。腐敗腦組織宜采用核酸擴(kuò)增檢測(cè)(見(jiàn)第9章～第11章)以保證檢測(cè)敏采樣人員應(yīng)按照附錄A要求采取必要的生物安全措施。將不同部位腦組織樣本分別放入無(wú)菌離心管中，編號(hào)標(biāo)識(shí)后保存待檢。不具備采樣條件時(shí)，可將整個(gè)尸體或動(dòng)物頭部送檢，由檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行腦組織采集。唾液樣本僅在動(dòng)物存活無(wú)法獲得腦組織樣本時(shí)采集，并多用于核酸擴(kuò)增檢測(cè)或病毒分離檢測(cè)(見(jiàn)第9章～第13章)。應(yīng)在妥善保定前提下收集動(dòng)物唾液樣本，采樣人員應(yīng)按照附錄A要求采取必要的生采樣量應(yīng)不少于0.5mL,條件具備時(shí)，應(yīng)采集多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的唾液混合后用于檢測(cè)，以提高檢出率。唾液樣本采集后加入等體積含雙抗(終濃度1000U/mL青霉素及1mg/mL鏈霉素)的PBS(按照附錄36.3樣品保存與運(yùn)輸待檢樣品在2℃~8℃保存應(yīng)不超過(guò)24h;在一20℃保存應(yīng)不超過(guò)6個(gè)月；長(zhǎng)期保存時(shí)，以-70℃以下為宜。樣品應(yīng)置于有干冰或冰塊的冷藏包裝中運(yùn)輸，保持全程冷鏈。樣品運(yùn)輸?shù)纳锇踩髴?yīng)符合國(guó)家規(guī)定及運(yùn)輸行業(yè)相關(guān)規(guī)定。7直接免疫熒光檢測(cè)(DFA)按照GB/T34740—2017中第8章和第9章描述的方法執(zhí)行。8直接快速免疫組化檢測(cè)(dRIT)8.1儀器和設(shè)備8.2材料和試劑8.2.1狂犬病病毒陽(yáng)性對(duì)照腦組織(見(jiàn)附錄C中C.1)。8.2.2狂犬病病毒陰性對(duì)照腦組織(見(jiàn)C.2)。8.2.510%福爾馬林溶液，按照B.2配制。8.2.6PBST,按照B.3配制。8.2.73%過(guò)氧化氫(H?O?)溶液，按照B.4配制。8.2.8生物素標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白單抗(商品化試劑),用前以PBS稀釋為工作濃度。8.2.9鏈霉親和素-HRP復(fù)合物(商品化試劑),用前以PBS稀釋為工作濃度。8.2.100.1mol/L醋酸鹽緩沖液，按照B.5配制。8.2.115mg/mLAEC-DMF溶液，按照B.6配制。8.2.12蘇木素染液，商品化蘇木素染液，加等體積水即得，可使用1周。8.2.13水溶性封片劑(商品化試劑)。8.3試驗(yàn)操作按如下順序編號(hào)、排列染片缸并盛裝相應(yīng)液體(除蘇木素可每周更換外，其余現(xiàn)用現(xiàn)配)。123456789福爾PBSTPBSTPBST蘇木素dII,OPBS馬林H,O?染液48.3.2組織觸片制備取待檢腦組織0.5g～2g(至少應(yīng)包含腦干及小腦組織),按照GB/T34740—2017中8.1的方法在載玻片上制備組織觸片；同時(shí)分別取狂犬病病毒陽(yáng)性和陰性對(duì)照腦組織，制備觸片各1張。以上觸片編號(hào)，室溫風(fēng)干5min,插入染片架。觸片在染片缸內(nèi)的染色和浸洗操作均在染片架上進(jìn)行。將所有觸片浸入10%福爾馬林溶液(第1缸)中，固定10min后，取出觸片，放入PBST溶液(第2缸)中浸洗5次(浸沒(méi)于液體內(nèi)停留3s～5s后完全提出即為浸洗1次，下同),以除去殘留的福爾馬林。8.3.4去除組織內(nèi)過(guò)氧化物酶全部觸片移入3%過(guò)氧化氫溶液(第3缸)中，作用10min,以除去內(nèi)源過(guò)氧化物酶。8.3.5生物素標(biāo)記抗體反應(yīng)在PBST溶液(第4缸)中浸洗觸片5次，移入下一個(gè)PBST缸(第5缸)中，浸洗3次后，甩去多余緩沖液，用吸水紙從載玻片邊緣將表面液體吸干。水平擺放觸片于濕盒內(nèi)，組織印跡處滴加生物素標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白單抗200μL,使充分覆蓋組織印跡，室溫反應(yīng)10min。