生物技術在醫(yī)藥和農業(yè)領域的應用

“生命科學導論”系列講座（9）文化素質教育課程學習目的

將病原物（如細菌、立克次體、病毒等）及其代謝產物，經過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的，可以通過注射或黏膜途徑接種，并誘導機體產生針對特定致病原的特異抗體或細胞免疫，從而使機體獲得消滅該病原能力的生物制品統(tǒng)稱為疫苗。包括蛋白質、核酸、活載體或感染因子等。1.疫苗的定義眾所周知,利用疫苗主動預防傳染性疾病的最有效手段之一.疫苗對人類健康作出巨大貢獻.第三代疫苗：核酸疫苗（DNA疫苗、基因疫苗）。指將含有編碼病原體抗原基因序列的質粒載體，經肌肉注射或微彈轟擊等方法導入體內，通過宿主細胞表達系統(tǒng)表達抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。

特點：用含有病原體抗原基因序列的質粒載體直接作為疫苗，當引入機體后并不與宿主CS整合，而是通過宿主細胞的轉錄系統(tǒng)表達蛋白抗原，誘導宿主細胞產生特異性免疫應答。法國首先用基因工程方法在細菌和小鼠細胞中誘導產生乙肝病毒的蛋白質，并證明有免疫原性。后克隆乙肝表面抗原（HBsAg）基因，并獲得大量的表面抗原。1986年美國FDA首先批準Merck公司基因工程疫苗（酵母表達系統(tǒng)）上市。

第二代疫苗：基因工程疫苗。將病原體的抗原（某種蛋白質）基因克隆在細菌或真核細胞內，使病原體的主要抗原基因在細菌或真核細胞中表達，利用表達的蛋白質或多肽作為疫苗。特點：利用病原體的某些抗原成分作為疫苗。用于不能或難培養(yǎng)的、危險性大的病原物。制備成本低廉，易發(fā)展多價疫苗。核酸疫苗（DNA疫苗、基因疫苗）

1990年，Wolff首先報道了小鼠肌肉注射質粒DNA，質粒及其攜帶的基因可以被細胞攝取并表達。所謂核酸疫苗是將含有編碼蛋白質基因序列的質粒載體，經過肌肉注射或微彈轟擊等導入體內，通過宿主細胞表達系統(tǒng)表達抗原蛋白，誘導宿主對該抗原的免疫應答，達到預防和治療目的。這種疫苗兼有基因工程疫苗的安全性和減毒活疫苗激發(fā)機體強免疫反應的雙重性，且免疫效果持久、制備簡單、低廉等優(yōu)點。要求：早期、特異、快速、靈敏、操作簡便

ELISA原理：將酶與抗體（原）交聯(lián)形成酶-抗體(原)復合物（常用的酶有辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)或脲酶等）；另外將抗原（體）吸附在以聚苯乙稀制成的微孔滴定板上，使之固相化，免疫反應和酶促反應均在其中進行。利用抗原與抗體的特異結合以及酶將無色底物催化成有色底物，根據(jù)底物顏色的有無以及顏色的深淺判斷陰性或陽性反應以及反應強度。1.

免疫學診斷

底物酶標AbⅡ產物待檢樣本（特異AbⅠ）測定抗體的間接ELISA法測定抗原的雙抗體夾心法受檢樣品中的抗原已知病原物特異Ag用被檢抗原免疫動物獲得的AbI用抗原免疫另一動物獲得的特異AbI酶標AbⅡ基因工程抗原

一是體外培養(yǎng)病原體，再將病原體收集，經一系列處理后制成；二是對于不能進行體外培養(yǎng)的病原體，只能從受感染的動物或病人的組織分離收集病原體，再經一系列的處理后制成。

