小動物活體成像操作說明手冊

小動物活體成像操作說明手冊第七部分操作7.1準備程序圖7.1麻醉準備程序在開始麻醉程序之前，做一些準備程序可以幫助實驗順利進行，請參看圖7.11)請把不用的出氣口用特制的黑色橡膠塞塞住。(PN10168)2)把錐形通氣口的位置對準。3)在麻醉程序開始前對照圖片確保出氣支管位置正確。4)確認氣體循環(huán)管沒有打結(jié)阻塞和松動。5)確認蒸發(fā)器內(nèi)有足夠的乙氟醚(Isoflurane)，如果需要注入請參看下一節(jié)。7.2蒸發(fā)器注入程序警告:不能在正在進行氧氣供應時向蒸發(fā)器內(nèi)灌注液體乙氟醚(Isoflurane)。注入前，關(guān)閉供應打開前面板上兩個閥門開關(guān)監(jiān)視流量計。當流量球在指示管中的底部保持不動時說明已無氣體流動，此時可以進行注入。警告:只有當蒸發(fā)器控制旋鈕處于關(guān)的位置才可以進行注入，在注入過程中不能打開任何氧氣供應。警告:只能使用乙氟醚(Isoflurane)不要使用其它麻醉氣體，使用其它麻醉劑可能會導致危險。警告:在處理剩余的麻醉劑時實驗室要具備良好的通風條件，建議遵照已公布的安全條例進行操作，當丟棄剩余的乙氟醚(Isoflurane)時使用蒸發(fā)器使用手冊上推薦的合適的化學容器。警告:使用時XGI,8麻醉系統(tǒng)要保持直立狀態(tài)。蒸發(fā)器注入步驟1)如圖7.2所示，確保氧氣供應被切斷，可以在源頭或減壓閥處關(guān)掉它。2)如圖7.3所示，確保蒸發(fā)器開關(guān)處于關(guān)的位置。3)打開兩個前面板的閥門開關(guān)釋放XGI,8的氧氣，如圖7.4所示可以看到閥門處于打開位置，流量計指示氧氣已放完后，關(guān)閉這兩個閥門開關(guān)。4)反時針旋轉(zhuǎn)卸掉蒸發(fā)器的螺絲帽(如圖7.5)。確認試劑是乙氟醚(Isoflurane)，緩慢的倒進灌入口，透過玻璃指示窗隨時觀察乙氟醚(Isoflurane)的水平線，注意不要超過最大允許線。如圖7.6所示。5)注意:如果蒸發(fā)器在灌注前是干的，水平線在開始會輕微下落因為內(nèi)部的棉芯會吸收一部分試劑。6)當乙氟醚(Isoflurane)達到玻璃指示窗上的最大標線時，表明蒸發(fā)器已灌注滿。此時應停止，不要過分灌注。順時針旋緊螺絲帽。為防止泄漏，請仔細檢查螺絲帽已旋緊。圖7.2氧氣閥圖7.3蒸發(fā)器置于OFF圖7.4氧氣壓力計，前面板開關(guān)ON圖7.5擰下蒸發(fā)器螺母圖7.6監(jiān)視最大刻度線7.3設(shè)備操作步驟一在開始程序前分別稱量兩個乙氟醚(Isoflurane)活性炭過濾器(如圖7.7)，在過濾罐上用不可擦除的標記記錄這些信息和日期。圖7.7圖7.8步驟1,稱量過濾器步驟2,打開排氣泵步驟二打開前面板上的排氣泵的電子開關(guān)(如圖7.8)確認流速超過每分鐘6公升(LPM)。步驟三打開高壓氧氣罐或其它供應源確保氧氣供應(如圖7.9)注意:推薦的氧氣壓力是每平方英寸55磅(或每平方英寸35,65磅之間的任意值，請根據(jù)需要選擇)。圖7.9圖7.10步驟3,打開氧氣供應打開成像暗箱的氣體開關(guān)步驟四打開IVIS系統(tǒng)成像暗箱的氣體開關(guān)(如圖7.10，在暗箱右側(cè))步驟五打開XGI-8前面板上的綠色氧氣開關(guān)。(如圖7.11)圖7.11圖7.12步驟5,打開XGI-8氧氣開關(guān)步驟6,把蒸發(fā)器旋鈕設(shè)置到0,步驟六把蒸發(fā)器旋鈕設(shè)置到0,(如圖7.12)步驟七打開前面板上標記著“IVISFlowon/off”的開關(guān)(麻醉氣體流向IVIS分支管，如圖7.13)使用流量計設(shè)置流速。注意:使用能使動物處于麻醉狀態(tài)的最低量麻醉即可，最初建議如需麻醉5只成年鼠使用0.25公升每分鐘的流量。圖7.13圖7.14步驟7,打開“IVISFlow”步驟8,打開流向感應箱的開關(guān)步驟八打開標記著“CHAMBEROn/off”的開關(guān)(麻醉氣體流向感應箱)，如圖7.14所示。