胚胎冷凍技術(shù)

胚胎冷凍技術(shù)發(fā)展歷史胚胎冷凍保存的研究起始于20世紀(jì)50年代，當(dāng)時(shí)Smith用甘油坐防凍劑，保存兔胚胎獲得成功。1971年Whittingham用慢速冷凍方法獲得小鼠胚胎的成功保存。1978年willadsen建立了快速冷凍方法。1984年Takeda等采用一步冷凍方法首次冷凍小鼠胚胎獲得成功。1985年Rau和Fahy用高濃度的DMSO、乙酰胺、丙二醇和聚乙二醇分別組成玻璃化溶液，對(duì)8細(xì)胞期的小鼠胚胎進(jìn)行了一步冷凍實(shí)驗(yàn)，獲得87.5%的凍后發(fā)育率。此后。牛、綿羊、山羊、家兔和大鼠胚胎先后應(yīng)用玻璃化冷凍法獲得成功。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)。原理將胚胎和冷凍液裝入冷凍管中，經(jīng)過慢速（第2-3天的胚胎）和快速（第5-6天的囊胚）兩種降溫方式使胚胎能靜止下來并可在-196度的液氮中保存的一種方法。醫(yī)療應(yīng)用若有剩余的質(zhì)量較好的胚胎，可以冷凍保存，待以后自然周期或人工周期解凍后植入子宮腔內(nèi)，將增加受孕的機(jī)會(huì)?？捎糜谝粋€(gè)超排卵周期得到的胚胎數(shù)量多，質(zhì)量好，不能一次全部移植，可將多余的胚胎冷凍保存。以及發(fā)生嚴(yán)重卵巢過度刺激綜合征的患者，不宜在治療周期移植胚胎者，可將胚胎冷凍，待以后的自然周期或人工周期進(jìn)行胚胎復(fù)蘇移植。優(yōu)勢(shì)可以合理限制移植胚胎數(shù)，降低多胎妊娠率。為胚胎移植失敗或流產(chǎn)患者提供再次移植機(jī)會(huì),不必反復(fù)進(jìn)行女性超促排卵。在超排卵周期出現(xiàn)卵巢過度刺激綜合征跡象時(shí)，取消胚胎移植，將胚胎進(jìn)行冷凍保存，在其后非刺激周期進(jìn)行冷凍胚胎移植。方法1、常規(guī)緩慢冷凍

此方法需專用的冷凍儀,可獲得較高的移植妊娠率,是目前生產(chǎn)中廣泛采用并且最為成功的冷凍方法。冷凍液一般為1.4mol/L甘油+PBSS(含20%NCS的PBS)。2、一步冷凍法

利用高濃度的抗凍劑使胚胎在冷凍前脫水,從而減少冷凍過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。其特點(diǎn)是胚胎在室溫脫水后不需要特殊的降溫程序,能在很短得時(shí)間內(nèi)完成冷凍過程,具有重要的實(shí)用價(jià)值。3、玻璃化法(vitrification)

Rall和Fahy(1985)提出了玻璃化冷凍胚胎的方法,即可用幾種保護(hù)劑混合組成一種玻璃化(vitrificationsolution,VS),它在低溫時(shí)變的很粘稠,不發(fā)生結(jié)晶就可固化,形成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的玻璃樣固體,能保持液態(tài)時(shí)正常的分子和離子分布,因而用玻璃化液進(jìn)行胚胎冷凍前處理有較好的保護(hù)效果。

胞質(zhì)部分脫水后的玻璃化和胞外溶液的部分玻璃化是有效冷凍保存胚胎的重要因素。胚胎在這種玻璃樣固體中脫水到一定程度,可引起內(nèi)源性胞質(zhì)大分子(如蛋白質(zhì))

及已滲入白細(xì)胞內(nèi)的冷凍保護(hù)劑濃縮,從而使細(xì)胞在降溫過程中得到保護(hù)。

玻璃化冷凍具有許多冷存液沒有的優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)單、快捷、價(jià)格便宜、不需要特殊設(shè)備,避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成,更重要的是其粘滯性高,在6℃冷存后形成的玻璃樣結(jié)構(gòu),保持了分子、離子正常的擴(kuò)散與分配,細(xì)胞內(nèi)物冰晶形成,維持了正常的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),減少了對(duì)透明帶和基因的損害,提高了冷凍存活率和妊娠率。

應(yīng)充分重視高濃度玻璃化冷凍溶液對(duì)胚胎的毒性作用,合理選擇玻璃化冷凍溶液,嚴(yán)格控制胚胎和玻璃化冷凍溶液接觸的總時(shí)間。目前較簡(jiǎn)單的玻璃化溶液的組成是25%甘油、25%PROH或25%乙二醇。

玻璃化冷凍技術(shù)正處于實(shí)驗(yàn)研究到臨床應(yīng)用的過渡階段,隨著玻璃化冷凍方法的逐漸成熟,有望成為程序冷凍方法外的另一種選擇。臨床應(yīng)用超速玻璃化冷凍