基因工程抗原：如疫苗生產一樣，將抗原基因克隆在細菌或真核細胞表達系統(tǒng)中，由這些表達系統(tǒng)生產大量的抗原。

間接ELISA法測定抗體必需首先制備大量的抗原，并將之包被于微孔板上。傳統(tǒng)的抗原制備方法一般有兩種：危險、質量難以控制，難以標準化。生產過程不必接觸病原體，也便于標準化生產，成本低廉。多克隆抗體與單克隆抗體主要缺點：■特異性較低：不同病原體間可能會有相似的抗原決定簇，假陽性率較高；■質量難于控制：被免疫的動物的個體差異，各批次的抗體間有差異；■成本高。

單克隆抗體○免疫淋巴細胞和骨髓瘤細胞的制備○兩種細胞的融合○從融合細胞中篩選出雜交瘤細胞○特異雜交瘤細胞的克隆化○特異雜交瘤細胞生產特異抗體（單克隆抗體）單克隆抗體雜交瘤單克隆抗體的應用范圍2.1基因診斷概述蛋白質是生命的體現(xiàn)者，DNA是遺傳的物質基礎，基因是DNA分子上的功能片段，是遺傳的基本單位。人類患各種疾病很大程度是由于執(zhí)行某一功能的蛋白質分子出現(xiàn)異常。而這種不同和異常取決于控制其合成的基因的不同和異常。傳統(tǒng)的疾病診斷是以疾病或病原物的表型為依據(jù)。如果能夠在基因水平直接檢測與某種疾病相關的基因序列，或病原物的特異性基因片段，則可以克服傳統(tǒng)診斷的不足，從根本上對疾病作出診斷。2.

基因診斷

病原物提取病原物DNADNA固定在硝酸纖維膜根據(jù)病原物特異DNA序列合成探針用熒光素標記探針根據(jù)是否檢測到熒光來判斷是否有探針所代表的病原物檢測病人分離標本基本思路：將已知序列的特定基因（微生物、遺傳病的特異基因片段）用同位素、熒光素等標記，制備成一種診斷試劑，即基因探針。由于其在適當條件下可與同源序列互補形成雜交體，因此使基因探針與待檢測組織細胞內的基因片段發(fā)生雜交反應，通過探針上的標記觀察探針是否與標本DNA結合，從而判斷標本是否有與探針一致的片段，再對是否有遺傳病或病原物感染作出診斷。診斷試劑2.3遺傳性疾病的診斷臨癥診斷：指遺傳病出現(xiàn)臨床癥狀后所作的診斷。癥狀前診斷：指臨床癥狀出現(xiàn)前所作的診斷。產前診斷：胎兒出生前所做的診斷(性別、單基因病、CS異常)。

目前大多數(shù)遺傳病無有效的治療方法，因此產前診斷對于降低遺傳病的發(fā)病率，提高人口素質具有重要的意義。例如，一種由基因點突變導致常染色體退化的遺傳病——鐮狀紅細胞貧血癥的檢測?！穹驄D之一有染色體畸變?！?5歲以上的高齡產婦?！穹驄D之一有開放性神經管畸形?！穹驄D之一有先天性代謝缺陷?！馲-連鎖遺傳病基因攜帶者孕婦。●有原因不明的習慣性流產的孕婦?！裱蛩^多的孕婦。●夫婦之一有致畸因素接觸史的孕婦。●有遺傳病家族史，又系近親結婚的孕婦。需要進行產前診斷的對象羊水和胎盤絨毛膜檢測3.