設(shè)置感應箱流量計的流速為1.5公升每分鐘。步驟九確認“IVISMANIFOLD”的流速，可以根據(jù)需要進行調(diào)整。步驟十關(guān)上“IVISMANIFOLD”和“INDUCTIONCHAMBER”的開關(guān)。不要再調(diào)整流速計了。步驟十一合理設(shè)置蒸發(fā)器的百分比，典型值是百分之2.5(如圖7.15)，可以根據(jù)需要進行調(diào)整。圖7.15圖7.16步驟11,設(shè)置蒸發(fā)器的百分比步驟12,把動物放入感應箱步驟十二把動物放置在感應箱內(nèi)(如圖7.16)，關(guān)上并鎖緊箱子。步驟十三打開“INDUCTIONCHAMBER”開關(guān)，注意，第一次運行的時間是最長的因為要把感應箱和管子充滿試劑。步驟十四打開“IVISMANIFOLD”開關(guān)，等一段時間(通常是二分鐘到五分鐘之間)，麻醉氣體到達分支管的錐形鼻塞處，然后把動物從感應箱中拿出來。步驟十五在把動物從感應箱拿出之前要關(guān)掉“CHAMBEROn/off”開關(guān)。步驟十六快速的把動物拿出來放在錐形鼻塞處(如圖7.17)。如果先前沒把多余不用的分支管堵住，此時用特制的黑色橡膠塞塞住(型號是PN10168)。圖7.17圖7.18步驟16,將需要麻醉的動物放置好蒸發(fā)器置于OFF步驟十七為了減少麻醉劑的泄漏，在不移動動物時要把感應箱關(guān)緊。步驟十八當上述動物過程完成后，把蒸發(fā)器設(shè)置到關(guān)的位置(如圖7.18)。步驟十九打開“CHAMBEROn/off”開關(guān)，讓純氧流進感應箱5分鐘。步驟二十直到感應箱充滿氧氣后，關(guān)掉“CHAMBEROn/off”開關(guān)。步驟二十一把氧氣罐關(guān)上，切斷氧氣供應。步驟二十二打開所有的開關(guān)讓設(shè)備減壓。當IVISMANIFOLD流量計和感應箱流量計的指示球下降到指示管的底部說明XGI,8減壓完畢。步驟二十三關(guān)上XGI,8的氧氣開關(guān)(如圖7.19)。圖7.19步驟23,關(guān)閉氧氣開關(guān)步驟二十四當流量計停止不動時關(guān)掉所有的開關(guān)，關(guān)上排氣泵。如果需要，準備好以備下次使用。第八章故障處理8.1氣體泄漏1)在任何時候檢測到XGI,8麻醉系統(tǒng)發(fā)生泄漏，使用者應當立刻關(guān)閉氧氣供應。聯(lián)系龍脈得的技術(shù)部獲取幫助。2)使用者可以自己維護系統(tǒng)的其它外部泄漏，如管子和連接處。但是需要使用一個合適的泄漏檢測裝置例如SNOOP來隔絕泄漏源。3)如果遇到氣體減少的情況，但沒有檢測到泄漏，請檢測管子有沒有打結(jié)和阻塞。4)旋緊接口，替換裂的和損壞的管子。5)如果氣體減少懷疑有泄漏，隔絕系統(tǒng)的各部分以減少可能的泄漏，檢查經(jīng)常操作的部分如管子的連接處或連接到暗箱的管子有沒有打結(jié)。8.2動物感應箱的定時更換假設(shè)所有的氣體流動正常，沒有泄漏?？赡苷f明需要校準蒸發(fā)器或其它XGI-8服務(wù)。8.3更換XGI-8的保險絲在正常情況下，XGI-8不需要更換保險絲。如果泵看上去作用效果不顯著并且沒有聲音時，可能需要更換保險絲。如果需要經(jīng)常更換保險絲說明XGI,8工作不正常，請聯(lián)系龍脈得的技術(shù)部獲取幫助。1)確認電力供應穩(wěn)定，可以用以下方法檢查，在同一插座上使用另一個差不多相同功率的設(shè)備。如果工作正常說明電力供應正常。很有可能是XGI-8保險絲壞了。2)更換保險絲，如附錄C圖示。3)翹出保險絲屜，更換保險絲。4)裝上保險絲屜和電源接口。5)如果更換保險絲沒有解決問題，請聯(lián)系龍脈得的技術(shù)部獲取幫助。XenogenIVISLuminaII系統(tǒng)中文簡易操作手冊中文簡易操作手冊IVISLuminaII系統(tǒng)開機1.啟動計算機;2.開啟相機電源，開啟主機電源(為在imagingchamber后方)，如需熒光檢測開啟熒光光源電源;3.