8.3.6生物素-鏈霉親和素反應(yīng)棄去觸片上反應(yīng)液，以PBST(第5缸)浸洗觸片，甩掉多余的PBST,并從載玻片的邊緣將觸片表面吸干，水平擺放于濕盒內(nèi)。組織印跡上滴加鏈霉親和素-HRP復(fù)合物200μL,充分覆蓋組織印跡，室溫反應(yīng)10min,反應(yīng)期間進(jìn)行8.3.7。按觸片數(shù)量，每10片取0.1mol/L醋酸鹽緩沖液2mL,加入玻璃瓶(如青霉素瓶)內(nèi)，滴入5mg/mLAEC-DMF溶液250μL,混勻后加入3%過(guò)氧化氫80μL,混勻后于1h內(nèi)使用。8.3.8AEC染色反應(yīng)后觸片棄去表面液體，以PBST(第5缸)浸洗觸片后甩掉多余的PBST,并從載玻片的邊緣將其表面液體吸干，水平擺放于濕盒內(nèi)。組織印跡上滴加AEC染色液200μL,充分覆蓋組織印跡，室溫反應(yīng)10min,棄反應(yīng)液。觸片在蒸餾水(第6缸)中浸洗5次后，移入蘇木素染液(第7缸)內(nèi)復(fù)染2min。以蒸餾水(第8缸)浸洗觸片5次以去除染色劑，再次用蒸餾水(第9缸)浸洗5次漂凈。8.3.10返藍(lán)和封片將觸片移入PBS(第10缸)內(nèi)返藍(lán)，每次1張，停留5s～10s取出，甩凈多余液體，表面滴加水溶性封片劑1滴～2滴，加蓋玻片封片，讀片前置于陰暗處保存。光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，以20×物鏡掃描視野，然后用40×物鏡觀(guān)察。58.4結(jié)果判定8.4.1對(duì)照成立條件陽(yáng)性對(duì)照觸片應(yīng)在50%以上的顯微鏡視野內(nèi)觀(guān)察到不規(guī)則點(diǎn)狀或條索狀棕紅色斑塊，且數(shù)目眾多，狂犬病病毒抗原的棕紅色染色與藍(lán)色組織背景反差明顯；陰性對(duì)照觸片鏡下僅可見(jiàn)藍(lán)色著染的組織背景，不應(yīng)發(fā)現(xiàn)棕紅色深染斑塊。8.4.2待檢觸片判定在顯微鏡視野內(nèi)可觀(guān)察到不同大小和形狀的棕紅色斑塊者，即判定為狂犬病病毒抗原陽(yáng)性。9.1儀器和設(shè)備9.2材料和試劑9.2.1狂犬病病毒陽(yáng)性對(duì)照腦組織(見(jiàn)C.1)。9.2.2狂犬病病毒陰性對(duì)照腦組織(見(jiàn)C.2)。9.2.3特異性擴(kuò)增引物。9.2.3.1外套上游引物F1:5'-GTGTAACACCTCTACAATGG。9.2.3.2外套下游引物R1:5'-ACAGTCTCYTCNGCCATCT。9.2.3.3內(nèi)套上游引物F2:5'-CAAGATGTGYGCYAAYTGGAG。9.2.3.4內(nèi)套下游引物R2:5'-AGCCCTGGTTCGAACATTCT。9.2.4RNA提取試劑盒或試劑(商品化試劑)。9.2.5一步法RT-PCR試劑盒或相應(yīng)酶類(lèi)及緩沖液(商品化試劑),包括反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、dNTP、反應(yīng)緩沖液、無(wú)RNA酶水等。9.2.6PCR試劑盒或相應(yīng)酶類(lèi)及緩沖液(商品化試劑),包括DNA聚合酶、dNTP、反應(yīng)緩沖液、無(wú)RNA酶水等。9.2.7TAE電泳及制膠緩沖液，按照B.7配制。9.3試驗(yàn)操作分別從不同部位待檢腦組織(至少應(yīng)包含腦干及小腦組織)各取樣品約1g,樣品量少時(shí)可取全部組織。剪碎混勻，取其中約1g置組織勻漿器中，加入1mL生理鹽水進(jìn)行勻漿，以3000g離心2min后取100μL勻漿上清于1.5mL滅菌離心管中。狂犬病病毒陽(yáng)性和陰性對(duì)照腦組織各取100μL,分別置于1.5mL滅菌離心管中。唾液樣品直接取100μL置于1.5mL滅菌離心管中。使用RNA提取試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取待檢樣品和對(duì)照樣品總RNA。6用無(wú)RNA酶水將9.2.3的引物溶解或稀釋至濃度10μmol/L。使用一步法RT-PCR試劑盒，按說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增條件設(shè)置。50℃反轉(zhuǎn)錄30min;95℃預(yù)變性2min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸90s,30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。