是指使用微型工具,如Cryoloop、CPS、Cryotop和電鏡銅珊(EMG)等,通過極度縮小含胚胎玻璃化溶液的體積來實(shí)現(xiàn)“即時(shí)玻璃化”,使降溫速率由普通玻璃化的2000℃/min提高到20000℃/min以上,有效避免了細(xì)胞內(nèi)冰晶形成,并減輕了寒冷損傷,提高了冷凍效率。與傳統(tǒng)玻璃化冷凍方法比較

超速玻璃化冷凍一方面提高了降溫速率,另一方而縮短了胚胎與冷凍保護(hù)劑溶液的接觸時(shí)間,進(jìn)一步提高了冷凍效率。

在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域,Cryoloop超速玻璃化冷凍人囊胚獲得了較高的妊娠分娩率,結(jié)果比開放型拉細(xì)麥答(OPS)、普通麥管玻璃和CPS能更好的保存胚胎的形態(tài)和活力。

到目前為止,超低溫冷凍人的體外受精(IVF)胚胎,在國(guó)內(nèi)外均獲得成功。

2004年,意大利學(xué)者應(yīng)用ICSI對(duì)慢速冷凍卵母細(xì)胞與凍融睪丸精子受精后再次凍存多余胚胎,解凍胚胎移植后分娩一健康女嬰,為世界首例。

北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心應(yīng)用冷凍精液中精子、冷凍卵母細(xì)胞、冷凍胚胎即“三凍”技術(shù),成功獲得世界第2例、我國(guó)第1例“三凍”嬰兒。并在卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)方而,采用了與世界首例不同的簡(jiǎn)捷的玻璃化冷凍卵母細(xì)胞的方法。人類胚胎冷凍的應(yīng)用現(xiàn)狀

從冷凍技術(shù)第一次成功應(yīng)用于人類胚胎并獲妊娠至今,有關(guān)技術(shù)、方法不斷成熟。據(jù)報(bào)道,正常胚胎移植的妊娠失敗率可達(dá)到40%～60%,冷凍胚胎尤其是冷凍IVF人胚胎成功率就更低,一些研究結(jié)果認(rèn)為,8～16細(xì)胞的人胚胎冷凍效果較好,也有認(rèn)為,4細(xì)胞期胚胎冷凍后的成活率也不低。

從總體上講,凍胚移植的妊娠率比鮮胚低,影響人類胚胎冷凍保存結(jié)果的因素是多方面的,主要有胚胎的質(zhì)量(大小、滲透性等)和分裂(發(fā)育)階段、母體年齡及移植時(shí)機(jī)以及冷凍保護(hù)劑(滲透性、毒性等)和冷凍溶解程序等幾方面。

另外,從理論上講,冷凍胚胎可長(zhǎng)期保存,但對(duì)于保存過程中胚胎細(xì)胞是否發(fā)生老化的問題還缺乏直接的實(shí)踐證據(jù);對(duì)于冷凍效果鑒定,主要采用形態(tài)學(xué)方法鑒定凍胚質(zhì)量,對(duì)其移植后的發(fā)育潛力無法判斷。在多種冷凍方法中,現(xiàn)較多采用慢速冷凍、快速溶解方法,但是其他方法也有其自身優(yōu)點(diǎn)。因此,在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)綜合考慮多方面因素,根據(jù)具體的胚胎情況選擇恰當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

玻璃化冷凍方法簡(jiǎn)單、快速,防止了冰晶對(duì)胚胎造成的損傷,但由于玻璃化溶液的濃度極高且溶質(zhì)存在毒性,會(huì)使胚胎的成活率降低,所以當(dāng)今研究熱點(diǎn)集中在如何減少高濃度溶液對(duì)胚胎的毒害作用。主要有以下幾個(gè)方面：通過兩步平衡胚胎;縮短平衡時(shí)間;降低平衡溫度;使用蔗糖、海藻糖等抗毒性物質(zhì)。

目前使用的冷凍保護(hù)劑對(duì)胚胎尚有一定的毒性,選擇恰當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑也十分重要,人胚胎的保護(hù)劑為DMSO和丙二醇,蔗糖等非滲透性保護(hù)劑和滲透性保護(hù)劑聯(lián)合使用常取的較好的效果。1、胚胎冷凍技術(shù)如今已趨向簡(jiǎn)單化、實(shí)用化及產(chǎn)業(yè)化,特別是牛的胚胎冷凍技術(shù)已經(jīng)日臻成熟。但是,對(duì)人類胚胎的冷凍技術(shù)有待于進(jìn)一步提高,尤其是冷凍過程中細(xì)胞形態(tài)和代謝上的影響是制定冷凍保存的最大難題。展望2、胚胎冷凍技術(shù)為建立優(yōu)良品種的胚胎庫(kù)或基因庫(kù)提供了條件,同時(shí)也便于胚胎的運(yùn)輸和移植。胚胎冷凍保存的自身優(yōu)越性決定其有很大的發(fā)展?jié)摿?盡管其