儀器開啟后，點選桌面上LivingImage圖標，啟動程序;4.啟動程序后，系統(tǒng)會要求點選個人ID進入。若為新使用者，請鍵入三的英文字母作為ID名稱;5.畫面出現(xiàn)controlpanel，按下“initializeIVISsystem”，啟動整套IVIS系統(tǒng);-106.待機器完成啟始動作后，controlpanel中的溫度狀態(tài)燈號為紅色，等候約5分鐘后溫度降低，燈號轉(zhuǎn)綠就可進行影像獲取工作，此外按下溫度燈號也可以觀測目前CCD的溫度及設(shè)定載臺溫度。IVISLuminaII系統(tǒng)關(guān)機一般不建議作關(guān)機動作，因為軟件會進行每天的背景值偵測作業(yè)，所以計算機及主機都不建議關(guān)閉。除非有長時間不會使用到機器，才建議作關(guān)機作業(yè)。1.關(guān)閉軟件:請點選主畫面中“Livingimage”中的“Exit”;2.依次關(guān)閉儀器電源(熒光光源電源，相機電源，主機電源);3.關(guān)閉計算機電源。Livingimage軟件操作1.將老鼠或樣品放入觀察箱中關(guān)上門后，調(diào)整controlpanel中的參數(shù)設(shè)定。2.模式選擇:依照樣品種類選擇“l(fā)uminenscence”或者“fluorescence”。3.ExposureTime:單位有sec及min可選擇。可利用鼠標或是數(shù)字鍵更改數(shù)字。4.Binning:依所需影像畫質(zhì)選擇，Binning數(shù)值越高，靈敏度越高但分辨率越低。6.f/stop光圈:光圈大小，1>2>4>8，光圈越大，采集光信號越多。7.Fieldofview:視野大小選擇，共有ABCD四種高度選擇。選擇后，系統(tǒng)會自動調(diào)整載臺高度。9(調(diào)整好參數(shù)，按下“acquire”獲取圖片。10.如果進行熒光成像，選擇相應的激發(fā)波長和發(fā)射波長。11(影像獲取后，需進行影像分析。先選擇ROI的形狀:有四種ROI可供選擇:Circle,square,contour,grid(Countour為計算機自動圈選，Grid格狀適用于microtiterplate)。12(按下“Create”鍵，就會在影像上出現(xiàn)ROI圈選區(qū)，可利用鼠標調(diào)整ROI的大小及位置。13(按下“measurement”鍵，就會獲得ROI區(qū)域的定量數(shù)值。14.當您完成影像獲取后，需儲存檔案，點擊“SaveLivingImageData”。15(選擇“AllLivingImageDataFiles”，此為rawdata，會儲存未經(jīng)任何修改的檔案模式，方便后續(xù)定量分析作業(yè)。16(若要讀取之前的影像，點擊“BrowseLIData”，之后選擇欲讀取的檔案路徑，利用鼠標雙重敲擊該檔案，即可讀取。序列的設(shè)置和采集:注:本指南通過手動輸入的光譜分離的步驟。LivingImage4.0軟件版本包括一個autoexposure自動曝光設(shè)置和ImagingWizard成像向?qū)АＳ嘘P(guān)如何使用這兩個功能，請參閱各自的快速參考指南。您還可以在theSpectralUnmixingWizardSetupreferenceguide找到有關(guān)的信息。這些功能旨在盡可能方便用戶，我們強烈建議您利用這些優(yōu)勢時，執(zhí)行這些步驟。1。如果您沒有使用autoexposure自動曝光，首先用特定的激發(fā)和發(fā)射波長確定最佳成像時間。2。調(diào)整曝光時間避免成像飽和-低于60,000但是高于600counts。3。單擊SequenceSetup，在SequenceEditor中輸入序列。建議的順序應包括特異激發(fā)熒光和背景的序列。舉例說明，AlexaFluor680PeakEx.679nm/Em.702nm?