使用PCR試劑盒，以9.3.4.1的外套擴(kuò)增產(chǎn)物1μL為模板，按說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增條件設(shè)置。95℃預(yù)變性2min;95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸9.3.5擴(kuò)增產(chǎn)物電泳取9.3.4.2的內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物5μL～10μL加樣于含核酸染色劑的1.0%瓊脂糖凝膠孔中，另孔加5μLDNAMarker,以100V～120V電壓于1×TAE電泳緩沖液中電泳約20min,于凝膠成像儀內(nèi)觀(guān)9.4.1狂犬病病毒陽(yáng)性對(duì)照樣品出現(xiàn)255bp擴(kuò)增條帶、陰性對(duì)照樣品無(wú)特異擴(kuò)增條帶時(shí)，檢測(cè)結(jié)果成立。9.4.2被檢樣品出現(xiàn)255bp擴(kuò)增條帶時(shí)判定為狂犬病病毒核酸陽(yáng)性，否則判定為陰性。9.5陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物核酸序列測(cè)定僅在需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析時(shí)進(jìn)行，可委托專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)機(jī)構(gòu)測(cè)序。取9.3.4.2獲得的內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物，以9.2.3.3引物F2或9.2.3.4引物R2對(duì)其進(jìn)行DNA序列測(cè)定，有助于進(jìn)一步確認(rèn)狂犬病病毒基因組序列，分析其傳播來(lái)源。10實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)A2型生物安全柜、小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、熒光定量PCR儀等。10.2材料和試劑10.2.1狂犬病病毒陽(yáng)性對(duì)照腦組織(見(jiàn)C.1)。10.2.2狂犬病病毒陰性對(duì)照腦組織(見(jiàn)C.2)。10.2.3特異性擴(kuò)增引物和探針。10.2.3.1上游引物F:5'-CCCTACAATGGATGCCGAC。710.2.4RNA提取試劑盒(商品化試劑)。10.2.5一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒或相應(yīng)酶類(lèi)及緩沖液(商品化試劑，包括反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合按照9.3.1進(jìn)行。使用RNA提取試劑盒(商品化試劑),按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取待檢樣品和對(duì)照樣品總RNA。用無(wú)RNA酶水將10.2.3引物和探針溶解或稀釋至濃度10μmol/L.使用一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒，按說(shuō)明書(shū)配制50μL反應(yīng)體系，加入經(jīng)10.3.3稀釋的上游引物F、下游引物R各1.5μL,探針P1μL,10.3.2提取的樣品總RNA5μL,混勻后瞬時(shí)離心，置熒光定量PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。45℃反轉(zhuǎn)錄20min;95℃預(yù)變性2min;95℃變性15s,56℃退火15s,72℃延伸20s,或95℃變性15s,60℃退火和延伸30s,40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。設(shè)定于延伸反應(yīng)末收集FAM熒光信號(hào)。