生物醫(yī)學(xué)科研：研究方法

生物醫(yī)學(xué)科研

──基本知識(shí)和技能第三章

生物醫(yī)學(xué)研究方法現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)研究特點(diǎn)一是研究更為深入，利用現(xiàn)代生物學(xué)先進(jìn)技術(shù)，在核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子水平上闡述生命體的結(jié)構(gòu)和功能特征，并且利用基因技術(shù)使人們能夠設(shè)計(jì)和改變生物體特征?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)研究特點(diǎn)二是研究技術(shù)的綜合應(yīng)用，以往各學(xué)科單一的研究方法系統(tǒng)正在被跨學(xué)科多水平的實(shí)驗(yàn)體系所取代，高水準(zhǔn)的研究一般都在整體、離體組織、細(xì)胞、分子多種水平上證實(shí)一種論點(diǎn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)研究特點(diǎn)三是高新技術(shù)的采用，使得無(wú)損傷非侵入式研究越來(lái)越廣泛采用，不僅可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上得出與人更接近的結(jié)果，還能直接用于人體的研究。一、研究方法的類(lèi)型和選用原則（一）不同層次的研究方法1、分子水平2、細(xì)胞水平3、組織或器官水平4、整體水平5、人體研究一、研究方法的類(lèi)型和選用原則（二）不同學(xué)科的研究方法1、生理學(xué)方法2、生化學(xué)方法3、形態(tài)學(xué)方法4、免疫學(xué)方法5、藥理學(xué)方法一、研究方法的類(lèi)型和選用原則6、計(jì)算機(jī)技術(shù)（1）訊號(hào)分析（2）圖像分析（3）動(dòng)態(tài)測(cè)量和遙測(cè)（4）信息貯存、處理和共享bioinformatics一、研究方法的類(lèi)型和選用原則7、生物物理學(xué)方法生物物理學(xué)方法在生物分子理化特點(diǎn)闡明、大分子立體構(gòu)型測(cè)定、各種藥物分子設(shè)計(jì)等方面發(fā)揮了積極作用?，F(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)（structuralbiology）的興起。一、研究方法的類(lèi)型和選用原則（三）研究方法的選擇原則①功能的表現(xiàn)形式，如物理現(xiàn)象（電活動(dòng)、機(jī)械力等）、化學(xué)現(xiàn)象（物質(zhì)、能量改變及其調(diào)控方式）、形態(tài)學(xué)特點(diǎn)（宏觀和微觀的改變、空間定位等）、行為學(xué)改變（如學(xué)習(xí)記憶、自發(fā)活動(dòng)等）。②生物分子的定性、定量、定位，時(shí)間過(guò)程，與功能的聯(lián)系。根據(jù)這些考慮，來(lái)合理組織方法，從不同水平和不同側(cè)面闡明和解決一個(gè)問(wèn)題。③采用干預(yù)手段如基因的knock-in,knock-down,knock-out，或應(yīng)用各種工具藥、抗體等影響分子及功能。一、研究方法的類(lèi)型和選用原則1、能夠完成研究目標(biāo)無(wú)疑，選擇的研究方法應(yīng)當(dāng)能夠解決研究目標(biāo)中提出的問(wèn)題。例如，研究目標(biāo)是探索A因子對(duì)腦缺血的調(diào)節(jié)作用，選擇的方法就應(yīng)當(dāng)能夠檢測(cè)A因子量及活性的改變；還應(yīng)選擇不同的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?；這些方法要滿足各個(gè)具體實(shí)施階段和觀察指標(biāo)的要求。一、研究方法的類(lèi)型和選用原則2、能夠從幾個(gè)角度說(shuō)明一個(gè)問(wèn)題單一的方法往往不能揭示問(wèn)題的全貌，因而現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中常常需要幾種類(lèi)型方法的組合，從不同側(cè)面闡明問(wèn)題的特征。A.胚胎干細(xì)胞水平進(jìn)行分子操作誘導(dǎo)型CaMKII基因敲除分子功能的研究策略B.海馬腦片電生理試驗(yàn)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)C.學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)試驗(yàn)Morris水迷宮一、研究方法的類(lèi)型和選用原則3、根據(jù)現(xiàn)有條件研究者常常困擾于研究手段的不夠，解決的辦法可以是利用其他研究設(shè)施，也可以充分利用本單位現(xiàn)有研究設(shè)施和條件，顯然，后者更可行。在確定研究目標(biāo)時(shí)就應(yīng)當(dāng)充分考慮結(jié)合現(xiàn)有研究條件，盡可能充分利用本單位的特色和優(yōu)勢(shì)來(lái)設(shè)計(jì)研究方案。二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法1、功能可視化2、高通量篩選3、生物信息學(xué)二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法1、功能可視化細(xì)胞水平：

①Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Cl－等離子，cAMP、細(xì)胞內(nèi)pH、膜電位、鈣調(diào)蛋白、PKC等的變化②熒光蛋白基因標(biāo)記目的蛋白整體水平：化學(xué)發(fā)光、fMRI、PET等PhotographofthejellyfishAequorea

victoriawhichproducesthegreenfluorescentprotein

(GFP).(PhotographcourtesyofClaudiaMillsattheFridayHarborResearchLaboratories,WA,USA.)KainSRGreenfluorescentprotein(GFP):applicationsincell-basedassaysfordrugdiscovery.DrugDiscovToday1999;4(7):304-312.熒光信號(hào)檢測(cè)腫瘤或器官腫瘤不同器官磁共振（MRI）檢測(cè)腦病理變化及腫瘤分子變化（活體顯微鏡）正電子發(fā)射斷層掃描（PET）檢測(cè)分子變化功能磁共振（fMRI）檢測(cè)功能變化2、高通量篩選