特定的激發(fā)/發(fā)射:Excitation675nm/Emission720-780nm(請記住，激發(fā)波長和第一個發(fā)射波長要有40-50nm的距離。)?背景:Excitation605nm/Emission660-780nm(我們選擇在AlexaFluor達到峰值之前605nm激發(fā)背景。這樣光譜分離算法能更特異的識別到兩個獨立的來源，更有效分離。)注:在上面的例子中，我們用了一個發(fā)射掃描。這意味著我們要掃描發(fā)射光以辨別高峰。不過，我們也可以使用兩個發(fā)射濾光片和多個激發(fā)光來做激發(fā)掃描。注:要確保激發(fā)和發(fā)射光之間的帶隙足夠大，以便激發(fā)光不能通過發(fā)射光濾片到達CCD。至少要有45-50nm的分隔。這就是為什么我們不用675nm/Emission700nm的配對。4。在控制面板中，設(shè)置熒光成像的參數(shù)(exposuretime,binning,F/stop,excitationfilter,emissionfilter).注:LI4.0有自動曝光功能，請參閱自動曝光快速參考指南AutoexposureQuickReferenceGuide以供參考。建議您盡可能使用此功能。注:光譜分離可以用表面熒光和透射熒光兩種模式。用透射熒光和光譜分離時，先選用于成像的透射點。參見TransilluminationSequenceSetupQuickReferenceGuide設(shè)置透射光成像序列。5。點擊獲取序列AcquireSequence.光譜分離:1。打開圖像序列并把Units轉(zhuǎn)成RadiantEfficiency。2。在Analyze標簽中，選取要分析的圖像。記住要檢查每個圖像在600-60,000Counts。如果有飽和的圖片或低強度的圖片，請取消選擇不用于分析。3。按StartUnmixing。4?！癝electDataMask”窗口將會打開。選擇“Photograph”或“DrawMask”后，紫色代表要分析的區(qū)域。在照片模式下，使用threshold滑塊或向上/向下箭頭來調(diào)整紫色區(qū)域大小使之與要分析的對象匹配，注意不要包括圖像以外的任何區(qū)域。如果使用DrawMask，只需在分析對象上畫一個正方形或橢圓然后點擊下一步Next。形(如下圖所示)。5。輸入ImagingSubject，如果是老鼠或者電子小鼠，選中Autofluorescence。選擇FoodSignal如果動物沒有事先喂alfalfafreefood(不含苜蓿食物)。6。選擇要分離的探針數(shù)，可以通過選擇框右上方的綠色加號(+)來添加探針。從下拉框選擇的已知或是未知的探針。最多可以選擇三個探針用于光譜分離。7。在MatchProbeLabels復選框?qū)⒆詣訕松舷鄳墓庾V成分-探針。8。UseConstraints標簽會自動選擇光譜成分有助于光譜分離。注:建議使用constraints以協(xié)助重建。不過我們將在本參考指南的初步重建中不使用constraints以演示如何手動輸入。9。點擊完成Finish。10。該光譜分離結(jié)果將出現(xiàn)。每幅圖像自動標明，每個圖像的頂部中心有標簽。這里的例子，有自發(fā)熒光和AF680。復合圖像是自發(fā)熒光圖像疊加AF680圖像用不同的顏色來表示的。重要提示:綜合形象是純粹的定性的和無法定量。注:光譜圖有時很復雜。設(shè)置約束:有時，你可能無法有效地從熒光背景中分離開信號峰。這通常發(fā)生在特定的信號低，難以背景區(qū)分的情況下。通常是背景在特定的熒光點信號位置是缺失的。自發(fā)熒光應該是均勻分布的，在特定信號所在區(qū)也是存在的?？梢酝ㄟ^查看Spectratab來顯示結(jié)果-注意如何在下端(highpassend)光譜的熒光曲線變平。由于光譜分離算法沒有約束進行初步分析，有時可以應用某些限制來得到較好的分離效果。有兩種方法可以做到這一點，首先是給曲線算法加個初始猜測InitialGuess，并使用這個猜測適應現(xiàn)有數(shù)據(jù)。1。到圖像窗口的Spectra標簽。2。點擊綠色+并選擇特