10.4.1狂犬病病毒陽(yáng)性對(duì)照樣品Ct<33、陰性對(duì)照樣品無(wú)Ct或Ct>37時(shí)，檢測(cè)有效。10.4.2待檢樣品Ct≤33時(shí)，判定為狂犬病病毒核酸陽(yáng)性；無(wú)Ct或Ct>37時(shí)，判定為狂犬病病毒核酸陰性。10.4.3待檢樣品33<Ct≤37時(shí)，判為狂犬病病毒核酸疑似陽(yáng)性。對(duì)疑似陽(yáng)性樣品應(yīng)重新提取總RNA進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢配制10.3.4反應(yīng)體系時(shí)將無(wú)RNA酶水體積減少為9μL,10.3.4加入的總RNA增加至10μL。復(fù)檢后若Ct≤33,判定為狂犬病病毒核酸陽(yáng)性，否則判定為狂犬病病毒核酸陰性。11實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)檢測(cè)11.1儀器和設(shè)備A2型生物安全柜、小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、熒光定量PCR儀或等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀等。11.2材料和試劑11.2.1狂犬病病毒陽(yáng)性對(duì)照腦組織(見(jiàn)C.1)。11.2.2狂犬病病毒陰性對(duì)照腦組織(見(jiàn)C.2)。11.2.3特異性引物和探針。811.2.3.2引物RPA-R:5'-CTGGTCCAGTCYTCMGGRCATGTYGA(BHQ-dT)CCACGATAATC-*。其中*代表阻止引物延伸的基團(tuán)，可采用磷酸化或者C3spacer修飾實(shí)現(xiàn)。11.2.4RNA提取試劑盒(商品化試劑)。11.2.5反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)試劑盒(商品化試劑)。11.3試驗(yàn)操作按照9.3.1進(jìn)行。使用RNA提取試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取待檢樣品和對(duì)照樣品總RNA。用無(wú)RNA酶水先將11.2.3的引物和探針溶解或稀釋至濃度10μmol/L。11.3.4擴(kuò)增體系配制(此過(guò)程應(yīng)在冰上進(jìn)行)使用反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)試劑盒，按說(shuō)明書(shū)配制50μL反應(yīng)體系，加入經(jīng)11.3.3稀釋的引物RPA-F、RPA-R各2.1μL,探針RPA-P0.6μL,11.3.2提取的總RNA模板2μL,混勻后加入混合酶反應(yīng)管(試劑盒組分),最后加入280mmol/L醋酸鎂(試劑盒組分)2.5μL。同時(shí)設(shè)置狂犬病病毒陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品和反應(yīng)體系空白對(duì)照(不加模板RNA)。配制好的反應(yīng)體系應(yīng)立即上機(jī)擴(kuò)增。使用熒光定量PCR儀時(shí)，設(shè)置39℃擴(kuò)增30s,45個(gè)循環(huán)，于反應(yīng)全程收集FAM熒光信號(hào)；使用等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀時(shí)，39℃擴(kuò)增5min后，取出反應(yīng)管顛倒混勻，短時(shí)離心后再以39℃繼續(xù)擴(kuò)增17.5min,在17.5min反應(yīng)全程收集FAM熒光信號(hào)。11.4.1狂犬病病毒陰性對(duì)照樣品無(wú)熒光曲線(xiàn)或Ct>42,陽(yáng)性對(duì)照樣品Ct≤30,反應(yīng)體系空白對(duì)照無(wú)熒光曲線(xiàn)時(shí)判定檢測(cè)反應(yīng)成立(見(jiàn)附錄D)。11.4.2待測(cè)樣品Ct≤37時(shí)判定為狂犬病病毒核酸陽(yáng)性；無(wú)熒光曲線(xiàn)或Ct>42時(shí)判定為狂犬病病毒核酸陰性：37<Ct≤42時(shí)判定為狂犬病病毒核酸疑似陽(yáng)性，應(yīng)重復(fù)檢測(cè)。