（high-throughputscreening,HTS）以玻璃片、膜片或培養(yǎng)板為載體，用高密度、微量自動(dòng)化加樣的方法，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)分析大量樣本，這就是最近發(fā)展起來(lái)的高通量篩選方法。二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法DNA、蛋白等芯片技術(shù)一次可測(cè)定數(shù)千至上萬(wàn)個(gè)點(diǎn)。細(xì)胞水平高通量篩選方法通常一次可以測(cè)定384～1536個(gè)點(diǎn)，現(xiàn)在還有3456個(gè)點(diǎn)的超高通量篩選方法（ultra-high-throughputscreening,UHTS）。二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法Computer-generatedvisualizationoftheUHTSSconfiguration(AuroraBiosciences,SanDiego,CA,USA).Thesystemisdesignedtointegrateaworkingcompoundsolutionstore,96-or384-wellplatereplicatingsystem,componentsforautomateddistributionofcompoundsandassayreagentsintohighdensity3456-wellNanoWellassayplates(AuroraBiosciences),automatedincubatorsandahigh-performancefluorescenceplate-reader.TheHitProfilingRobotprovidesautomatedre-formattingofselectedcompoundsforre-testing.（1）高通量篩選的基本條件①基因/蛋白庫(kù)，篩選疾病基因或其表達(dá)的蛋白，需要有完備的基因或蛋白庫(kù)。②檢測(cè)指標(biāo)，需要將檢測(cè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為有簡(jiǎn)便、靈敏、穩(wěn)定的客觀檢測(cè)信號(hào)，如熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性核素等。③檢測(cè)儀器，制作快速檢測(cè)微量樣本的儀器，保證高通量篩選的信息能夠快速準(zhǔn)確地讀出。二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法④自動(dòng)化取樣和加樣機(jī)器人，一次加樣上千個(gè)微量樣本，人工無(wú)法完成，因此研制自動(dòng)化儀器同樣是必不可少的條件。⑤計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，針對(duì)短時(shí)間獲得的龐大的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，必須有相應(yīng)的計(jì)算機(jī)硬件和軟件的支持。⑥化合物庫(kù)，高通量篩選藥物還需要有數(shù)十萬(wàn)至上百萬(wàn)個(gè)化合物儲(chǔ)備。二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法高通量篩選涉及到醫(yī)學(xué)及其各個(gè)分支、分子生物學(xué)、化學(xué)、光學(xué)、自動(dòng)化儀器、計(jì)算機(jī)等眾多學(xué)科。二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法（2）用于高通量篩選的生物材料

一類(lèi)是cDNA、寡核苷酸、mRNA、抗體、酶、蛋白等生物大分子，將生物大分子以高密度微矩陣方式排列于玻璃板或膜片上，與生物樣本反應(yīng)，然后檢測(cè)觀察指標(biāo)的變化，常稱(chēng)為芯片（chip）技術(shù)。一類(lèi)是細(xì)胞。以細(xì)胞為材料的研究方法，采取預(yù)先制備目的基因或報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，然后觀察目的基因或報(bào)告基因表達(dá)變化。二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法（3）研究方法類(lèi)型預(yù)先將不同樣本（不同處理方式、不同處理時(shí)間、不同個(gè)體等）排列在載體上，然后與相同的探針?lè)磻?yīng)，檢測(cè)指標(biāo)變化。預(yù)先將不同探針排列在載體上，然后與相同的生物樣本反應(yīng)，檢測(cè)指標(biāo)變化。二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法DNA芯片（基因芯片）研究結(jié)果基因表達(dá)譜研究AD病人基因組功能異常紅色：表達(dá)增加藍(lán)色：表達(dá)減少蛋白芯片研究方法示意圖2D蛋白電泳示意圖2D蛋白電泳顯示蛋白表達(dá)譜及其結(jié)果解析需要指出的是，高通量技術(shù)的采用并不排除傳統(tǒng)研究方法，而是互相補(bǔ)充。高通量技術(shù)快速檢出相關(guān)的靶分子，再以精細(xì)的方法深入研究靶分子變化特點(diǎn)，或在整體或離體水平觀察其功能變化特點(diǎn)。在傳統(tǒng)研究方法中引入高通量技術(shù)，將大大促進(jìn)傳統(tǒng)技術(shù)的改進(jìn)和研究效率的提高。二、幾類(lèi)發(fā)展較快的研究方法3、生物信息學(xué)（Bioinformatics）“insilico”研究近年來(lái)提出一類(lèi)新的研究技術(shù)，即insilico研究技術(shù)，字面是解釋是“硅片上的研究”，即利用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)綜合分析方法進(jìn)行生物學(xué)研究。該技術(shù)指的是利用生物信息學(xué)技術(shù)將獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、分析和評(píng)定，獲取研究結(jié)論的研究技術(shù)，與invivo、invitro、insitu、exvivo等技術(shù)相平行。insi