生物芯片與診斷

①從生物樣品（血液或活組織）中分離純化DNA或mRNA，并對其進行特異性擴增；②對待測樣品進行標記（通常用熒光素標記的dNTP為底物，通過PCR使之進入新合成的DNA片段中）；③標記好的DNA樣品與DNA芯片進行雜交，由于有大量DNA探針集成在芯片上，故可以一次檢測大量生物樣品；④雜交后漂洗去除未雜交的DNA分子；⑤攜帶熒光標記的樣品結合在特定位置上，在激光激發(fā)下會發(fā)熒光。用于微陣列芯片制作的點樣儀；封裝在卡盒中的微陣列芯片;用于微陣列芯片熒光標記檢測的激光共聚焦掃描器；微陣列芯片的局部放大；微陣列芯片上固定DNA探針的示意圖。圖中藍色的DNA鏈是預先固定在芯片表面的捕獲探針，紅色的DNA鏈是與捕獲探針互補的靶DNA分子。DNA芯片利用DNA雜交反應生物芯片每個點上有已知的DNA探針生物芯片在診斷上的應用生物治療是用生物來源的制劑或調節(jié)人體生物反應的制劑（如細胞因子、免疫活性細胞、干細胞、單克隆抗體和變應原蛋白等）治療疾病的方法。

◎用一些調節(jié)機體免疫反應的生物制劑，通過增強機體對腫瘤、病原物的抵抗力來治療疾?。ㄒ郧胺Q之為免疫治療）；

◎通過減輕機體對變應原的劇烈反應而治療一些過敏性疾??；

◎通過補充機體必需的一些不參與免疫反應的活性成分（如胰島素、凝血因子和基因等）1.生物治療概述2.1基因治療正常的人類基因可以克隆并引入遺傳病患者的體細胞，以替代、修復或糾正有缺陷的基因。通常使用一種反轉錄病毒作為基因治療的轉移系統(tǒng)，重組載體可以感染人的組織和細胞，但不自我復制。例：轉基因T淋巴細胞注射到人體骨髓組織中治療重癥綜合性免疫缺乏癥（SCID）。1991年，美國批準第一例對遺傳病進行體細胞基因治療方案。即將腺苷脫氨酶（ADA）基因導入4歲女患童體內。過程：先將人正常的ADA基因構建到反轉錄病毒載體上，然后用該載體轉染患兒的白細胞，并用IL-2刺激細胞增殖。10天左右，白細胞在體外大量擴增，再經靜脈輸入患兒體內。

干細胞(stemcell)一詞中的“干”譯自“stem”，意為“樹干”、“主干”，以示該類細胞在所有細胞中的地位。就像樹的主干能生長出無數(shù)形態(tài)各異的枝椏一樣，干細胞可以分化為很多形態(tài)和功能各異的細胞群。因此，干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的原始細胞，是形成人體各種組織、器官的祖先。

正常體細胞是高度分化的、具有獨特功能的細胞，這種細胞完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。為了補充死亡細胞，機體保留一部分干細胞。一旦需要，這些干細胞可按照一定途徑分裂、分化為具有一定功能的成熟細胞。如：人紅細胞平均壽命120天，新的紅細胞來源于造血干細胞，它能分化為紅細胞、白細胞、巨噬細胞等各類細胞。

全能干細胞：具有完整的分化潛能，能分化形成生物的個體。

多能干細胞：具有多種分化潛能，能分化成多種單能干細胞。

專能干細胞：只能向一種類型或密切相關的兩種類型的細胞分化的干細胞。如紅系造血干細胞、皮膚干細胞和神經干細胞等。2.1.1干細胞的分類按組織來源分：

按分化潛能來分：存在于造血組織中的一群具特定分化潛能的原始造血細胞,可分化為紅系,粒系,巨核系等造血祖細胞,并進一步分化產生紅細胞，粒細胞，單核細胞，淋巴細胞及血小板等所有血液細胞。

2.1.2干細胞的應用前景2.1.2.1造血干細胞

從兔子的眼角膜中分離出角膜緣干細胞和角膜基質細胞，經過體外培養(yǎng)、擴增，并與可降解生物材料復合，構建出有“活性”的眼角膜組織，然后移植修復兔角膜缺損，形成了結構完整的透明角膜組織。

從成年老鼠的骨髓中抽取干細胞，注射到患有色素性視網膜炎但尚未失明的新生老鼠的眼睛中。注射后，眼睛