復(fù)檢結(jié)果為陽(yáng)性或疑似陽(yáng)性時(shí)，判定為狂犬病病毒核酸陽(yáng)性；復(fù)檢結(jié)果為陰性時(shí)判定為狂犬病病毒核酸陰性(見(jiàn)附錄D)。12細(xì)胞培養(yǎng)物病毒分離檢測(cè)12.1儀器和設(shè)備二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、A2型生物安全柜、倒置熒光顯微鏡、組織勻漿器等。12.2材料和試劑12.2.1DMEM培養(yǎng)基(商品化試劑)。912.2.2胎牛血清(商品化試劑)。12.2.3胰蛋白酶-EDTA(商品化試劑)。12.2.4含10000U/mL青霉素和10mg/mL鏈霉素的雙抗溶液(商品化試劑)。12.2.5FITC標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白單抗(商品化試劑)。12.2.6丙酮(商品化試劑)。12.2.7PBS,按照B.1配制。小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞系(N2a或MNA)。按9.3.1制備待檢腦組織勻漿1mL,加入2mL含雙抗(終濃度1000U/mL青霉素、1mg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基，于1.5mL滅菌離心管中10000g離心5min,取上清加入另一離心管備用；唾液樣品直接取1mL,加等體積含雙抗(終濃度1000U/mL青霉素、1mg/mL鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a或MNA)傳入2個(gè)～4個(gè)T25細(xì)胞瓶，培養(yǎng)過(guò)夜使其長(zhǎng)成單層，棄上清，每瓶接入12.4.1制備的樣品0.5mL～1.0mL,在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃,5%二氧化碳)吸附1h,加入含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基8mL～10mL,置恒溫培養(yǎng)箱(37℃,5%二氧化碳)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)不接種樣品的正常細(xì)胞對(duì)照2瓶，同時(shí)培養(yǎng)。每天觀(guān)察1次，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后按1:3傳代，連續(xù)傳代3次，傳代后細(xì)胞至少保留原接種瓶數(shù)繼續(xù)培養(yǎng)，其余用于感染鑒定。接種后各代細(xì)胞累計(jì)觀(guān)察至少15d,記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。12.5細(xì)胞培養(yǎng)物感染病毒檢測(cè)12.5.1直接免疫熒光檢測(cè)(首選)棄去細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，加3mL80%丙酮溶液室溫平放固定30min后，棄丙酮，以5mLPBS(按照B.1配制)沖洗2遍，每次3min;按第7章方法以工作濃度的FITC標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白單抗染色60min后于倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察并判定。刮取瓶?jī)?nèi)細(xì)胞，以第9章、第10章、第11章任一方法進(jìn)行狂犬病病毒核酸檢測(cè)。12.6.1對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)物為狂犬病病毒抗原或核酸陰性時(shí)本檢測(cè)成立。12.6.2待檢樣品接種的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)12.5檢測(cè)為狂犬病病毒抗原或核酸陽(yáng)性時(shí)，判定為待檢樣品含有活狂犬病病毒；否則，判定為待檢樣品內(nèi)不含有活狂犬病病毒。13小鼠腦內(nèi)接種病毒分離檢測(cè)A2型生物安全柜、小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)、小鼠飼養(yǎng)籠具及設(shè)備、倒置熒光顯微鏡、組織勻漿器、胰島素注射器等。13.2材料和試劑13.2.1DMEM培養(yǎng)基(商品化試劑)。13.2.2含10000U/mL青霉素和10mg/mL鏈霉素的雙抗溶液(商品化試劑)。13.2.3FITC標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白單抗(商品化試劑)。13.2.4丙酮(商品化試劑)。13.3.1小鼠腦內(nèi)接種與觀(guān)察按12.4.1制備的待檢腦組織勻漿上清或唾液除菌濾過(guò)液，吸入胰島素注射器。每份待檢樣品腦內(nèi)接種2日齡～5日齡小鼠(乳鼠)5只。左手固定小鼠頭部，用碘伏或酒精棉消毒顱頂部位。右手持注射器在小鼠雙眼連線(xiàn)后等邊三角形頂點(diǎn)旁開(kāi)約0.5cm處刺入顱腔，每只小鼠注射待檢樣品0.01mL~0.03mL。對(duì)照組小鼠2只，按同法同劑量腦內(nèi)注射DMEM培養(yǎng)基。與母鼠同窩正常飼養(yǎng)，每天早晚各觀(guān)察1次，記錄是否有發(fā)病小鼠。至少觀(guān)察28d。腦內(nèi)注射5d以后死亡的小鼠應(yīng)取腦組織進(jìn)行狂犬病病毒檢測(cè)。13.3.2死亡小鼠腦組織狂犬病病毒檢測(cè)以第7章(首選)、第8章～第11章任一檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。13.4.1對(duì)照組小鼠應(yīng)健活。13.4.2接種待檢樣品的小鼠如在接種5d以后發(fā)病，并呈現(xiàn)痙攣、麻痹或興奮等神經(jīng)癥狀并死亡，可初步判定為狂犬病病毒感染，應(yīng)取腦進(jìn)行狂犬病病毒檢測(cè)。13.4.3死亡小鼠腦組織檢測(cè)為狂犬病病毒抗原或核酸陽(yáng)性時(shí)，判定該待檢樣品含有活狂犬病病毒。13.4.4接種小鼠均健活，或死亡小鼠經(jīng)上述方法檢測(cè)均為陰性，判定待檢樣品內(nèi)不含有狂犬病活14綜合判定以第5章臨床診斷進(jìn)行判定。判定為疑似狂犬病的動(dòng)物，應(yīng)按本文件要求采集腦組織進(jìn)行病毒抗原、核酸檢測(cè)或病毒分離檢測(cè)。待檢組織中同時(shí)包含腦干和小腦，按照第7章～第11章檢測(cè)技術(shù)中的至少1種進(jìn)行檢測(cè)后，檢測(cè)結(jié)果均為陰性時(shí)，判定待檢動(dòng)物未發(fā)生狂犬病。待檢組織中不同時(shí)或不包含腦干和小腦，或待檢組織腐敗時(shí)，所得陰性檢測(cè)結(jié)果不能判定動(dòng)物未發(fā)生狂犬病。疑似狂犬病動(dòng)物，按照第7章～第13章任一檢測(cè)方法檢測(cè)，獲得陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，即判定為待檢動(dòng)物發(fā)生狂犬病。(規(guī)范性)狂犬病診斷檢測(cè)的生物安全措施A.1生物安全設(shè)施狂犬病病毒分離檢測(cè)(見(jiàn)第12章、第13章)應(yīng)在BSL-3或ABSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；其他診斷檢測(cè)(見(jiàn)第7章～第11章)可在BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行?？袢≡\斷檢測(cè)的操作者在上崗之前應(yīng)完成狂犬病暴露前免疫，此后每半年進(jìn)行1次血清狂犬病病毒中和抗體檢測(cè)，中和抗體效價(jià)應(yīng)維持在不低于1.0IU/mL水平。低于1.0IU/mL時(shí)，應(yīng)暫停狂犬病檢測(cè)工作，加強(qiáng)免疫1劑狂犬病疫苗，經(jīng)檢測(cè)達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)后返崗。A.3檢測(cè)者個(gè)人防護(hù)檢測(cè)操作時(shí)應(yīng)佩戴口罩、雙層手套，著長(zhǎng)袖工作服或隔離服。采樣時(shí)應(yīng)在此基礎(chǔ)上加戴護(hù)目鏡或面屏。滿(mǎn)足A.2時(shí)，檢測(cè)者操作時(shí)避免銳物刺傷和割傷。發(fā)生暴露性外傷后，應(yīng)立即停止試驗(yàn)，以肥皂水沖洗傷口不少于15mi